瓜氨酸的制备方法与流程

本发明涉及瓜氨酸的制备方法，进一步详细而言，涉及使用乳酸菌等微生物的瓜氨酸的制备方法。另外，本发明涉及以高浓度含有瓜氨酸的组合物(例如，乳制品)的制造方法。进一步地，本发明涉及提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法和提高了菌体浓度的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法。

背景技术：

瓜氨酸为功能性氨基酸，在日本，允许作为医药品使用后，在2007年允许作为食品使用。另外，瓜氨酸在国外具有如下实践：从2007年以前作为食品摄取，例如，由于血流改善、动脉硬化预防、精力增强的功能而一直作为补充剂销售。进一步地，有报告称瓜氨酸除此以外还具有怕冷症改善、皮肤功能改善、疲劳减轻·恢复、肌肉生长、运动功能提高等功能。

另一方面，瓜氨酸作为食品原材料极其昂贵，进一步地，为了发挥其功能所需的摄取量为较大量(例如，数百mg)。因此，若要在食品等中以有效量混合瓜氨酸，则其昂贵成为问题。

瓜氨酸现状是主要通过发酵法来生产。例如，日本特开昭63－068091号公报(专利文献1)中公开了一种培养属于棒状杆菌属、短杆菌属的微生物，使l－瓜氨酸生成蓄积在培养液中的l－瓜氨酸的制造方法。另外，在日本特开平05－168486号公报(专利文献2)中记载了一种使属于片球菌属的乳酸菌感染噬菌体而溶菌，使得到的物质作用于l－精氨酸而生成l－瓜氨酸的l－瓜氨酸制造方法。另外，在日本特开平08－089269号公报(专利文献3)中公开了一种使利用水溶性有机溶剂干燥了的l－鸟氨酸生产能力缺乏菌体作用于l－精氨酸而生成l－瓜氨酸的l－瓜氨酸制造方法。在该公报中例示了属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、链球菌属的细菌。另外，在日本特开2010－088301号公报(专利文献4)中公开了一种基于弧菌属细菌的发酵法的l－瓜氨酸的制造方法。

然而，从瓜氨酸的生产效率和生产成本的观点考虑，这些现有技术仍有改善的余地，可以说仍然期望一种生产效率、成本效益高的瓜氨酸的制备方法。

在此，据本发明人等了解，虽然没有报告使用一种作为乳酸菌的乳酸乳球菌(l.lactis)由精氨酸生产瓜氨酸、鸟氨酸的情况，但报告了若干利用乳酸乳球菌代谢精氨酸的情况(非专利文献1、2、和3)。例如，在非专利文献1和2中，记载了利用乳酸乳球菌将全部精氨酸转换为鸟氨酸。另外，在非专利文献3中，记载了在利用乳酸乳球菌代谢精氨酸时，全部精氨酸被转换为鸟氨酸是已知的事实。而且，在日本特开2009－112205号公报(专利文献5)中，记载了在奶酪等的制造发酵过程中，产生l－鸟氨酸，制造含鸟氨酸的组合物。

进而，在有关精氨酸代谢的基因表达的研究中，报告了对于乳酸乳球菌，从精氨酸转换为瓜氨酸的酶的精氨酸脱亚胺酶(adi)和将瓜氨酸转换为鸟氨酸的酶的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)的基因邻接地进行编码、这2个基因利用同一启动子来控制其其表达(非专利文献4)。

另外，在有关精氨酸代谢的基因表达的研究中，报告了作为乳酸乳球菌以外的乳酸菌，粪肠球菌(enterococcusfaecalis)和植物乳杆菌(lactobacillusplanturum)的adi和otc的基因均邻接地进行编码、这2个基因利用同一启动子来控制其表达(非专利文献5和6)。

在这些研究中，使用实时pcr确认了adi和otc的基因表达被同时控制。然后，对于乳酸乳球菌，在各种培养条件下测定adi和otc的活性(非专利文献1)，报告了在其任一培养条件下，otc的活性均变得比adi高。

即，根据这些研究，表示在具有精氨酸代谢能力的微生物的情况下，通过adi，精氨酸被转换为瓜氨酸，但通过otc，瓜氨酸立即被转换为鸟氨酸，因此，瓜氨酸不会在培养液中蓄积。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭63－068091号公报

专利文献2：日本特开平05－168486号公报

专利文献3：日本特开平08－089269号公报

专利文献4：日本特开2010－088301号公报

专利文献5：日本特开2009－112205号公报

非专利文献

非专利文献1：crowv.l.,t.d.thomas.1982.argininemetabolisminlacticstreptococci.j.bacteriol.150:1024-1032.

非专利文献2：poolmanb.,a.j.m.driessen,w.n.konings.1987.regulationofarginine-ornithineexchangeandargininedeiminasepathwayinstreptococcuslactis.bacteriol.,169:5597-5604

非专利文献3：larsenr.,g.burist,o.p.kuipers,j.kok.2004.argrandahrcarerequiredforregulationofargininemetabolisminlactococcuslactis.j.bacteriol.186:1147-1157

非专利文献4：budin-verneuila.,e.maguin,y.auffray,d.s.ehrlich,v.pichereau.2006.geneticstructureandtrascriptionalanalysisoftheargininedeiminase(adi)clusterinlactococcuslactismg1363.can.j.microbiol.52:617-622

非专利文献5：barcelonab.,a.marina,v.rubio.2002.genestructure,organization,expression,andpotentialregulatorymechanismsofargininecatabolisminenterococcusfaecalis.j.bacteriol.184:6289-6300

非专利文献6：spanog.,g.chieppa,l.beneduce,s.massa,2004.expressionanalysisofputativearca,arcbandarccgenespartiallyclonedfromlactobacillusplantarumisolatedfromwine.j.appl.microbiol.96185-193

发明概述

发明要解决的课题

为了使用乳酸菌等微生物有效地将大部分精氨酸转换为瓜氨酸，认为有效的是抑制瓜氨酸被转换为鸟氨酸。但是，据本发明人等了解，迄今为止没有将大部分精氨酸有效地转换为瓜氨酸的方法的报告。

本发明人等如今得出如下见解：通过使用具有瓜氨酸产生能力的微生物在比通常(微生物培养的最佳温度)高的温度下对培养基进行培养，能够有效地使微生物生产瓜氨酸。另外，本发明人等得出如下见解：通过使用具有瓜氨酸产生能力的微生物在比通常(微生物发酵的最佳温度)高的温度下使原料(例如，原料乳等)发酵，能够制造以高浓度含有瓜氨酸的组合物(例如，发酵乳制品等饮食品)。

进而，本发明人等得出如下见解：通过将精氨酸添加到培养基、原料中进行培养、发酵，能够提高微生物的瓜氨酸产生能力。而且，本发明人等得出如下见解：通过控制培养基(培养液)的ph进行培养，能够提高微生物的浓度(个数)。本发明是基于这些见解而完成的。

因此，本发明的目的在于提供一种能够有效地生产瓜氨酸的瓜氨酸制备方法。另外，本发明的目的在于提供一种以高浓度含有瓜氨酸的含瓜氨酸组合物的制造方法。

进而，本发明的目的在于提供提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物的培养方法、发酵方法。而且，本发明的目的在于提供一种提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的浓度的培养方法。

用于解决课题的手段：

即，本发明涉及以下的实施方案(1)～(18)。

(1)一种瓜氨酸的制备方法，其特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物接种于培养基，在40℃以上且70℃以下的温度进行培养。

(2)根据(1)所述的瓜氨酸的制备方法，其中，具有瓜氨酸产生能力的微生物为乳酸菌、双歧杆菌或丙酸菌。

(3)根据(2)所述的瓜氨酸的制备方法，其中，乳酸菌为选自乳酸乳球菌、发酵乳杆菌和布氏乳杆菌中的1种或2种以上。

(4)根据(2)所述的瓜氨酸的制备方法，其中，乳酸菌为选自乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1种或2种以上。

(5)一种含瓜氨酸组合物的制造方法，其特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物添加(混合)到原料中，在40℃以上且70℃以下的温度进行发酵。

(6)根据(5)所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中，具有瓜氨酸产生能力的微生物为乳酸菌、双歧杆菌或丙酸菌。

(7)根据(6)所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中，乳酸菌为选自乳酸乳球菌、发酵乳杆菌和布氏乳杆菌中的1种或2种以上。

(8)根据(6)所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中，乳酸菌为选自乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1种或2种以上。

(9)根据(5)～(8)中任一项所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中，原料为原料乳。

(10)根据(5)～(9)中任一项所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中，含瓜氨酸组合物为饮食品。

(11)一种制备方法，是含有具瓜氨酸产生能力且提高了在40℃以上且70℃以下的培养温度下从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物的培养液的制备方法，其特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物在添加了精氨酸的培养基中进行培养。

(12)根据(11)所述的培养液的制备方法，其中，在培养之前将精氨酸添加到培养基中和/或在培养途中间断地添加精氨酸或者在培养途中连续地添加精氨酸。

(13)一种制备方法，是含有具瓜氨酸产生能力的微生物且提高了该微生物浓度的培养液的制备方法，其特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物在ph处于5以上且7以下范围的培养基中进行培养，提高所述微生物的浓度。

(14)根据(13)所述的培养液的制备方法，其中，通过添加碱来调节培养基的ph。

(15)一种制备方法，是含有具瓜氨酸产生能力、提高了在35℃以上且70℃以下的培养温度下从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物且提高了该微生物浓度(菌体浓度)的培养液的制备方法，其特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物在添加了精氨酸且处于ph为5以上且7以下范围的培养基中进行培养，提高所述微生物的浓度。

(16)根据(15)所述的培养液的制备方法，其中，在培养之前将精氨酸添加到培养基中和/或在培养途中间断地添加精氨酸或者在培养途中连续地添加精氨酸。

(17)一种提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的制备方法，所述微生物是将通过(11)～(16)中任一项所述的方法得到的培养液进行离心分离和/或膜分离而得到的微生物。

(18)根据(1)～(4)中任一项所述的瓜氨酸的制备方法，其中将通过(11)～(16)中任一项所述培养液的制备方法而得到的培养液或通过(17)所述微生物的制备方法而得到的微生物接种于培养基进行培养；或者(5)～(10)中任一项所述的含瓜氨酸组合物的制造方法，其中将通过(11)～(16)中任一项所述培养液的制备方法而得到的培养液或通过(17)所述微生物的制备方法而得到的微生物添加到原料中进行发酵。

发明效果

根据本发明的瓜氨酸的制备方法，能够有效地生产瓜氨酸。另外，根据本发明的含瓜氨酸组合物的制造方法，能够得到以高浓度含有瓜氨酸的乳制品等营养组合物。另外，根据本发明的微生物的培养方法、发酵方法，能够提高从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。而且，根据本发明的微生物的培养方法，能够提高微生物的浓度。进而，根据本发明的瓜氨酸的制备方法、含瓜氨酸组合物的制造方法，使用提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率和/或提高了微生物的浓度的具有瓜氨酸产生能力的微生物以及/或者该培养液，能够有效地生产瓜氨酸，还能够得到以高浓度含有瓜氨酸的乳制品等营养组合物。

附图说明

图1是表示使用氢氧化钠将培养基(培养液)的ph控制在5.5对乳酸乳球菌ols3797株进行培养时，乳酸乳球菌ols3797株的菌体浓度经时变化的图表。

图2是表示控制培养基(培养液)的ph对乳酸乳球菌ols3797株进行培养(ph控制培养)时的从培养开始10、11、12小时后的培养液和对乳酸乳球菌ols3797株进行静置培养时的培养液的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的比较的图表。

图3是表示在培养之前将精氨酸添加到mrs培养基中对乳酸乳球菌ols3797株进行培养时的ph的经时变化、菌体浓度的经时变化、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化的图表。

图4是表示在从培养开始10小时后将精氨酸间断地添加到mrs培养基中对乳酸乳球菌ols3797株进行培养时的ph的经时变化、菌体浓度的经时变化、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化的图表。

图5是表示在从培养开始4小时后将精氨酸连续地添加到mrs培养基中对乳酸乳球菌ols3797株进行培养时的ph的经时变化、菌体浓度的经时变化、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化的图表。

具体实施方式

瓜氨酸的制备方法

本发明的瓜氨酸的制备方法的特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物接种于培养基，在比通常(微生物培养的最佳温度)高的温度下进行培养。培养温度具体而言为40℃以上且48℃以下，优选为42℃以上且47℃以下，更优选为44℃以上且46℃以下。另外，根据本发明的其它实施方案，上述培养温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。

如上所述，本发明中的培养温度是比具有瓜氨酸产生能力的微生物的通常的培养温度(例如，最佳温度)高的温度。通过在这样的温度区域对微生物进行培养，能够有效地产生瓜氨酸。对于该理由，认为如下，但以下的说明(理论)仅是假设的，本发明并不受该理论的任何限定。即，认为如现有技术中记载所述，例如，具有精氨酸代谢能力的乳酸乳球菌具有将精氨酸转换为瓜氨酸的酶即精氨酸脱亚胺酶(adi)的基因和具有从瓜氨酸转换为鸟氨酸的酶即鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)的基因，这两者利用同一启动子来控制表达。此时，认为如本发明那样，在培养温度为高的温度时，增强通过adi从精氨酸向瓜氨酸的转换，抑制通过otc从瓜氨酸向鸟氨酸的转换，或者通过这两者的作用、现象，瓜氨酸在培养基(培养液)中蓄积。即，认为如本发明那样，在培养温度高时，精氨酸被有效地转换为瓜氨酸，因此，能够实现瓜氨酸的有效的制备方法。

本发明的培养时间只要从能够培养具有瓜氨酸产生能力的微生物的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选为2～48小时，更优选为3～36小时，进一步优选为4～24小时。

本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物只要产生瓜氨酸就没有特别限定，但优选在40℃以上且48℃以下、更优选42℃以上且47℃以下、进一步优选44℃以上且46℃以下的温度进行培养而有效地产生瓜氨酸。另外，根据本发明的其它实施方案，上述温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。而且，本发明中的具有瓜氨酸产生能力的微生物优选为具有瓜氨酸产生能力的乳酸菌、双歧杆菌或丙酸菌，更优选为具有瓜氨酸产生能力的乳酸菌或双歧杆菌，进一步优选为具有瓜氨酸产生能力的乳酸菌。

本发明的具有瓜氨酸产生能力的乳酸菌优选为选自乳酸乳球菌、发酵乳杆菌、布氏乳杆菌、粪肠球菌、酒球菌、戊糖片球菌、食淀粉乳杆菌、短乳杆菌和路氏乳杆菌中的1种或2种以上，更优选为选自乳酸乳球菌、发酵乳杆菌和布氏乳杆菌中的1种或2种以上，进一步优选为乳酸乳球菌。

本发明的具有瓜氨酸产生能力的乳酸乳球菌优选为选自乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种中的1种或2种以上，更优选为乳酸乳球菌乳酸亚种，进一步优选为选自乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1种或2种以上。另外，这些菌株如后所述，在保藏机构保藏。

本发明的具有瓜氨酸产生能力的乳酸乳球菌乳酸亚种如上所述是乳酸乳球菌乳酸亚种ols3789且在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心以保藏号：nitebp-1387(识别表示：乳酸乳球菌乳酸亚种ols3789、保藏日：2012年7月18日)保藏；乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797且在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心以保藏号：nitebp-1388(识别表示：乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797、保藏日：2012年7月18日)保藏；乳酸乳球菌乳酸亚种ols3818且在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心以保藏号：nitebp-1389(识别表示：乳酸乳球菌乳酸亚种ols3818、保藏日：2012年7月18日)保藏。

在此，乳酸乳球菌乳酸亚种ols3789具有如下所述的科学性质(形态上、培养基上的特征、生理学性质等)。

(a)形态上的性质

培养基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性状：圆形、白色、光滑型、扁平状

(b)生理学性质

菌形态：球菌；革兰氏染色：阳性；乳酸发酵形式：同型乳酸发酵；需氧发育：+

(c)其它表征该微生物的性质

16srdna序列如下所述。(ols3789)

gctggcgggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列号：1)

另外，乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797具有如下所述的科学性质(形态上、培养基上的特征、生理学性质等)。

(a)形态上的性质

培养基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性状：圆形、白色、光滑型、扁平状

(b)生理学性质

菌形态：球菌；革兰氏染色：阳性；乳酸发酵形式：同型乳酸发酵；需氧发育：+

(c)其它表征该微生物的性质

16srdna序列如下所述。(ols3797)

gaagctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列号：2)

进而，乳酸乳球菌乳酸亚种ols3818具有如下所述的科学性质(形态上、培养基上的特征、生理学性质等)。

(a)形态上的性质

培养基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性状：圆形、白色、光滑型、扁平状

(b)生理学性质

菌形态：球菌；革兰氏染色：阳性；乳酸发酵形式：同型乳酸发酵；需氧发育：+

(c)其它表征该微生物的性质

16srdna序列如下所述。(ols3818)

gcgaagctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列号：3)

本发明的培养基只要从能够培养具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养基中适当选择即可，没有特别限定，例如包含脱脂乳、脱脂浓缩乳、还原脱脂乳和它们的蛋白质分解物、乳清、乳清浓缩物、还原乳清和它们的蛋白质分解物、生乳、全脂乳(灭菌乳)、全脂浓缩乳、还原全脂乳等，优选包含脱脂乳、还原脱脂乳和它们的蛋白质分解物、乳清、还原乳清和它们的蛋白质分解物。

在本发明的瓜氨酸的制备方法中，瓜氨酸在培养基中产生。此时，可以将含有瓜氨酸的培养基作为饮食品的原料、原材料等、优选作为乳制品的原料、原材料等直接利用，也可以从该培养基中分离(离析等)瓜氨酸或者通过浓缩等处理进行加工后，制备期望纯度的瓜氨酸来利用。此时，饮食品可以举出功能性食品、营养食品等，乳制品可以举出例如乳饮料、发酵乳(更优选为酸奶)、乳酸菌饮料、奶酪、冰淇淋等。

含瓜氨酸组合物的制造方法

本发明的含瓜氨酸组合物的制造方法的特征在于，将具有瓜氨酸产生能力的微生物添加(混合)到原料中，在比通常(微生物发酵的最佳温度)高的温度下进行发酵。发酵温度具体而言为40℃以上且48℃以下，优选为42℃以上且47℃以下，更优选为44℃以上且46℃以下。另外，根据本发明的其它实施方案，上述发酵温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。

如上所述，本发明中的发酵温度是比具有瓜氨酸产生能力的微生物的通常的发酵温度(例如，最佳温度)高的温度。通过在这样的温度区域对微生物进行培养，能够有效地产生瓜氨酸。关于该理由，认为与本发明的瓜氨酸的制备方法中已经说明的理由相同。

另外，在本发明的瓜氨酸的制备方法中，可以不从含有氨酸的培养基中分离瓜氨酸而直接利用培养基作为含瓜氨酸组合物，或者也可以利用通过期望的操作(例如，离心分离、膜分离等)进行了处理的培养基作为含瓜氨酸组合物。

本发明的发酵时间只要从具有瓜氨酸产生能力的微生物能够发酵的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选为2～24小时，更优选为3～16小时，进一步优选为4～12小时。

本发明的原料只要从具有瓜氨酸产生能力的微生物能够发酵的原料中适当选择即可，没有特别限定，例如包含脱脂乳、脱脂浓缩乳、还原脱脂乳和它们的蛋白质分解物、乳清、乳清浓缩物、还原乳清和它们的蛋白质分解物、生乳、全脂乳(灭菌乳)、全脂浓缩乳、还原全脂乳等，优选包含脱脂乳、还原脱脂乳和它们的蛋白质分解物、乳清、还原乳清和它们的蛋白质分解物。

根据本发明的优选的一个实施方案，若使用原料乳作为原料，则得到乳原料或乳制品等作为含瓜氨酸组合物。该得到的乳原料或乳制品等(含瓜氨酸组合物)赋予有来自瓜氨酸的功能，提高了其营养价值。进而，本发明的乳原料或乳制品等不是从外部添加(混合)瓜氨酸，而是在其制造工序中能够提高瓜氨酸含量，因此，可以降低基于该乳原料或乳制品的最终制品的制造费用等。

根据本发明的其它优选的一个实施方案，若使用发酵乳混合物(更优选为酸奶混合物)作为原料，则得到发酵乳(更优选为酸奶)作为含瓜氨酸组合物。该得到的发酵乳(更优选为酸奶)赋予有来自瓜氨酸的功能，提高了其营养价值。进而，本发明的发酵乳(更优选为酸奶)不是从外部添加(混合)瓜氨酸，而是在其制造工序中能够提高瓜氨酸含量，因此，能够降低基于该发酵乳(更优选为酸奶)的最终制品的制造费用等。

在本发明的含瓜氨酸组合物的制造方法中，瓜氨酸在原料中产生。此时，可以将含有瓜氨酸的原料作为饮食品的原料、原材料等、优选作为乳制品的原料、原材料等直接利用，也可以从该原料中分离(离析等)瓜氨酸或者通过浓缩等处理进行加工后，制备期望纯度的瓜氨酸来利用。此时，饮食品可以举出功能性食品、营养食品等，乳制品可以举出例如乳饮料、发酵乳(更优选为酸奶)、乳酸菌饮料、奶酪、冰淇淋等。

含瓜氨酸饮食品

如上所述，含有通过本发明的瓜氨酸的制备方法得到的瓜氨酸的培养基或含有通过本发明的含瓜氨酸组合物的制造方法得到的瓜氨酸的原料或者它们的加工品通过在饮食品中选择使用任意的培养基、原料作为上述培养基、原料，能够分别制成饮食品本身或饮食品的原料或原材料。因此，根据本发明，能够提供将本发明的含有瓜氨酸的培养基或含有瓜氨酸的原料或者它们的加工品作为饮食品本身或者饮食品的原料或原材料利用的含瓜氨酸饮食品。

另外，能够将通过上述的本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法而得到的瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品添加到(混合)到饮食品(优选为乳制品，更优选为发酵乳)来对该饮食品赋予来自瓜氨酸的功能。因此，根据本发明，能够将本发明的瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品添加到饮食品中来提供含瓜氨酸饮食品。

根据本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法，对于瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品，能够降低其制备费用(加工费用)、制造费用等而有效地提供它们。因此，通过使用本发明的瓜氨酸或含瓜氨酸组合物，赋予来自瓜氨酸的功能等而提高商品价值，同时，对于含瓜氨酸饮食品，在其制造工序中能够提高瓜氨酸含量等，通过这些理由，能够降低其制造费用等而提供。

本发明的含瓜氨酸饮食品只要允许含有瓜氨酸即可，没有特别限定，例如可以举出：乳饮料、发酵乳(更优选为酸奶)、乳酸菌饮料、奶酪、冰淇淋等乳制品。

含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法

本发明的含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法的特征在于，将上述微生物在比通常(微生物发酵的最佳温度)高的培养温度下在添加了精氨酸的培养基中进行培养。上述培养温度具体而言为40℃以上且48℃以下，优选为42℃以上且47℃以下，更优选为44℃以上且46℃以下。另外，根据本发明的其它实施方案，上述培养温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。

根据本发明的优选的一个实施方案，能够提供一种上述微生物的瓜氨酸产生能力的提高方法，将本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物在40℃以上且48℃以下、优选42℃以上且47℃以下、更优选44℃以上且46℃以下的温度进行培养。另外，根据本发明的其它实施方案，在40℃以上且70℃以下进行上述培养，优选的培养的上限温度为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限温度为42℃，更优选的下限为43℃。此时，本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物可以使用通过对由本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法得到的培养物或组合物进行适当处理而得到的提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物。

如上所述，本发明的优选的一个实施方案的培养基是添加了精氨酸的培养基。通过以这样的培养基的组成(混合)对微生物进行培养，能够有效地产生瓜氨酸。关于该理由，认为如下，但以下的说明(理论)仅是假设的，本发明并不受该理论任何限定。即，如现有技术中记载所述，例如，在上述的非专利文献1和2中报告了关于乳酸乳球菌的精氨酸的代谢活性，若将精氨酸添加到培养基中，则编码adi和oct的基因的转录量增大。根据该见解，可以预测通过向培养基添加精氨酸，编码adi的基因的转录量增大，认为在40℃以上且70℃、某种情况下为48℃以下这样的培养温度高的温度时也能够维持该现象。需要说明的是，通过将精氨酸添加到培养基中，编码adi的基因的转录量增大、在40℃以上且70℃以下、某种情况下为48℃以下这样的培养温度高的温度时也能够维持该现象或者抑制编码oct的基因的转录量难以直接预测。因此，根据非专利文献1和2判断本发明显而易见是不恰当的。

根据本发明的优选的一个实施方案，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，在培养之前将精氨酸添加到培养基中和/或在培养途中间断地将精氨酸添加到培养基中或者在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。由此，能够提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的瓜氨酸产生能力。此时，具有瓜氨酸产生能力的微生物优选与充分浓度的精氨酸接触的时间长。因此，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，优选在培养之前将精氨酸添加(混合)到培养基中，更优选在培养之前将精氨酸添加到培养基中，并且在培养途中间断地或者连续地将精氨酸添加(追加)到培养基中，尤其是进一步优选在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。

本发明的精氨酸的添加量只要从能够制备、制造瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选相对于培养基为0.5～5质量％，更优选为0.7～4质量％，进一步优选为1～3质量％。

本发明的精氨酸的添加方法只要能够对培养基无菌地添加(混合)精氨酸即可，没有特别限定，可以在对培养基添加精氨酸后对该培养基进行加热杀菌、过滤灭菌，或者也可以另行制备精氨酸水溶液，对该精氨酸水溶液进行加热杀菌、过滤灭菌后，对培养基添加该精氨酸水溶液。

根据本发明的优选的一个实施方案，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，使用ph处于5以上且7以下范围的培养基，优选使用ph处于5以上且6.5以下范围的培养基，更优选使用ph处于5以上且6以下范围的培养基，进一步优选使用ph处于5.5以上且6以下范围的培养基。由此，能够提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的浓度(菌体浓度)，能够提高瓜氨酸产生能力。此时，优选通过添加碱来调节培养基的ph，更优选使用精氨酸或碱金属氢氧化物作为碱。

在本发明的一个实施方案中，“在ph为5以上且7以下范围的培养基中进行培养”优选是指从培养初期到结束为止，培养基的ph处于5以上且7以下范围，并不是指从培养初期到结束为止，培养基的ph一定总是处于5以上且7以下范围。即，只要以在培养基的ph处于5以上且7以下范围的状态下于足以提高从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的时间培养即可，具体而言，培养1～60小时、优选2～48小时、更优选3～36小时、进一步优选4～24小时即可。

本发明的碱的添加方法只要从能够将培养基的ph控制或管理在规定的范围的条件中适当选择即可，没有特别限定。例如，优选使用ph计和计算机等一边间断或连续地观察培养基的ph，一边间断或连续地将培养基的ph控制或管理在规定的范围，更优选一边连续地观察培养基的ph，一边将培养基的ph连续地控制、管理在规定的范围。

根据本发明的优选的一个实施方案，可以在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物之前对该微生物进行活化培养。活化培养的培养条件只要根据具有瓜氨酸产生能力的微生物的种类适当选择即可，没有特别限定。

根据本发明的一个实施方案，从含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养液中对该微生物的菌体进行离心分离、膜分离等处理后，在本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法中也可以使用该菌体。

含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的组合物的制造方法

本发明的含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的组合物的制造方法的特征在于，将上述微生物在比通常(微生物发酵的最佳温度)高的培养温度下在添加了精氨酸的原料中进行发酵。上述培养温度具体而言为40℃以上且48℃以下，优选为42℃以上且47℃以下，更优选为44℃以上且46℃以下。另外，根据本发明的其它实施方案，上述培养温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。

根据本发明的优选的一个实施方案，能够提供上述微生物的瓜氨酸产生能力提高的方法，将本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物在40℃以上且48℃以下、优选42℃以上且47℃以下、更优选44℃以上且46℃以下的温度进行发酵。另外，根据本发明的其它实施方案，上述发酵温度为40℃以上且70℃以下，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃。此时，本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物可以使用通过对由本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法得到的培养物或组合物进行适当处理而得到的提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物。

如上所述，本发明的优选的一个实施方案的原料是添加了精氨酸的原料。通过以这样的原料的组成(混合)对微生物进行发酵，能够有效地产生瓜氨酸。关于该理由，认为与在本发明的含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法中说明的理由相同。

在本发明的含有提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法中，可以不从含有瓜氨酸的培养基中使瓜氨酸分离而直接利用培养基作为含瓜氨酸组合物，或者也可以利用通过期望的操作(例如，离心分离、膜分离等)进行了处理的培养基作为含瓜氨酸组合物。

本发明的精氨酸的添加量只要从能够制备、制造瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选相对于原料为0.5～5质量％，更优选为0.7～4质量％，进一步优选为1～3质量％。

本发明的精氨酸的添加方法只要能够对培养基无菌地添加(混合)精氨酸即可，没有特别限定，可以在对原料添加精氨酸后对该原料进行加热杀菌、过滤灭菌，或者也可以另行制备精氨酸水溶液，对该精氨酸水溶液进行加热杀菌、过滤灭菌后，对原料添加该精氨酸水溶液。

根据本发明的优选的一个实施方案，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，在培养之前将精氨酸添加到培养基中和/或在培养途中间断地将精氨酸添加到培养基中或者在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。由此，能够提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的瓜氨酸产生能力。此时，对具有瓜氨酸产生能力的微生物而言，优选与充分浓度的精氨酸接触的时间长。因此，优选在培养之前将精氨酸添加(混合)到培养基或原料中，更优选在培养之前将精氨酸添加到培养基中，并且在培养途中间断地(例如，每次添加预定量)或连续地(例如，少量缓慢地添加)将精氨酸添加(追加)到培养基中，尤其是进一步优选在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。由此，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，能够提高从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。

根据本发明的优选的一个实施方案，可以在使用具有瓜氨酸产生能力的微生物进行发酵之前对该微生物进行活化培养。活化培养的培养条件只要根据具有瓜氨酸产生能力的微生物的种类适当选择即可，没有特别限定。

根据本发明的一个实施方案，从含有提高了精氨酸向瓜氨酸的转换效率的具有瓜氨酸产生能力的微生物的组合物中对该微生物的菌体进行离心分离、膜分离等后，本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法可以使用该菌体。

提高了微生物浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法

本发明的提高了微生物浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法的特征在于，将上述微生物在通常(微生物发酵的最佳温度)的培养温度下在ph处于5以上且7以下范围的培养基中进行培养，其特征在于，将上述微生物在35℃以上且48℃以下、优选38℃以上且48℃以下、更优选40℃以上且48℃以下、进一步优选42℃以上且47℃以下、特别优选44℃以上且46℃以下的培养温度下在ph处于5以上且7以下范围、优选ph处于5以上且6.5以下范围、更优选ph处于5以上且6以下范围、进一步优选ph处于5.5以上且6以下范围的添加了精氨酸的培养基中进行培养。即，在此，可以在适于具有瓜氨酸产生能力的微生物的培养的温度(例如，最佳温度)下对上述微生物进行培养。根据本发明的其它实施方案，其特征在于，将上述微生物在35℃以上且70℃以下的培养温度(在此，下限优选为38℃，更优选为40℃，进一步优选为42℃，特别优选为44℃，上限优选为68℃，进一步优选为65℃)下在ph处于5以上且7以下范围、优选ph处于5以上且6.5以下范围、更优选ph处于5以上且6以下范围、进一步优选ph处于5.5以上且6以下范围的添加了精氨酸的培养基中进行培养。

根据本发明的优选的一个实施方案，能够提供一种上述微生物的浓度(菌体浓度)的提高方法，将本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物在35℃以上且48℃以下、优选38℃以上且48℃以下、更优选40℃以上且48℃以下、进一步优选42℃以上且47℃以下、特别优选44℃以上且46℃以下的温度进行培养。根据本发明的其它实施方案，能够提供一种上述微生物的浓度(菌体浓度)的提高方法，将上述微生物在35℃以上且70℃以下的培养温度(在此，下限优选为38℃，更优选为40℃，进一步优选为42℃，特别优选为44℃，上限优选为68℃，进一步优选为65℃)下进行培养。此时，本发明的具有瓜氨酸产生能力的微生物可以使用通过对由本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法得到的培养物或组合物进行适当处理而得到的提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的微生物。

根据本发明的优选的一个实施方案，能够提供一种上述微生物的浓度(菌体浓度)的提高方法，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，使用ph处于5以上且7以下范围的培养基，优选使用ph处于5以上且6.5以下范围的培养基，更优选使用ph处于5以上且6以下范围的培养基，进一步优选使用ph处于5.5以上且6以下范围的培养基。由此，能够提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的浓度(菌体浓度)，能够提高瓜氨酸产生能力。此时，优选通过添加碱来调节培养基的ph，更优选使用精氨酸或碱金属氢氧化物作为碱。

本发明的精氨酸的添加量只要从能够制备、制造瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选相对于培养基为0.5～5质量％，更优选为0.7～4质量％，进一步优选为1～3质量％。

对于本发明的一个实施方案，“在ph为5以上且7以下范围的培养基中进行培养”优选是指从培养初期到结束为止，培养基的ph处于5以上且7以下范围，并不是指从培养初期到结束为止，培养基的ph一定总是处于5以上且7以下范围。即，只要以在培养基的ph处于5以上且7以下范围的状态下于足以提高菌体浓度的时间进行培养即可，具体而言，以1～60小时、优选以2～48小时、更优选以3～36小时、进一步优选以4～24小时进行培养即可。

碱的添加方法只要从能够将培养基的ph控制或管理在规定的范围的条件中适当选择即可，没有特别限定。例如，优选使用ph计和计算机等一边间断或连续地观察培养基的ph，一边将培养基的ph控制或管理在规定的范围，更优选一边连续地观察培养基的ph，一边将培养基的ph控制或管理在规定的范围。

根据本发明的优选的一个实施方案，可以在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物之前对该微生物进行活化培养。活化培养的培养条件只要根据具有瓜氨酸产生能力的微生物的种类适当选择即可，没有特别限定。

根据本发明的一个实施方案，从提高了菌体浓度的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液中对该微生物的菌体进行离心分离、膜分离等处理后，在本发明的瓜氨酸的制备方法或含瓜氨酸组合物的制造方法中可以使用该菌体。

在本发明的一个实施方案中，在使用精氨酸作为碱时，该精氨酸与本发明的瓜氨酸的制备方法、本发明的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法等中添加于培养基的精氨酸是共同的。因此，在上述的制备方法等中将精氨酸过量地添加于培养基时，当该培养基的ph变化成碱侧，该培养基的ph有时大幅偏离5以上且7以下范围。如上将精氨酸过量地添加于培养基时，一定程度提高了瓜氨酸产生能力，因此，若仅以提高瓜氨酸产生能力为目的，则可以允许，但有时无法充分提高菌体浓度。因此，在这样的情况下，虽然提高了每个具有瓜氨酸产生能力的微生物(菌体)的瓜氨酸的产生量(瓜氨酸的相对量)，但有可能无法充分提高每个含有该微生物的培养液(培养基)的瓜氨酸的产生量(瓜氨酸的绝对量)，因此，需要注意。

提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率且提高了微生物的浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法

本发明的提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率且提高了微生物的浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备方法的特征在于，将上述微生物在比通常(微生物发酵的最佳温度)高的培养温度下在ph处于5以上且7以下范围的培养基中进行培养，其特征在于，将上述微生物在40℃以上且48℃以下、优选42℃以上且47℃以下、更优选44℃以上且46℃以下的培养温度下在ph处于5以上且7以下范围、优选ph处于5以上且6.5以下范围、更优选ph处于5以上且6以下范围、进一步优选ph处于5.5以上且6以下范围的添加了精氨酸的培养基中进行培养。另外，根据本发明的其它实施方案，本发明的制备方法的特征在于，将上述微生物在40℃以上且70℃以下的温度范围(在此，优选的上限为68℃，更优选的上限为65℃，优选的下限为42℃，更优选的下限为43℃)下在ph处于5以上且7以下范围、优选ph处于5以上且6.5以下范围、更优选ph处于5以上且6以下范围、进一步优选ph处于5.5以上且6以下范围的添加了精氨酸的培养基中进行培养。

即，通过并用本发明的提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备条件和本发明的提高了微生物浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液的制备条件，能够制备提高了从精氨酸向瓜氨酸的转换效率且提高了微生物的浓度(菌体浓度)的含有具瓜氨酸产生能力的微生物的培养液。

在本发明的一个实施方案中，精氨酸向培养基(培养液)的添加方法和培养基(培养液)的ph调节(控制)方法只要能够提高从精氨酸向瓜氨酸的转换效率且提高微生物的浓度(菌体浓度)，则能应用上述方法。

根据本发明的优选的一个实施方案，在培养具有瓜氨酸产生能力的微生物时，在培养之前将精氨酸添加到培养基中和/或在培养途中间断地将精氨酸添加到培养基中或者在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。由此，能够提高具有瓜氨酸产生能力的微生物的瓜氨酸产生能力。此时，对具有瓜氨酸产生能力的微生物而言，优选在培养开始时培养基的ph为中性左右。因此，优选在培养之前不将精氨酸添加(混合)到培养基中，更优选在培养之前不将精氨酸添加到培养基中且在培养途中间断地(例如，将规定量一并添加)或连续地(例如，少量缓慢地添加)将精氨酸添加(追加)到培养基中，尤其是进一步优选在培养途中连续地将精氨酸添加到培养基中。由此，在培养或发酵具有瓜氨酸产生能力的微生物时，能够提高从精氨酸向瓜氨酸的转换效率且提高微生物的浓度(菌体浓度)。

本发明的精氨酸的添加量只要从能够制备、制造瓜氨酸或含瓜氨酸组合物或者它们的加工品的条件中适当选择即可，没有特别限定，但优选相对于培养基为0.5～5质量％，更优选为0.7～4质量％，进一步优选为1～3质量％。

实施例

以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。

在本发明的实施例中，菌体浓度通过“乳和乳制品的成分标准等相关省令(乳等省令)(日本)”中记载的乳酸菌数的测定方法来测定。其中，bcp培养基的培养温度为30℃。另外，精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度通过hplc法来测定。

实施例1：乳酸菌和双歧杆菌的精氨酸的代谢能力

对下述表1中记载的乳酸菌和双歧杆菌调查精氨酸的代谢能力。首先，将mrs培养基或gam培养基以121℃、15分钟进行灭菌。然后，将精氨酸水溶液进行过滤灭菌，然后，添加到这些培养基中，调节精氨酸浓度为27mm。在这些经调节的培养基中以1重量％接种下述的表1所示的乳酸菌和双歧杆菌的mrs培养基的活化培养液。对于乳球菌，使培养温度为30℃、培养时间为16小时，在静置状态下进行需氧培养，对于其它菌体，使培养温度为37℃、培养时间是16小时，在静置状态下进行需氧培养。

该结果如下述表1所示。对发酵乳杆菌jcm1173t、布氏乳杆菌ncimb8007t、乳酸乳球菌乳酸亚种jcm5805t和ifo12007确认精氨酸的代谢能力。

表1乳酸菌和双歧杆菌的精氨酸代谢能力的比较

表1

表中，arg：精氨酸；cit：瓜氨酸；orn：鸟氨酸

实施例2：乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactisssp.lactis)和乳酸乳球菌二乙酰乳酸亚种(lactococcuslactisssp.diacetylactis)的精氨酸的代谢能力

根据实施例1的结果，对于乳酸乳球菌乳酸亚种，2个菌株中2个菌株均确认到精氨酸的代谢能力。但是，对于这2个菌株，将精氨酸全部转换为瓜氨酸后，该瓜氨酸的大部分转换为鸟氨酸。

因此，接着，使用下述表2中记载的29株乳酸乳球菌乳酸亚种和作为乳酸乳球菌乳酸亚种的近缘种的乳酸乳球菌二乙酰乳酸亚种1株探索不将瓜氨酸转换为鸟氨酸的菌株。表2中的no.1～no.29为乳酸乳球菌乳酸亚种，no.30为乳酸乳球菌二乙酰乳酸亚种。

首先，将mrs培养基以121℃、15分钟进行灭菌。然后，将精氨酸水溶液过滤灭菌，然后，添加到这些培养基中，调节精氨酸浓度为27mm。在这些经调节的培养基中以1重量％接种下述表2的菌株的mrs培养基的活化培养液。对于这些菌株，使培养温度为30℃、培养时间为16小时，在静置状态下进行需氧培养。

该结果如下述的表2所示。乳酸乳球菌乳酸亚种的29株菌株全部确认到精氨酸的代谢能力。但是，精氨酸的大部分被转换为鸟氨酸，瓜氨酸相对于鸟氨酸的生产比率(“cit/orn”)为0.02～0.13这样的低值。另外，对于乳酸乳球菌二乙酰乳酸亚种的1株菌株，未确认到精氨酸的代谢能力。

表2乳酸菌的精氨酸代谢能力的比较

表2

续表2

实施例3：在乳酸乳球菌乳酸亚种代谢精氨酸中，培养温度(37℃、40℃)的影响

使培养温度为37℃或40℃，除此以外，与实施例2同样地对菌体进行培养，调查精氨酸的代谢能力。该结果如下述的表3所示。在此，查找cit/orn较高的菌株，挑选了6个菌株。

表3乳酸菌的精氨酸代谢能力和培养温度的关系(mrs培养基)

表3

续表3

实施例4：还原脱脂乳中的乳酸乳球菌乳酸亚种的精氨酸的代谢能力的验证(1)

根据实施例3的结果，查找cit/orn较高的菌株，挑选5个菌株来使用。即，对下述表4中记载的5个菌株调查精氨酸的代谢能力。此时，作为培养基，使用以1重量％添加了精氨酸的还原脱脂乳(脱脂奶粉的浓度：10重量％)(下文记为“1％arg+10％还原脱脂乳”)。

将下表4中记载的5个菌株的mrs培养基的活化培养液20ml进行离心分离(8000rpm、10分钟)，回收这5个菌株的菌体。然后，将“1％arg+10％还原脱脂乳”40ml以95℃、3分钟进行杀菌，此时接种如上回收的5个菌株的菌体。另外，在还原脱脂乳中添加精氨酸时，首先，制备精氨酸的水溶液，用盐酸调节ph后，与还原脱脂乳混合。对于这5个菌株，使培养温度为40℃和43℃、培养时间为4小时和8小时，在静置状态下进行需氧培养。

该结果如下表4所示。在此，查找cit/orn较高的菌株，并且查找cit/orn较高的培养温度和培养时间。对于这些菌株，整体来说确认到培养温度越高，而且培养时间越长，则cit/orn变得越高的倾向。

表4乳酸菌的精氨酸代谢能力和培养温度·时间的关系(脱脂奶粉培养基)(1)

实施例5：还原脱脂乳中的乳酸乳球菌乳酸亚种的精氨酸的代谢能力的验证(2)

将培养温度从44.5℃、46℃、以及50℃开始以5度间隔升温至70℃，除此以外，与实施例4同样地对菌体进行培养，调查精氨酸的代谢能力。该结果如下述的表5所示。另外，根据实施例4的结果，查找cit/orn较高的菌株，挑选3个菌株来使用。

表5乳酸菌的精氨酸代谢能力和培养温度·时间的关系(脱脂奶粉培养基)(2)

续表5

续表5

实施例6：使用了乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株或ols3818株的含有瓜氨酸的酸奶的制造

使用乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株或ols3818株制造含有瓜氨酸的发酵乳(酸奶)。即，调配下述的表6中记载的原料乳(酸奶基料)，以95℃、3分钟进行杀菌。然后，在该原料乳中以2重量％添加保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合发酵起子作为酸奶发酵起子，并且添加乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株或ols3818株，在45℃下使其发酵，制造酸奶。需要说明的是，在此，作为乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株和ols3818株，将mrs培养基的培养液进行离心分离(8000rpm、10分钟)，仅回收菌体来使用。此时，mrs培养基的使用量为与下述的表6中记载的原料乳的使用量相同的重量。

表6原料乳(酸奶基料)的组成(质量％)

*将精氨酸溶解于盐酸溶液中，将溶解后的ph调节至5左右

使用乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株时，在5小时30分钟酸度达到0.80％。另外，使用乳酸乳球菌乳酸亚种ols3818株时，在4小时30分钟酸度达到0.83％。使用这2个菌株时，确认到发酵顺利地进行。另外，这些发酵乳(酸奶)的风味和物性与通常产品、现有产品相比，没有很大的差别。

对这些发酵乳(酸奶)的精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸的浓度进行测定。该结果如下述的表7所示。确认到精氨酸的大部分被代谢，其大部分被转换为瓜氨酸。即，明确了使用乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株或ols3818株，能够制造以高浓度含有瓜氨酸的发酵乳(酸奶)。

表7酸奶中的乳酸菌的精氨酸的代谢能力

实施例7：从精氨酸向瓜氨酸的转换效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株)的培养液的制备方法的研究(1)

对从精氨酸向瓜氨酸的转换效率(活性)高的培养液的制备方法进行研究。在上述的实施例中，将乳酸乳球菌在mrs培养基中进行静置培养而制备培养液。作为其结果，若对乳酸乳球菌进行静置培养，则观察到随着培养液的ph的降低，乳酸乳球菌的增殖停止，菌体浓度未提高。因此，一边在培养液中添加碱来抑制培养液的ph降低、控制其ph，一边将乳酸乳球菌在mrs培养基中进行搅拌培养(ph控制培养)，由此研究对菌体浓度的影响。即，对通过将乳酸乳球菌在mrs培养基中进行ph控制培养，乳酸乳球菌的培养液中的每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高的可能性进行研究。另外，将mrs培养基于121℃、15分钟进行灭菌。

将氢氧化钠水溶液(naoh：10重量％)添加到培养液中，一边将培养液的ph控制为5.5一边将乳酸乳球菌ols3797株进行搅拌培养(ph控制培养)，经时测定菌体浓度。具体而言，将乳酸乳球菌ols3797株的mrs培养基的活化培养液(培养温度：30℃、培养时间：16小时)以1重量％接种于mrs培养基进行搅拌培养(培养温度：30℃、搅拌速度：200rpm)。该菌体浓度的经时变化如图1所示。

采取从培养开始10、11、12小时后的ph控制培养的培养液，将这些培养液在冰水中冷却保存。然后，将该培养液以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”进行静置培养(培养温度：44.5℃、培养时间：8小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。此时，作为比较对照，将上述的培养液以5重量％接种于mrs培养基进行静置培养(培养温度：30℃、培养时间：16小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如图2和下述的表8所示。

表8.乳酸菌的瓜氨酸转换效率和培养条件的关系

如上所述，确认到与在mrs培养基中进行静置培养的情况相比，在mrs培养基中进行ph控制培养的情况时，乳酸乳球菌的培养液中的每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高。另一方面，与在mrs培养基中进行静置培养的情况相比，在mrs培养基中进行ph控制培养的情况时，乳酸乳球菌的培养液中的每单位时间·单位菌体的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率没有差别。即，可以判断与静置培养相比，ph控制培养的菌体浓度提高，但每单位菌体的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率没有变化。需要说明的是，每单位时间·单位菌体的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率是从培养开始4小时后和8小时后的瓜氨酸的浓度除以起始的活菌数和培养时间(4小时和8小时)而得到的数值算出。

进而，对使用ph控制培养的培养开始12小时后的培养液的情况调查“1％arg+10％还原脱脂乳”中的从培养开始4小时后和8小时后的菌数。作为其结果，它们的菌数分别为1×10⁶cfu/ml和1×10⁴cfu/ml(cfu：菌落形成单位)，从培养开始随着时间的经过，菌数降低。因此，在从精氨酸向瓜氨酸的转换效率的测定中，可以推测产生adi的可能性低，通过菌体自身所持有的adi，从精氨酸转换成瓜氨酸。此时，从培养开始随着时间的经过，adi的活性有可能降低若干，但从培养开始4小时和8小时后的转换效率没有很大的差别。

实施例8：从精氨酸向瓜氨酸的转换效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亚种3797株)的培养液的制备方法的研究(2)

在实施例7中，若对乳酸乳球菌进行ph控制培养，则菌体浓度(菌数)提高，但每单位时间·单位菌体的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率没有变化。因此，在开始乳酸乳球菌的培养之前，对通过将精氨酸添加于mrs培养基进行静置培养，乳酸乳球菌的培养液中的每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高的可能性进行研究。即，将乳酸乳球菌ols3797株在含有通常的mrs培养基和以0.5重量％含有精氨酸的mrs培养基中进行静置培养，使用该培养液测定“1％arg+10％还原脱脂乳”中的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。在此，将mrs培养基以121℃、15分钟进行灭菌。

具体而言，将乳酸乳球菌3797株的活化培养液(培养温度30℃、培养时间16小时)以1重量％接种于mrs培养基进行静置培养(培养温度：30℃、培养时间：16小时)。然后，将该培养液20ml进行离心分离(8000rpm、10分钟)，仅回收菌体，然后接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”40ml中，进行搅拌培养(培养温度：44.5℃、培养时间：4小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如下述的表9所示。

另一方面，将上述的活化培养液以1重量％接种于以0.5重量％含有精氨酸的mrs培养基进行静置培养(培养温度：30℃、培养时间：16小时)。然后，将该培养液20ml进行离心分离(8000rpm、10分钟)，仅回收菌体，然后，接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”40ml中，进行搅拌培养(培养温度：44.5℃、培养时间：4小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如下述的表9所示。

表9乳酸菌的瓜氨酸转换效率和培养基组成的关系

如上所述，确认到与在通常的(现有的)mrs培养基中进行静置培养的情况相比，在含有精氨酸的mrs培养基进行静置培养的情况时，乳酸乳球菌的培养液中每单位时间、单位菌体的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高至2倍以上。

实施例9：从精氨酸向瓜氨酸的转换效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株)的培养液的制备方法的研究(3)

在实施例8中，若将精氨酸添加于培养基，则乳酸乳球菌的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高。因此，在开始乳酸乳球菌的培养之前，对通过在将精氨酸添加于mrs培养基后进行ph控制培养，乳酸乳球菌的培养液中每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高的可能性进行研究。即，将乳酸乳球菌ols3797株在以0.5重量％含有精氨酸的mrs培养基中进行ph控制培养，使用该培养液测定“1％arg+10％还原脱脂乳”中的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。在此，将mrs培养基以121℃、15分钟进行灭菌。然后，将精氨酸水溶液进行过滤灭菌后，添加于该培养基，以精氨酸浓度为0.5重量％的方式进行调整。

将氢氧化钠水溶液(naoh：10重量％)添加到培养液中，一边将培养液的ph控制在5.5，一边对乳酸乳球菌ols3797株进行搅拌培养(ph控制培养)，经时测定菌体浓度等。具体而言，将乳酸乳球菌ols3797株的mrs培养基的活化培养液(培养温度：30℃、培养时间：16小时)以1重量％接种于以0.5重量％含有精氨酸的mrs培养基后，添加naoh，一边将培养液的ph控制在5.5一边进行搅拌培养(培养温度：30℃、搅拌速度：200rpm)。该菌体浓度、ph、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化如图3所示。

如上所述，在开始乳酸乳球菌的培养之前，将精氨酸添加于培养基，结果培养开始时的培养基的ph上升至8.3。而且，认为由于该培养开始时(培养的初期)的培养基的ph的上升，菌株的增殖延迟。但是，在培养的后期(后半部分)，乳酸菌(菌体)顺利地增殖，从培养开始10小时以后，精氨酸开始被消耗，在13小时后精氨酸浓度成为0。需要说明的是，在该培养中，最高到达的菌体浓度为2.7×10⁹cfu/ml，与实施例7相比，菌体浓度降低至一半(2分之1)以下。

采取从培养开始8、9、10、11、12、13小时后的培养液，将这些培养液在冰水中冷却保存。然后，将该培养液以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”进行静置培养(培养温度：44.5℃、培养时间：8小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如下述的表10所示。

表10乳酸菌的瓜氨酸转换效率和ph控制培养的关系

如上所述，从培养开始11小时以后精氨酸的消耗急剧增加。确认到若使用这些精氨酸的消耗快的培养液，则从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高。

实施例10：从精氨酸向瓜氨酸的转换效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株)的培养液的制备方法的研究(4)

在实施例9中，在开始乳酸菌(菌体)的培养之前，若将精氨酸添加于培养基，则从精氨酸向瓜氨酸的转换效率大幅提高，但与未添加精氨酸的情况相比，最高到达的菌体浓度降低。在此，认为若培养开始时的培养基的ph高，则最高到达的菌体浓度容易降低。因此，对通过在培养乳酸乳球菌的途中将精氨酸一并(间断地)添加于培养基(培养液)进行ph控制培养，乳酸乳球菌的培养液中每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高的可能性进行研究。在此，将mrs培养基以121℃、15分钟进行灭菌。

将氢氧化钠水溶液(naoh：10重量％)添加到培养液中，一边将培养液的ph控制在5.5一边对乳酸乳球菌ols3797株进行搅拌培养(ph控制培养)，经时测定菌体浓度等。此时，从培养开始10小时后，对精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)进行过滤灭菌，然后，添加于该培养基(培养液)，以精氨酸浓度为0.5重量％的方式进行调整。具体而言，将乳酸乳球菌ols3797株的mrs培养基的活化培养液(培养温度：30℃、培养时间：16小时)以1重量％接种于mrs培养基后，添加naoh，一边将培养液的ph控制在5.5一边进行搅拌培养(培养温度：30℃、搅拌速度：200rpm)，并且从培养开始10小时后对精氨酸水溶液进行过滤灭菌，然后，添加于该培养基，以精氨酸浓度为0.5重量％的方式进行调整。该菌体浓度、ph、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化如图4所示。

采取从培养开始8、10、12、13小时后的培养液，将该培养液在冰水中冷却保存。然后，将该培养液以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”进行静置培养(培养温度：44.5℃、培养时间：4.5小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如下述的表11所示。

表11乳酸菌的瓜氨酸转换效率和精氨酸添加时间的关系

以上所述，最高达到的菌体浓度为7.1×10⁹cfu/ml，与实施例7相比，菌体浓度为大致相同。另一方面，与实施例9相比，从精氨酸向瓜氨酸的转换效率降低。

实施例11：从精氨酸向瓜氨酸的转换效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亚种ols3797株)的培养液的制备方法的研究(5)

在实施例10中，若在培养乳酸菌(菌体)的途中将精氨酸一并(间断地)添加于培养基(培养液)进行ph控制培养，则与通常(现有)的进行ph控制培养的情况相比，虽然最高到达的菌体浓度为大致相同，但与在开始乳酸菌(菌体)的培养之前，将精氨酸添加于培养基的情况相比，从精氨酸向瓜氨酸的转换效率降低。因此，对通过在培养乳酸乳球菌的途中一边将精氨酸每次少量(连续地)添加于培养基(培养液)一边进行ph控制培养，乳酸乳球菌的培养液中每单位容量的从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高的可能性进行研究。在此，将mrs培养基以121℃、15分钟进行灭菌。

将精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)添加到培养液中，一边将培养液的ph控制在5.5一边对乳酸乳球菌ols3797株进行搅拌培养(ph控制培养)，经时测定菌体浓度等。此时，从培养开始4小时后对精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)进行过滤灭菌，然后添加于该培养基(培养液)，以培养基的ph为5.5的方式进行调整。具体而言，将乳酸乳球菌ols3797株的mrs培养基的活化培养液(培养温度：30℃、培养时间：16小时)以1重量％接种于mrs培养基后，添加精氨酸，一边将培养液的ph控制在5.5一边进行搅拌培养(培养温度：30℃、搅拌速度：200rpm)，并且从培养开始4小时后对精氨酸水溶液进行过滤灭菌，然后，添加于该培养基，以培养基的ph为5.5的方式进行调整。该菌体浓度、ph、精氨酸浓度、瓜氨酸浓度、鸟氨酸浓度的经时变化如图5所示。

采取从培养开始8、10、12、13小时后的培养液，将该培养液在冰水中冷却保存。然后，将该培养液以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”进行静置培养(培养温度：44.5℃、培养时间：4.5小时)，调查从精氨酸向瓜氨酸的转换效率。该结果如下述的表12所示。在此，表中，“培养物”是将培养液直接以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”的物质。另外，“上清液”是将离心分离培养液而得到的上清以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”的液体。进而，“细胞”是将离心分离培养液并除上清之后回收的菌体在－80℃冷冻保存，然后，将解冻的细胞以5重量％接种于“1％arg+10％还原脱脂乳”的物质。

表12乳酸菌的瓜氨酸转换效率和精氨酸添加时间·ph控制培养的关系

在此，从培养开始4小时后，开始将精氨酸(中和剂、基质)添加于培养基(培养液)，继续直到培养结束。此时，在开始将精氨酸添加于培养基后的一段时间内，精氨酸立即转换为鸟氨酸，但在培养的后半部分，若干精氨酸未转换为鸟氨酸，直接蓄积。

如上所述，最高达到的菌体浓度为6.5×10⁹cfu/ml，与实施例7和实施例10相比，菌体浓度为大致相同。而且，与实施例9相比，从精氨酸向瓜氨酸的转换效率为大致相同。即，在此，菌体浓度提高，并且从精氨酸向瓜氨酸的转换效率提高。

另外，与直接使用菌体的培养液的情况相比，在仅回收菌体进行冷冻保存的情况下，从精氨酸向瓜氨酸的转换效率也为大致相同。而且，从培养开始4～8小时后，精氨酸全部被代谢，精氨酸的大部分被转换为瓜氨酸。

而且，与直接使用菌体的培养液的情况相比，在仅回收菌体来使用的情况下，在培养基(培养液)中的添加浓度(接种量)减少至20分之1～50分之1左右。在此，由于在培养基中的添加浓度为5重量％，因此，在仅回收菌体来使用的情况下，可以估算在培养基中的添加浓度为0.25～0.1重量％。即，在一边将精氨酸(作为中和剂)在培养途中连续地(例如，直到培养结束为止)添加，一边进行ph控制培养来制备培养液的情况下，若仅回收菌体来使用，则能够有效地制造以高浓度含有瓜氨酸的乳制品。