一种防止和/或抑制小球藻培养体系中金藻污染的方法与流程

发明领域

本申请涉及微藻工业应用领域，具体而言，涉及一种防止和/或抑制小球藻(chlorellasp.)培养体系中金藻(poterioochromonassp.)污染的方法。

发明背景

小球藻被认为是一种理想的生物质原料，其生长快速，产量高，温室气体排放少，常用于生产保健品和生物燃料。然而生物污染如金藻污染对小球藻培养危害极大。金藻，更类似于原生动物，具有快速吞噬、捕食小球藻的能力。因此在小球藻的培养中，金藻常常导致培养失败。

目前，常用的控制藻类培养过程中生物污染的方法有过滤法、化学添加剂法、调节培养条件等。当污染生物的尺寸远大于目标培养物时，可用过滤法除去，比如轮虫或变形虫等。然而金藻在正常状态下细胞个体同小球藻接近，无法应用此法去除。向水体中添加化学试剂、药物、杀虫剂等，也可起到消除或控制生物污染的作用。然而，添加剂在抑制杀死生物污染物的同时也可能对目标藻类产生损害，大量添加剂在水体中的残留也可能带来新的生态环境问题。通过调节培养条件使其不利于其他生物的生长而目标藻类却可继续生长，可以达到抑制污染甚至是消除生物污染的目的。然而，该方法仅适用于可在极端环境下生存的目标藻类，比如螺旋藻可实现规模化连续培养的一个重要原因就是螺旋藻可在高盐、高ph值等极端环境生长，很大程度上避免了其他生物的污染。然而，金藻同小球藻生长环境相似，较难通过此种方法去除。

本领域仍需在小球藻培养期间有效防止和/或抑制培养体系中金藻污染的方法。

发明简述

本发明人令人惊奇地发现，使用超声波处理金藻能够有效致死和抑制其生长。本发明人还令人惊奇地发现，超声波处理对小球藻伤害很小，因 此可以通过使用超声波处理在小球藻培养期间防止和/或抑制培养体系中的金藻污染。

附图说明

图1.示出不同参数的批式超声处理对金藻致死率的影响。

图2.示出不同参数的连续式超声处理对金藻致死率的影响。

图3.示出超声处理对小球藻生长的影响。

发明详述

超声波本质上是一种频率大于20khz的声波，因其频率下限高于人的听力上限而得名。它的方向性好，穿透能力强，易于获得较集中的声能，在水中传播距离远，已在医疗和工农业上获得很多应用。

已有使用超声波抑藻的报道(cn104003465a；cn1422951a)，但此类应用集中在抑制水体中的蓝藻。蓝藻是原核生物，内部含有气囊结构。超声波主要通过破坏蓝藻内部气囊使得蓝藻不能上浮至水面进行光合作用而渐渐死亡。然而，金藻同蓝藻不同，其并无气囊结构。

本发明人令人惊奇地发现，使用超声波处理金藻(其不含气囊结构)，能够显著抑制金藻的生长。

因此，在第一方面，本发明提供了一种抑制流体中金藻生长的方法，所述方法包括在超声处理区域内用超声波处理所述流体。本发明所述金藻包括但不限于poterioochromonasmalhamensis。

在一些实施方式中，所述流体中的金藻处于生长停滞期。在另一些实施方式中，所述流体中的金藻处于对数生长期。现有技术抑制蓝藻主要针对停滞期的蓝藻，对处于对数生长期的蓝藻效果较差。本发明人令人惊奇地发现，使用超声波处理可以抑制对数生长期的金藻。

本发明的方法所使用的超声波的频率可以是20khz-2mhz。在一些具体实施方式中，所述超声波的频率例如是20khz。在另一些实施方式中，所述超声波的频率例如是1.7mhz。

本发明的方法中，所述超声波处理区域内的超声波的强度可以是0.1-1.2w/ml，例如0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1或1.2w/ml。超声波强度为超声波作用的实际声功率除以超声波作用的 体积。超声波作用的实际声功率(w)可以用热计量法(一定时间内测量所处理的液体温度的变化)测定。

在一些实施方式中，本发明的方法所施加的超声波的剂量是0.5j/ml-45j/ml，优选0.8j/ml-45j/ml，更优选1j/ml-45j/ml，更优选3j/ml-45j/ml，更优选5j/ml-45j/ml，更优选10j/ml-45j/ml，甚至更优选20j/ml-45j/ml。超声波的剂量为超声强度乘以超声处理时间。

在一些实施方式中，所述超声处理区域的体积是50ml-2l，优选200ml-500ml，更优选300ml-400ml。

在一些实施方式中，所述超声波处理是连续式超声波处理。如本文所用，“连续式超声波处理”是指使疑似含有或含有金藻的流体或小球藻培养物以特定流速连续通过超声波处理区域，从而接受特定强度、剂量的超声波处理。例如，在一些实施方式中，本发明的方法中所述超声波处理包括使所述流体以0.3l/min-80.0l/min，优选0.3l/min-50.0l/min，优选0.3l/min-15.0l/min，优选0.3l/min-10.0l/min，优选0.3l/min-5.0l/min，优选0.3l/min-4.0l/min，优选0.3l/min-2.0l/min，更优选0.3l/min-1.0l/min的流速通过所述超声处理区域。在一定的超声强度下，流速与所接受的超声剂量成反比。

如本文所用，“批式超声波处理”指的是使给定体积的疑似含有或含有金藻的流体或小球藻培养物保留在超声波处理区域一段给定的时间，从而接受给定强度、剂量的超声波处理。例如，在一些实施方式中，本发明的方法中所述超声波处理包括使所述流体保留在所述超声处理区域5秒-300秒，优选10秒-300秒，优选20秒-300秒，优选30秒-300秒，更优选60秒-300秒。

本发明人令人惊奇地发现，根据本发明的所述超声波处理对金藻的致死率可达10％-90％或以上，优选50％-90％或以上。对金藻的致死率随着超声波剂量的增加而增加(见图1a和图2a)。

在本发明的第二方面，本发明人令人惊奇地发现使用超声波进行处理可有效破损、致死金藻，而同时对小球藻伤害却很小，因此可以通过使用超声波处理在小球藻培养期间预防和/或抑制培养体系中的金藻污染。

因此，本发明提供了一种在小球藻培养期间预防和/或抑制培养体系中的金藻污染的方法，所述方法包括在超声波处理区域内用超声波处理疑似 含有或含有金藻的小球藻的培养物。本发明所述小球藻包括但不限于索罗金小球藻(chlorellasorokiniana)或若夫小球藻(chlorellazofingiensis)。本发明所述金藻包括但不限于poterioochromonasmalhamensis。

所使用的超声波的频率可以是20khz-2mhz。在一些具体实施方式中，所述超声波的频率例如是20khz。在另一些实施方式中，所述超声波的频率例如是1.7mhz。

在所述方法中，所述超声处理区域内的超声波的强度可以是0.1-1.2w/ml，例如0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1或1.2w/ml。

在一些实施方式中，所施加的超声波的剂量是0.5j/ml-45j/ml，优选0.8j/ml-45j/ml，更优选1j/ml-45j/ml，更优选3j/ml-45j/ml，更优选5j/ml-45j/ml，更优选10j/ml-45j/ml，甚至更优选20j/ml-45j/ml。

在一些实施方式中，所述超声处理区域的体积是50ml-2l，优选200ml-500ml，更优选300ml-400ml。

在一些实施方式中，所述超声波处理是连续式超声波处理。例如，在一些实施方式中，所述超声波处理包括使所述培养物以0.3l/min-80.0l/min，优选0.3l/min-50.0l/min，优选0.3l/min-15.0l/min，优选0.3l/min-10.0l/min，优选0.3l/min-5.0l/min，优选0.3l/min-4.0l/min，优选0.3l/min-2.0l/min，更优选0.3l/min-1.0l/min的流速通过所述超声处理区域。

在另一些实施方式中，所述超声波处理是批式超声波处理。例如，在一些实施方式中，本发明的方法中所述超声波处理包括使所述培养物保留在所述超声处理区域5秒-300秒，优选10秒-300秒，优选20秒-300秒，优选30秒-300秒，更优选60秒-300秒。

在一些实施方式中，对所述小球藻培养物进行一次所述超声处理。例如，可以在怀疑所述小球藻培养物中存在金藻污染时进行一次所述超声处理，从而防止金藻污染。或者，可以在确认所述小球藻培养物中存在金藻污染时进行一次所述超声处理，从而抑制或去除金藻污染。

在另一些实施方式中，可以对所述小球藻培养物进行多次所述超声处理。例如，可以在小球藻培养期间每天对小球藻培养物进行所述超声处理。本发明人发现，小球藻培养中金藻污染难以控制，经常在处理后3天左右 就会再次出现。因此，在小球藻培养期间进行多次超声波处理，例如，每3天进行一次，每两天进行一次，甚至每天进行一次超声波处理将有效抑制金藻污染。出乎意料地，本发明人发现即使每天以对金藻致死率大约为90％的超声波剂量进行处理，其对小球藻生长的影响也很少(如实施例3所示)。因此，超声波处理特别适合用于在小球藻培养期间抑制金藻污染。本发明人令人惊奇地发现，根据本发明的超声波处理对小球藻培养期间培养体系中的金藻污染物的致死率可达10％-90％或以上，优选50％-90％或以上。

在第三方面，本发明还提供了一种小球藻培养设备，一种小球藻培养设备，其具有超声处理区域，所述超声处理区域装配有超声波发生装置。所述超声波发生装置被配置为执行本发明的在小球藻培养期间预防和/或抑制培养体系中的金藻污染的方法。

本发明的小球藻培养设备可以是(但不限于)管排式光生物反应器或多螺线管光生物反应器。其中所述管排式光生物反应器例如可以是类似于cn104263635a所记载的那些。所述多螺线管光生物反应器例如可以是类似于cn104312919a所记载的那些。

在一些实施方式中，所述管排式光生物反应器或多螺线管光生物反应器设置有超声处理区域，例如，可以是超声仪的超声仓，所述超声仓与所述光生物反应器流体连通。所述超声仓的体积可以是50ml-2l，优选200ml-500ml，更优选300ml-400ml。所述超声仓内可设置有超声波探头，其以本发明所述频率和强度发射超声波。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

一般方法：

小球藻培养：

本实验所用小球藻为索罗金小球藻(chlorellasorokiniana)，来自国投微藻生物科技中心，以及若夫小球藻(chlorellazofingiensis)，来自美国亚利桑那州立大学藻类创新与技术实验室。小球藻生长快速，并可积累大量油脂，具有极高的产业化应用潜力。小球藻使用管排式光生物反应器在连续光照 强度165μmolm^-2s^-1，25℃下，bg11培养基中进行培养。小球藻培养过程中小球藻浓度一般在1x10⁶-1x10⁸个/ml之间。

超声波处理：

对于连续式超声处理，使用uip1000hd型号超声仪(hielschergmbh公司，频率20khz，功率1kw，超声仓体积57ml，探头型号bs2d34f)。或者使用vcx1500hv型号过程超声仪(sonics公司，频率20khz，功率1.5kw，超声仓体积400ml)。超声仪与管排式光生物反应器连接，振幅设置为20％-100％，流速设置为1-15l/min。

对于批式超声处理，使用hq-2008a6型超声仪(浩奇电器有限公司，频率1.7mhz，功率70w)，以0.14w/ml的超声强度(振幅100％)，处理300ml小球藻培养液5-300秒。

金藻污染检测和致死率计算：

小球藻培养期间的金藻污染并不限于特定的小球藻时期，在小球藻培养的任何时期都可能污染金藻。经鉴定，污染的金藻为poterioochromonasmalhamensis。此金藻是小球藻培养中最常见的生物污染物。

金藻数量使用血球计数板在光学显微镜下计数。金藻计数方法的检测下限为1x10⁴个/ml。一般检测到金藻存在时其已经进入对数生长期。金藻浓度达到或超过约1x10⁵个/ml，如果不对金藻数量进行有效控制，金藻就极易在短时间内大量爆发。

金藻致死率m＝(n1-n2)/n1，其中n1、n2分别为超声处理前后金藻的数量。对于连续式超声处理，n1、n2分别为超声处理仓入口处和出口处取样检测的金藻的数量。

实施例1批式超声处理

在小球藻(gtwz1)培养过程中发现金藻污染后(此时金藻浓度为达到或超过约1x10⁵个/ml)，使用频率1.7mhz，超声强度0.14w/ml，采用超声5s处理300ml被污染培养液，超声剂量达到0.7j/ml。金藻致死率为11.5％。

在小球藻培养过程中发现金藻污染后，使用频率1.7mhz，超声强度0.14w/ml，采用超声300s处理300ml被污染培养液，超声剂量达到42.3 j/ml。金藻致死率为91.8％。

不同超声时间以及相应的超声剂量对金藻致死率的影响见于图1。

实施例2连续式超声处理

在小球藻(gtwz1)培养过程中发现金藻污染后，使用频率20khz，超声强度0.9w/ml，采用超声以1l/min流速处理1l被污染培养液一次，超声剂量为21.57j/ml，金藻致死率为85％。

在小球藻培养过程中发现金藻污染后，使用频率20khz，超声强度1.19w/ml，采用超声以15l/min流速处理1l被污染培养液一次，超声剂量为1.43j/ml，金藻致死率为64.3％。

不同流速和强度的组合以及相应换算出的超声剂量对金藻致死率的影响总结于图2。

实施例3超声波处理对小球藻生长的影响

在小球藻(gtwz1)培养过程中采用连续式超声处理，使用频率20khz，超声强度0.9w/ml，采用超声以1l/min流速处理2l培养液，超声剂量为21.7j/ml，该剂量下对金藻致死率为84.9％。之后继续培养7天，每天监测单位培养体积中小球藻的干重。

在另一组平行实验中，小球藻培养7天，每天均进行如上相同剂量的超声处理，总超声剂量达151.9j/ml，每天监测单位培养体积中小球藻的干重。

对照组始终没有进行超声处理。

结果如图3所示，超声处理一次(21.7j/ml)后并没有影响小球藻的生长，即使每天超声一次，连续处理7天也只对小球藻生长产生了较小影响。

本研究还测试了另一种小球藻，若夫小球藻(chlorellazofingiensis)，其结果与索罗金小球藻没有显著区别。此外，具体的金藻致死率和处理时金藻的数量没有显著相关性。