控制基因表达的天然型miRNA及其用途的制作方法
本发明涉及抑制基因表达的天然型mirna(naturaltypemirna)及其用途。
背景技术：
将微rna(mirna)称作抑制基因表达的核酸分子并且已经报道它例如借助以下产生过程抑制基因编码的蛋白质的转录。即，在5’末端上具有帽结构并且在3’末端上具有聚腺苷酸的mirna转录产物(初级mirna(pri-mirna))在胞核中产生。前述的初级mirna由rna酶(drosha)切割以产生mirna前体(前mirna(pre-mirna))。前述的前mirna形成具有环区和茎区的发夹结构。前mirna从胞核移出并在细胞质中由rna酶(dicer)降解，并且切除在3’末端上具有1–4个碱基突出端的双链mirna(成熟mirna)。双链mirna的一条链称作引导链并且另一条链称作过客链(passengerstrand)，并且前述的引导链与相似于rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)的复合体结合。这种mirna/risc复合体与特定mrna的3'非翻译区(3’utr)结合以抑制蛋白质从前述mrna翻译。
已经明确mirna深入涉及多个生命现象，如分化、细胞增殖、凋亡等和许多疾病如病毒性感染、癌症等(专利文献1、非专利文献1、非专利文献2)。因而已经尤其预期其在医学领域的应用。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：wo2010/056737a2
[非专利文献]
非专利文献1：deiters,2009,theaapsjournal,12,51-60
非专利文献2：takeshit等人,2010,mol.ther.,18,181-187
技术实现要素：
发明要解决的问题
为了应用前述的mirna，例如，一种包括使用双链成熟mirna或前mirna等的方法是可获得的。但是，前者要求在应用之前使二个单链核酸分子复性(annealing)，这引起了因tlr3等识别双链而形成自身免疫性的可能性。在另一方面，在后一种情况下，众多的核苷酸令合成不易，就成本而言不利，并且还带来胞内可转移性和药代动力学的问题。
因此，本发明的目的以提供利用成熟mirna的结构的天然型mirna。
在本说明书中，“天然型mirna”意指单链核酸分子，所述单链核酸分子包含天然存在性成熟mirna(naturallyoccurringmaturemirna)的引导链和过客链并且具有与成熟mirna同质的活性(即，抑制靶基因表达的活性)，并且除引导链和过客链之外的部分可以含有人工构成要素。
用于解决问题的方案
为了实现前述的目的，本发明的天然型mirna是包含x区和y区的单链核酸，其特征在于
前述x区的3’末端和前述y区的5’末端经非核苷酸结构的连接子区(linkerregion)连接，
前述x区包含成熟mirna的(a)引导链序列或(b)过客链序列，
当x区包含(a)时，前述y区包含前述成熟mirna的过客链序列，
当x区包含(b)时，前述y区包含前述成熟mirna的引导链序列，并且
前述的引导链序列和前述的过客链序列形成双链结构。
本发明的组合物是抑制基因表达的组合物，并且特征在于含有上述本发明天然型mirna。
本发明的组合物是特征在于含有上述本发明天然型mirna的药物组合物。
本发明的表达抑制方法是一种用于抑制靶基因表达的方法，所述方法特征在于使用上述本发明天然型mirna。
治疗本发明疾病的方法包括向患者施用施用上述本发明天然型mirna的步骤，其中上述天然型mirna中的前述引导链序列是抑制涉及前述疾病的基因表达的成熟mirna的引导链序列。
发明的效果
本发明的天然型mirna可以按低成本容易地合成，并且可以抑制由前述基因编码的蛋白质翻译。
附图说明
图1是显示本发明天然型mirna的一个实施方案的示意图。
图2是显示实施例1中axlmrna量的相对值的图。
图3是显示实施例2中axlmrna量的相对值的图。
图4是显示实施例3中axlmrna量的相对值的图。
图5是显示实施例4中hmga2mrna量的相对值的图。
图6是显示实施例5中col1a1mrna量的相对值的图。
图7是显示实施例6中axlmrna量的相对值的图。
图8是显示实施例7中hmga2mrna量的相对值的图。
图9是显示实施例8中col1a1mrna量的相对值的图。
图10是显示实施例9中axlmrna量的相对值的图。
图11是显示实施例10中col1a1mrna量的相对值的图。
图12是显示实施例11中col1a1mrna量的相对值的图。
图13是显示实施例11中col1a1mrna量的相对值的图。
具体实施方式
除非另外说明，否则在本说明书中所用的术语意指本领域中其通常所指的含义。
(1)天然型mirna
如上文提到，本发明的天然型mirna是包含x区和y区的单链核酸，其特征在于
前述x区的3’末端和前述y区的5’末端经非核苷酸结构的连接子区连接，
前述x区包含成熟mirna的(a)引导链序列或(b)过客链序列，
当x区包含(a)时，前述y区包含前述成熟mirna的过客链序列，
当x区包含(b)时，前述y区包含前述成熟mirna的引导链序列，并且
前述的引导链序列和前述的过客链序列形成双链结构。
并不必然地限制前述x区是否含有(a)引导链序列或(b)过客链序列。优选地，引导链序列和过客链序列按照与天然存在性前mirna相同的方向配置(即，5’→3’方向或3’→5’方向)。当天然存在性前mirna按这种顺序从5’方向由引导链–环区-过客链组成时，本发明的天然型mirna优选地含有在前述x区中的引导链序列。相反，当天然存在性前mirna按这种顺序从3’方向由引导链–环区-过客链组成时，本发明的天然型mirna优选地含有在前述x区中的过客链序列。
在下文提到的实施例中，mir-34a和let-7a优选地含有在前述x区中的引导链序列，并且mir-29b优选地含有在前述x区中的过客链序列。
本发明的天然型mirna可以例如抑制靶基因表达。抑制表达例如意指抑制前述靶基因的翻译，即，抑制由前述靶基因编码的蛋白质翻译，更具体地，抑制前述蛋白质从前述靶基因的mrna翻译。可以例如通过衍生自靶基因的转录产物量减少；前述转录产物的活性减少；从前述靶基因产生的翻译产物的量减少；前述翻译产物的活性减少；等，验证前述抑制靶基因表达。前述蛋白质可以例如是成熟蛋白、在经历加工或翻译后修饰之前的前体蛋白。
由于本发明的天然型mirna是单链核酸分子，不同于成熟mirna，二条单链的复性并非必需，并且可以按低成本产生。另外，由于本发明的天然型mirna是单链核酸分子，例如，它可以避免由涉及自身免疫性的tlr3、rig-i、mda5等识别。
在本发明的天然型mirna中，引导链序列和过客链序列经非核苷酸结构的连接子分子连接。因此，mirna可以容易地合成并以低成本提供，并且还在药代动力学和胞内可转移性方面优越，如与单链核酸分子相比，包含具有比较长的核苷酸环的前mirna。
图1中显示本发明的天然型mirna中前述x区和前述y区之间配置关系的概况。图1显示概况，并且例如，不限制每个区的长度、形状等。如图1中所示，本发明的天然型mirna在5’侧上具有前述x区并且在3’侧上具有前述y区，并且前述x区的3’末端和前述y区的5’末端借助非核苷酸结构的连接子区(本图中以“p”显示)连接。
在本发明的天然型mirna中，前述x区含有任何成熟mirna的引导链序列或过客链序列。当前述x区含有前述引导链序列时，前述y区含有前述成熟mirna的过客链序列，并且当前述x区含有前述过客链序列时，前述y区含有前述成熟mirna的引导链序列，其中前述x区和前述y区在前述引导链序列和前述过客链序列之间分子内复性(也称作自我复性)。因此，本发明的天然型mirna在前述分子内复性的区中形成双链结构。
本发明的天然型mirna是线型单链核酸分子，其中，其5’末端和其3’末端未连接。为了维持两个末端不结合，本发明天然型mirna的5’末端优选地例如是非磷酸基团。
在本发明的天然型mirna中，如上文提到，前述x区含有成熟mirna的引导链序列(过客链序列)。在另一方面，前述y区含有前述成熟mirna的过客链序列(引导链序列)。成熟mirna的引导链序列和过客链序列例如注册于各种数据库中(例如，http://www.mirbase.org/etc.等)。因此，前述x区和前述y区可以例如基于已知的成熟mirna的信息设置。前述成熟mirna的引导链是纳入rna诱导的沉默复合体(risc)的argonaute(ago)蛋白和与mrna靶结合的链，并且前述成熟mirna的过客链是与成熟mirna的引导链互补并最终从risc移除的链。通常，成熟mirna的引导链和过客链并非完全互补，并且各自含有1个至几个非配对的碱基。
在以下解释中，将含有前述引导链序列的前述x区作为一个例子详述。从以下描述中，本领域普通技术人员可以轻易地理解在其中前述x区含有前述过客链序列的一个实施方案中本发明天然型mirna的构成。
前述x区可以例如仅由前述引导链序列组成，或还可以具有附加序列。在后一种情况下，前述x区例如由前述引导链序列和前述附加序列组成，并且前述附加序列与例如前述引导链序列的3’末端连接。
在本发明的天然型mirna中，当前述引导链序列和前述载客序列比对(aligned)并且引导链的3’末端侧具有突出端时，前述y区在前述过客链的5’末端侧处含有与前述突出端的序列互补的序列。当前述x区含有附加序列、和前述x区和前述y区比对时，前述y区具有与前述x区的附加序列互补的序列。当前述x区的附加序列与前述引导链序列的3’末端连接时，前述互补序列与前述过客链序列的5’末端连接。尽管前述互补序列可以并非完全互补，但只要它可以形成与前述引导链序列和前述载客序列的双链连续的双链结构，则它期望地完全互补。前述y区可以仅由前述载客序列和与前述x区的附加序列互补的序列组成，并且还可以具有与前述x区非配对的突出端。即，在本发明的天然型mirna中，例如当前述y区和前述x区比对时，前述y区可以在3’末端上具有突出端。如本文中使用，y区中的前述突出端例如是这样的末端碱基，其中前述y区和前述x区比对时，前述y区比前述x区具有过量的所述末端碱基。例如，突出端的长度(o)如以下式中所示。
突出端的长度(o)＝[y区的全长碱基数目(y)]-[x区的全长碱基数目(x)]
由于许多成熟mirna在过客链的3'末端具有与引导链非配对的突出端，在前述y区最无必要向过客链的前述3’末端进一步添加人工突出端。
在本发明的天然型mirna中，每个区的长度不作具体限制。尽管下文显示条件的例子，但是本发明的天然型mirna不受这种描述限制。在本发明中，碱基数目的数值范围公开了落于该范围内的全部正整数范围，并且例如，“1–4个碱基”意指“1、2、3、4个碱基”的全部情况(下文相同)。
在前述x区中，前述引导链序列的长度不作具体限制并且可以例如是所报告的成熟mirna的引导链序列的长度。其具体例子包括19碱基长度、20碱基长度的下限，和25碱基长度、24碱基长度的上限，和19-25碱基长度、20-24碱基长度的范围。
前述x区的前述附加序列的长度不作具体限制，并且下限例如是0碱基长度、1碱基长度、2碱基长度，和上限例如是、7碱基长度、5碱基长度、4碱基长度、3碱基长度，和范围例如是、0-7碱基长度、0-5碱基长度、1-5碱基长度、1-4碱基长度、2-3碱基长度、3-5碱基长度。前述附加序列的长度范围优选地是3–7碱基长度、更优选地3–5碱基长度。
前述x区中前述附加序列的碱基序列不作具体限制。当前述附加序列的长度是3碱基长度时，例如，可以提到uaa、ugg、ucc、caa、cgg、ccc等。当前述附加序列的长度是4碱基长度时，例如，可以提到uaau、uuaa、uugg、uuuu等。当前述附加序列的长度是5碱基长度时，例如，可以提到uaauu、uccgg、uuuuu、uuuua、uuuau、uuauu、uauuu、uuuaa、uuaua、uauua、uuaau、uauau、uuaaa、uauaa、uaaua、uaaau、uaaaa、uuugg、auuaa、auuuu、cuuaa、cuuuu、guuaa、guuuu等。当前述附加序列的长度是7碱基长度时，例如，可以提到uaauuaa、uccggcc等。前述附加序列的碱基序列和与前述附加序列互补的序列的碱基序列优选地富含au。
前述x区的长度不作具体限制，下限例如是19碱基长度、21碱基长度、23碱基长度，上限例如是35碱基长度、30碱基长度、28碱基长度、26碱基长度，并且范围例如是19-35碱基长度、19-30碱基长度、21-28碱基长度、23-26碱基长度。
前述y区中前述突出端的长度(当前述过客链本身具有突出端时，长度包括相同突出端)不作具体限制，并且下限例如是0碱基长度、1碱基长度，并且上限例如是4碱基长度、3碱基长度，并且范围例如是0-4碱基长度、1-3碱基长度、2碱基长度。
前述突出端的序列不作具体限制并且例如从3’侧起是uu、cu、gc、ua、aa、cc、ug、cg、au、tt等。可以例如通过tt向前述突出端赋予核糖核酸酶抗性。
前述y区的长度不作具体限制，并且下限例如是19碱基长度、21碱基长度、23碱基长度，并且上限例如是37碱基长度、32碱基长度、30碱基长度、28碱基长度，并且范围例如是19-37碱基长度、19-32碱基长度、21-37碱基长度、21-30碱基长度、23-28碱基长度。
本发明天然型mirna的全长(t)不作具体限制，并且下限例如是38碱基长度、42碱基长度、46碱基长度，上限例如是72碱基长度、62碱基长度、58碱基长度、54碱基长度，并且范围例如是38-72碱基长度、40-68碱基长度、38-62碱基长度、42-58碱基长度、46-54碱基长度。
在本发明的天然型mirna中，前述成熟mirna的种类不作具体限制，并且可以根据靶基因的种类适当地选择。
前述成熟mirna的例子包括成熟mirna如hsa-mir-34a(mirbase登录号mi0000268)、hsa-let-7a(mirbase登录号mi0000060)、hsa-let-7f(mirbase登录号mi0000067)、hsa-mir-150(mirbase登录号mi0000479)、hsa-mir-29b(mirbase登录号mi0000105)等。
hsa-mir-34a(seqidno:1/seqidno:2)
uggcagugucuuagcugguugu/caaucagcaaguauacugcccu
hsa-let-7a(seqidno:3/seqidno:4)
ugagguaguagguuguauaguu/cuauacaaucuacugucuuuc
hsa-let-7f(seqidno:5/seqidno:6)
ugagguaguagauuguauaguu/cuauacaaucuauugccuuccc
hsa-mir-150(seqidno:7/seqidno:8)
ucucccaacccuuguaccagug/cugguacaggccugggggacag
hsa-mir-29b(seqidno:10/seqidno:9)
gcugguuucauauggugguuuaga/uagcaccauuugaaaucaguguu
这里，每种核苷酸序以5’→3’方向按引导链序列/载客序列(仅hsa-mir-29b，过客链序列/引导链序列)的顺序描述。
mir-34a的引导链靶向例如axl、met、cdk4、cdk6、sirt1、ccnd1、sirt1、bcl-2等，并且抑制这些靶基因的表达可以预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等。
let-7a的引导链靶向例如hmga2(高迁移率族at-钩2)、kras、nras、hras、myc、tlr4等，并且抑制这些靶基因的表达可以预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等。
let-7f的引导链靶向例如hmga2(高迁移率族at-钩2)、kras、nras、hras、myc、tlr4等，并且抑制这些靶基因的表达可以预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等。
mir-150的引导链靶向例如col1a1、col4a4、smad2、sp1等，并且抑制这些靶基因的表达可以预防或治疗疾病如肺纤维化、肝纤维化等。
mir-29b的引导链靶向例如col1a1、mcl1、dnmt3a、dnmt3b、tcl1a、tgfb3等，并且抑制这些靶基因的表达可以预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺纤维化、肝纤维化等。
本发明天然型mirna的构成单元不作具体限制。其例子包括核苷酸残基。前述核苷酸残基的例子包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。在本发明的天然型mirna中，前述核苷酸残基优选地例如是核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可以例如是未修饰的残基(未修饰的核苷酸残基)或已经修饰的残基(修饰的核苷酸残基)。通过设置本发明的天然型mirna以包含前述修饰的核苷酸残基，例如，可以改善天然型mirna对核酸酶的抗性，因而允许改善天然型mirna的稳定性。另外，本发明的天然型mirna进一步可以例如包含除前述核苷酸残基之外的非核苷酸残基。
当天然型mirna例如包含除前述未修饰的核糖核苷酸残基之外的前述修饰的核糖核苷酸残基时、前述修饰的核糖核苷酸残基的数目不作具体限制，并且例如是“一个至几个”、具体地，例如，1至5、优选地1至4、更优选地1至3、和最优选地1或2。如与前述未修饰的核糖核苷酸残基相比，前述修饰的核糖核苷酸残基可以例如是通过将核糖残基置换为脱氧核糖残基获得的前述脱氧核糖核苷酸残基。当本发明的天然型mirna例如包含除前述未修饰的核糖核苷酸残基之外的前述脱氧核糖核苷酸残基时，前述脱氧核糖核苷酸残基的数目不作具体限制，并且例如是“一个至几个”、具体地，例如，1至5、优选地1至4、更优选地1至3、和最优选地1或2。
前述的核苷酸残基例如包含糖、碱基和磷酸作为其组分。前述的核糖核苷酸残基例如具有核糖残基作为糖；并具有腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)作为碱基。前述的脱氧核糖残基例如具有脱氧核糖残基作为糖；并且具有腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)作为碱基。
前述未修饰的核苷酸残基的前述组分例如与天然存在的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。具体而言，例如，这些组分与人身体中天然出现地的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。
例如，前述修饰的核苷酸残基可以是这样的，从而前述未修饰的核苷酸残基的任何组分受到修饰。前述修饰的核苷酸残基的例子包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。
前述修饰的核苷酸残基可以例如是前述核苷酸的备选物的残基。前述备选物的例子包括人工核酸单体残基。其具体例子包括pna(肽核酸)、lna(锁核酸)和ena(2’-o,4’-c-亚乙基桥接的核酸)。
在前述的核苷酸残基中，前述的碱基不作具体限制。前述的碱基可以例如是天然碱基或非天然碱基。前述的碱基可以例如是天然衍生的碱基或合成碱基。作为前述的碱基，例如，可以使用常见碱基、其修饰的类似物等。
在本发明的天然型mirna中，前述非核苷酸结构的连接子区优选地含有选自由氨基酸残基、多胺残基和多元羧酸残基组成的组的至少一种。前述连接子区可以含有或可以不含有除氨基酸残基、多胺残基和多元羧酸残基之外的残基。例如，前述连接子区可以含有任何多元羧酸残基、对苯二甲酸残基和氨基酸残基。
在本发明中，“多胺”意指含有多个(二个、三个或更多个)氨基的任何化合物。前述“氨基”不限于-nh2基团并且还包括亚氨基(-nh-)。在本发明中，前述多胺不作具体限制，并且其例子包括1,4-二氨基苯、1,3-二氨基苯、1,2-二氨基苯等。另外，在本发明中，“多元羧酸”意指含有多个(二个、三个或更多个)羧基的任何化合物。在本发明中，前述多元羧酸不作具体限制，并且其例子包括1,4-二羧基苯(对苯二甲酸)、1,3-二羧基苯(间苯二甲酸)、1,2-二羧基苯(邻苯二甲酸)等。另外，在本发明中，“氨基酸”意指在分子中含有一个或多个氨基和一个或多个羧基的任何有机化合物，如下文提到。前述“氨基”不限于-nh2基团并且还包括亚氨基(-nh-)。
在本发明的天然型mirna中，前述氨基酸残基可以由多个相互连接的氨基酸残基组成。在本发明中，作为多个相互连接的氨基酸残基的氨基酸残基例如是含有肽结构的残基。更具体地，作为多个相互连接的氨基酸残基的前述氨基酸残基例如是具有下文提到的化学式(i)的氨基酸残基，其中下文提到的化学式(ia)是肽(例如，甘氨酸二聚体或甘氨酸三聚体等)。
在本发明的天然型mirna中，前述的氨基酸残基可以是甘氨酸残基、对苯二甲酸酰胺残基、脯氨酸残基或赖氨酸残基。前述的氨基酸残基可以是修饰的氨基酸残基或氨基酸衍生物。
在本发明的天然型mirna中，前述连接子区例如由以下化学式(i-0)代表。
在前述化学式(i-0)中，
q11和q12各自独立地是单键、ch2(亚甲基)、nh(亚氨基)、c＝o(羰基)、c＝s(硫羰基)、c＝nh(亚氨次甲基(iminomethylenegroup))、o或s，
q1和q2各自独立地是单键、ch2(亚甲基)、nh(亚氨基)、c＝o(羰基)、c＝s(硫羰基)、c＝nh(亚氨次甲基)、o或s，
y1和y2各自独立地是单键、ch2、nh、o或s；
l1是具有n个碳原子的亚烷基链，并且在亚烷基碳原子上的氢原子可以经oh、ora、nh2、nhra、nrarb、sh或sra取代或者可以不经其取代，或者，
l1是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链，
前提是：当y1是nh、o或s时，与l1中的y1结合的原子是碳，与l1中的or1结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻；
l2是具有m个碳原子的亚烷基链，并且在亚烷基碳原子上的氢原子可以经oh、orc、nh2、nhrc、nrcrd、sh或src取代或者可以不经其取代，或者，
l2是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链，
前提是：当y2是nh、o或s时，与l2中的y2结合的原子是碳，与l2中的or2结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻；
ra、rb、rc和rd各自独立地是取代基或保护基；
m是从0至30的整数；
n是从0至30的整数；
前述x区和前述y区各自借助-or1-或-or2-与前述连接子残基(linkerresidue)连接，
其中r1和r2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，r1和r2各自独立地是核苷酸残基或前述结构(i-0)；并且
a是任何原子团。
前述x区和前述y区与-or1-和-or2-的组合不作具体限制，并且可以例如是任何以下情况。
条件(1)：
前述x区和前述y区分别借助-or2-和-or1-与前述式(i)的结构连接。
条件(2)：
前述x区和前述y区分别借助-or1-和-or2-与前述式(i)的结构连接。
在前述化学式(i-0)中，例如，q11可以是c＝o(羰基)，并且q1可以是nh(亚氨基)。此外，例如，q11可以是nh(亚氨基)，并且q1可以是c＝o(羰基)。另外，例如，q12可以是c＝o(羰基)，并且q2可以是nh(亚氨基)。另外，例如，q12可以是nh(亚氨基)，并且q2可以是c＝o(羰基)。
在前述化学式(i-0)中，每个q11和q12可以例如是羰基。在这种情况下，每个q1和q2优选地是亚氨基。此外，在这种情况下，以下化学式(iα)的结构更优选地由以下化学式(iα2)代表。
在前述化学式(iα2)中，
r100是任何取代基，其可以存在或可以不存在。当它是存在时，它可以存在单个或多个。当它存在多个时，它们可以彼此相同或不同。前述任何取代基r100的例子包括下文提到的作为前述ra、rb、rc和rd例举的取代基。其更多的具体例子包括卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基(cyclylalkyl)、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述化学式(iα2)的结构更优选地由以下化学式(iα3)代表。
当q11和q12是羰基并且q1和q2是亚氨基时，前述化学式(i-0)的连接子残基可以是羧酸酰胺残基或羧酸残基。例如，在下文提到的实施例中“tpa”结构可以是由前述化学式(iα3)代表的对苯二甲酸酰胺残基或对苯二甲酸残基。
在前述化学式(i-0)中，每个q11和q12可以是亚氨基。在这种情况下，每个q1和q2优选地是羰基。在这种情况下，以下化学式(iβ)的结构更优选地由以下化学式(iβ2)代表。
在前述化学式(iβ2)中，
r100是任何取代基，其可以存在或可以不存在。当它是存在时，它可以存在单个或多个。当它存在多个时，它们可以彼此相同或不同。具体而言，例如，它是与前述化学式(iα2)中的r100相同。此外，前述化学式(iβ2)的结构更优选地由以下化学式(iβ3)代表。
在本发明的天然型mirna中，当前述连接子残基是氨基酸残基时，前述氨基酸残基例如由以下化学式(i)代表。以下化学式(i)的结构是由前述化学式(i-0)代表的结构的一个例子。
在前述式(i)中，例如，x1、x2、y1、y2、l1和l2如上文定义。
与前述微rna的序列互补的序列各自借助-or1-或-or2-与前述氨基酸残基结合，
其中r1和r2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，r1和r2各自独立地是核苷酸残基或前述结构(i)；并且
a是任何原子团，前提是以下化学式(ia)是氨基酸或肽。
前述化学式(i)、(iα)或(ia)中的原子团a可以含有或可以不含有例如选自由链原子团、脂环原子团、芳族原子团、杂芳族原子团和杂脂环原子团组成的组的至少一种。尽管前述链原子团不作具体限制，例如，可以提到烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基等。尽管前述脂环原子团不作具体限制，例如，可以提到环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等。尽管前述芳族原子团不作具体限制，例如，可以提到芳基、芳基烷基、烷基芳基、稠环芳基、稠环芳基烷基、稠环烷基芳基等。前述杂芳族原子团不作具体限制，并且其例子包括杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基、稠环杂芳基、稠环杂芳基烷基、稠环烷基杂芳基等。在前述化学式(i)、(iα)或(ia)的原子团a中，每个前述原子团可以或可以不进一步具有取代基或保护基。当前述取代基或保护基为多个时，它们可以相同或不同。前述取代基例如是对前述ra、rb、rc和rd例举的那些，更具体地，例如，卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基例如与对前述ra、rb、rc和rd例举的那些相同。
在本发明中，如上文提到，“氨基酸”指在分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机化合物。前述“氨基”不限于-nh2基团并且还包括亚氨基(-nh-)。例如，在分子中不含有-nh2基团、但含有亚氨基(-nh-)的脯氨酸、羟脯氨酸等包含于本发明的“氨基酸”定义中。在本发明中，如下文提到，前述“氨基酸”可以是天然氨基酸或人工氨基酸。例如，由于下文提到的化学式(ia2)或(ia3)代表的化合物在分子中含有氨基和羧基，所以它涵盖于本发明的“氨基酸”定义中。因此，例如，前述的化学式(i)(其中原子团a是由下文提到的化学式(a2)或化学式(a2a)所示的结构)包含于本发明的“氨基酸残基”定义中。例如，在下文提到的实施例中的“tpa”结构也包含于本发明的“氨基酸残基”定义中。本发明中的“肽”指具有下述结构的有机化合物，在所述结构中，不少于2分子的氨基酸借助肽键结合。前述肽键可以是酸酰胺结构或酸酰亚胺结构。当多个氨基在前述化学式(ia)代表的氨基酸或肽分子中存在时，前述化学式(ia)中明显所示的氨基可以是任何氨基。此外，当多个羧基在前述化学式(ia)代表的羧基酸或肽分子中存在时，前述化学式(ia)中明显所示的羧基可以是任何羧基。
在本发明天然型mirna的前述氨基酸残基中，如上文提到，前述氨基酸可以是天然氨基酸或人工氨基酸。在本发明中，“天然氨基酸”指具有天然存在性结构的氨基酸或其光学异构体。产生前述天然氨基酸的方法不作具体限制，并且例如，它可以从自然界提取或可以合成。另外，在本发明中，“人工氨基酸”指具有不天然出现的结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸是氨基酸，即，含有氨基(在分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的有机化合物)并具有不天然出现的结构的羧酸衍生物。前述人工氨基酸优选地例如不含有杂环。前述氨基酸可以是例如构成蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可以例如是选自由以下组成的组的至少一种：甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和和由以下化学式(ia2)代表的氨基酸，并且可以还具有或可以不具有取代基或保护基。前述取代基的例子包括对前述ra、rb、rc和rd例举的取代基。更具体地，例如，可以提到卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基与例如对前述ra、rb、rc和rd例举的保护基相同。当并非肽的前述化学式(ia)的氨基酸含有异构体如光学异构体、几何异构体、立体异构体等时，可以使用任何异构体。
在前述化学式(ia2)中，r100是任选的取代基并且可以存在或可以不存在。当它存在时，其数目可以是一个或多个，并且当它存在多个时，它们可以相同或不同。前述任选的取代基r100的例子包括例举对前述ra、rb、rc和rd的取代基，更具体地，例如，卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述化学式(ia2)的结构可以例如是以下化学式(ia3)。
当前述化学式(ia)的结构是前述化学式(ia2)时，前述化学式(i)中原子团a的结构由以下化学式(a2)代表。以下化学式(a2)中的r100与前述化学式(ia2)中相同。当前述化学式(ia)的结构是前述化学式(ia3)时，前述化学式(i)中原子团a的结构由以下化学式(a2a)代表。
前述化学式(i)的结构例如是以下化学式(i-1)-(i-7)，其中n和m与前述化学式(i)中的那些相同。
在前述化学式(i-1)-(i-7)中，n和m不作具体限制并且如上文所述。其具体例子包括在前述化学式(i-1)中n＝11及m＝12、或n＝5及m＝4，在前述化学式(i-4)中n＝5及m＝4，在前述化学式(i-6)中n＝4及m＝4，并且在前述化学式(1-7)中n＝5及m＝4。其结构在以下化学式(i-1a)、(i-1b)、(i-4a)、(i-6a)和(i-7a)中显示。
在本发明的天然型mirna中，前述连接子区例如由以下式(ii)代表：
在前述式(ii)中，例如，
x1和x2各自独立地是h2、o、s或nh；
y1和y2各自独立地是单键、ch2、nh、o或s；
r3是与环a上的c-3、c-4、c-5或c-6结合的氢原子或取代基，
l1是具有n个原子的亚烷基链，并且在亚烷基碳原子上的氢原子可以经oh、ora、nh2、nhra、nrarb、sh或sra取代或者可以不经其取代，或者，
l1是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链，
前提是：当y1是nh、o或s时，与l1中的y1结合的原子是碳，与l1中的or1结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻；
l2是具有m个原子的亚烷基链，并且在亚烷基碳原子上的氢原子可以经oh、orc、nh2、nhrc、nrcrd、sh或src取代或者可以不经其取代，或者，
l2是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链，
前提是：当y2是nh、o或s时，与l2中的y2结合的原子是碳，与l2中的or2结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻；
ra、rb、rc和rd各自独立地是取代基或保护基；
l是1或2；
m是从0至30的整数；
n是从0至30的整数；并且
在环a中，环a上除前述c-2之外的一个碳原子可以由氮、氧或硫取代，并且可以在前述环a中含有碳-碳双键或碳-氮双键，
前述x区和前述y区各自借助-or1-或-or2-与前述非核苷酸结构连接，
其中r1和r2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，r1和r2各自独立地是核苷酸残基或前述结构(ii)。
在前述式(ii)中，例如，x1和x2各自独立地是h2、o、s或nh。在前述式(ii)中，“x1是h2”意指x1连同与x1结合的碳原子一起形成ch2(亚甲基)。这同样适用于x2。
在前述式(ii)中，y1和y2各自独立地是单键、ch2、nh、o或s。
在前述式(ii)中，环a中的l是1或2。当l＝1时，环a是5元环，例如，前述的吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架例如是脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，并且通过其二价结构物例举。当l＝2时，环a是6元环，例如，前述的哌啶骨架。在环a中，环a上除c-2之外的一个碳原子可以由氮、氧或硫取代。环a可以在环a中含有碳-碳双键或碳-氮双键。环a例如为l型或d型。
在前述式(ii)中，r3是与环a上的c-3、c-4、c-5或c-6结合的氢原子或取代基。当r3是前述取代基时，取代基r3可以是一个或多个，或可以不存在。当r3存在多个时，它们可以相同或不同。
取代基r3例如是卤素、oh、or4、nh2、nhr4、nr4r5、sh、sr4、氧代基团(＝o)等。
r4和r5例如各自独立地是取代基或保护基，并且可以相同或不同。前述取代基的例子包括卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧烷基、氨烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基等。这同样适用于下文。取代基r3可以选自上文提及的取代基。
前述保护基是例如使高反应性官能团失活的官能团。保护基的例子包括已知的保护基等。关于前述保护基，例如，可以在本文中并入文献中的描述(j.f.w.mcomie,“protectinggroupsinorganicchemistry”,prenumpress,londonandnewyork,1973)。前述保护基不作具体限制，并且其例子包括叔-丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、双(2-乙酰氧乙氧基)甲基(ace)、三异丙基甲硅氧基甲基(tom)、1-(2-氰乙氧基)乙基(cee)、2-氰乙氧基甲基(cem)、甲苯磺酰基乙氧甲基(tem)、二甲氧基三苯甲基(dmtr)等。当r3是or4时，前述保护基不作具体限制，并且其例子包括tbdms基团、ace基团、tom基团、cee基团、cem基团、tem基团等。保护基的其他例子包括含有甲硅烷基的基团。这同样适用于下文。
在前述式(ii)中，l1是具有n个原子的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以经oh、ora、nh2、nhra、nrarb、sh或sra取代或者可以不经其取代。备选地，l1是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链。前述聚醚链例如是聚乙二醇。当y1是nh、o或s时，与l1中的y1结合的原子是碳，与l1中的or1结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻。即，例如，当y1是o时，这个氧原子和l1中的氧原子彼此不相邻，并且or1中的氧原子和l1中的氧原子彼此不相邻。
在前述式(ii)中，l2是具有m个原子的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如可以经oh、orc、nh2、nhrc、nrcrd、sh或src取代或者可以不经其取代。备选地，l2是通过将前述亚烷基链上的至少一个碳原子用氧原子置换获得的聚醚链。当y2是nh、o或s时，与l2中的y2结合的原子是碳，与l2中的or2结合的原子是碳，并且氧原子彼此不相邻。即，例如，当y2是o时，这个氧原子和l2中的氧原子彼此不相邻，并且or2中的氧原子和l2中的氧原子彼此不相邻。
l1的n和l2的m不作具体限制，并且它们各自的下限可以是0，例如，并且其上限不作具体限制。例如如适宜，n和m可以根据前述非核苷酸结构的所需长度设定。例如，从生产成本、产率等的观点看，n和m各自是优选地0至30、更优选地0至20，并且仍更优选地0至15。n和m可以相同(n＝m)或不同。n+m例如是0至30、优选地0至20，并且更优选地0至15。
例如，ra、rb、rc和rd各自独立地是取代基或保护基。前述取代基和前述保护基的例子同上文。
在前述式(ii)中，每个氢原子可以独立地经例如，卤素如cl、br、f、i等取代。
前述x区和前述y区各自例如借助-or1-或-or2-与前述非核苷酸结构结合。这里，r1和r2可以存在或可以不存在。当r1和r2存在时，r1和r2各自独立地是由前述式(ii)代表的核苷酸残基或结构。当r1和/或r2是前述核苷酸残基时，前述非核苷酸结构例如由具有前述式(ii)的结构的前述非核苷酸残基(不包括核苷酸残基r1和/或r2)和前述核苷酸残基形成。当r1和/或r2是由前述式(ii)代表的结构时，前述非核苷酸结构的结构是这样的，从而例如，具有前述式(ii)的结构的两个或更多个前述非核苷酸残基彼此连接。前述式(ii)的结构的数目可以例如是1、2、3或4。当前述结构包括多个前述结构时，前述(ii)的结构可以例如直接连接或通过前述核苷酸残基连接。在另一方面，当r1和r2不存在时，前述非核苷酸结构例如由具有前述式(ii)的结构的前述非核苷酸残基单独形成。
前述x区和前述y区与-or1-和-or2-的组合不作具体限制，并且可以例如是任何以下情况：
条件(1)
前述x区和前述y区分别借助-or2-和-or1-与前述式(ii)的结构连接；
条件(2)
前述x区和前述y区分别借助-or1-和-or2-与前述式(ii)的结构连接；
前述式(ii)的结构的例子包括具有以下式(ii-1)至(ii-9)的结构。在以下式中，n和m与前述式(ii)中相同，在以下式中，q是0-10的整数。
在前述式(ii-1)至(ii-9)中，n、m和q不作具体限制，并且如上文所述。其具体例子是其中n＝8的前述式(ii-1)、其中n＝3的前述(ii-2)、其中n＝4或8的前述式(ii-3)、其中n＝7或8的前述(ii-4)、其中n＝3并且m＝4的前述式(ii-5)、其中n＝8并且m＝4的前述(ii-6)、其中n＝8并且m＝4的前述式(ii-7)、其中n＝5并且m＝4的前述(ii-8)和其中q＝1并且m＝4前述式(ii-9)。前述式(ii-4)的一个实施方案(n＝8)在以下式(ii-4a)中显示，并且前述式(ii-8)的一个实施方案(n＝5、m＝4)在以下式(ii-8a)中显示。
在本发明中，术语“烷基”例如涵盖直链和支链烷基。前述烷基中碳原子的数目不作具体限制，并且例如是1至30、优选地1至6、更优选地1至4。前述烷基的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基等。在它们当中，例如，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基等。
在本发明中，术语“烯基”例如涵盖直链和支链烯基。前述烯基的例子包括具有一个或多个双键的前述烷基等。前述烯基中碳原子的数目不作具体限制，并且例如与前述烷基中相同，优选地是2至8。前述烯基的例子包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
在本发明中，术语“炔基”例如涵盖直链和支链炔基。前述炔基的例子包括具有一个或多个叁键的前述烷基等。前述炔基中碳原子的数目不作具体限制，并且例如与前述烷基中相同，优选地是2至8。前述炔基的例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。前述炔基还可以例如包含一个或多个双键。
在本发明中，术语“芳基”例如涵盖单环芳烃基和多环芳烃基团。前述单环芳烃基的例子包括苯基等。前述多环芳烃基团的例子包括1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基、9-菲基等。在它们当中，例如，优选苯基、萘基如1-萘基和2-萘基等。
在本发明中，术语“杂芳基”例如涵盖单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述杂芳基的例子包括呋喃基(例如，2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(例如，2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(例如，1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(例如，1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(例如，1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(例如，1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(例如，1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(例如，2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(例如，3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(例如，2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(例如，3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(例如，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(例如，3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(例如，2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咱基(furazanyl)(例如，3-呋咱基)、吡嗪基(例如，2-吡嗪基)、噁二唑基(例如，1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(例如，2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(例如，2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(例如，1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(例如，2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(例如，3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(例如，2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(例如，2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(例如，1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(例如，1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(例如，2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(例如，1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(例如，1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(例如，1-吩嗪基、2-吩嗪基)和吩噻嗪基(例如，1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。
在本发明中，例如，术语“环烷基”指环状饱和烃基并且环烷基中碳原子的数目例如是3至15。前述环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接的环状烃基、螺烃基等。在它们当中，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基、桥接的环状烃基等。
在本发明中，“桥接的环状烃基”的例子包括双环并[2.1.0]戊基、双环并[2.2.1]庚基、双环并[2.2.2]辛基和双环并[3.2.1]辛基、三环并[2.2.1.0]庚基、双环并[3.3.1]壬烷、1-金刚烷基、2-金刚烷基等。
在本发明中，“螺烃基”的例子包括螺[3.4]辛基等。
在本发明中，术语“环烯基”例如涵盖不饱和环状脂族烃基并且环烯基中碳原子的数目例如是3至7。前述环烯基的例子包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基等。在它们当中，优选环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。前述术语“环烯基”还例如涵盖在其环中具有不饱和键的桥接的环状烃基和螺烃基。
在本发明中，“芳基烷基”的例子包括苄基、2-苯乙基、萘基甲基等。“环烷基烷基”和“环基烷基”的例子包括环己基甲基、金刚烷基等。“羟烷基”的例子包括羟甲基、2-羟乙基等。
在本发明中，“烷氧基”例如涵盖由任何前述烷基和氧(烷基-o-基团)组成的基团并且其例子包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基等。“烷氧烷基”的例子包括甲氧甲基等。“氨烷基”的例子包括2-氨基乙基等。
在本发明中，“杂环基”的例子包括1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉啶基、3-吡唑啉啶基、4-吡唑啉啶基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基、四氢呋喃基等。
在本发明中，“杂环基烷基”的例子包括哌啶基甲基、哌嗪基甲基等。“杂环基烯基”的例子包括2-哌啶基乙烯基等。“杂芳基烷基”的例子包括吡啶甲基、喹啉-3-基甲基等。
在本发明中，术语“甲硅烷基”涵盖由化学式r3si-代表的基团，其中r独立地可以选自前述烷基、芳基和环烷基。甲硅烷基的例子包括三甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基等。“甲硅氧基”的例子包括三甲基甲硅氧基等。“甲硅氧基烷基”的例子包括三甲基甲硅氧基甲基等。
在本发明中，“亚烷基”的例子包括亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
在本发明中，上述的各种基团可以是取代的。前述取代基的例子包括羟基、羧基、磺基、卤素、烷基卤(卤代烷基，例如，cf3、ch2cf3、ch2ccl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(例如，乙烯基)、炔基(例如，乙炔基)、环烷基(例如，环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(例如，环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(例如，环丙烯基)、环基烷基、羟烷基(例如，羟甲基、羟乙基)、烷氧烷基(例如，甲氧甲基、乙氧甲基、乙氧乙基)、芳基(例如，苯基、萘基)、芳基烷基(例如，苄基、苯乙基)、烷基芳基(例如，对甲基苯基)、杂芳基(例如，吡啶基、呋喃基)、杂芳基烷基(例如，吡啶甲基)、杂环基(例如，哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(例如，吗啉基甲基(morpholylmethyl))、烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤代烷氧基(例如，ocf3)、烯氧基(例如，乙烯氧基、烯丙氧基)、芳氧基(例如，苯氧基)、烷氧羰基(例如，甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基)、芳基烷氧基(例如，苄氧基)、氨基[烷基氨基(例如，甲氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(例如，乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(例如，苄氨基、三苯甲基氨基)、羟氨基]、氨烷基(例如，氨基甲基)、烷基氨烷基(例如，二乙基氨甲基)、氨甲酰基、氨磺酰基、氧代基、甲硅烷基、甲硅氧基烷基等。
本发明的天然型mirna可以例如包含标记物质，并且可以用前述标记物质标记。前述标记物质不作具体限制，并且可以例如是荧光物质、染料、同位素等。前述标记物质的例子包括：荧光团如芘、tamra、荧光素、cy3染料、cy5染料等。前述染料的例子包括alex染料如alexa488等。前述同位素的例子包括稳定同位素和放射性同位素。在它们当中，优选稳定同位素。另外，例如，前述的稳定同位素不改变经其标记的化合物的物理特并且因此具有作为示踪剂的优异特性。前述稳定同位素不作具体限制，并且其例子包括2h、13c、15n、17o、18o、33s、34s和36s。
如上所述，本发明的天然型mirna可以抑制靶基因的前述表达。因此、本发明的天然型mirna可以例如用作治疗基因所致疾病的治疗剂。当本发明的天然型mirna具有抑制引起前述疾病的基因表达的成熟mirna的引导链序列时，例如，可以通过抑制前述靶基因的表达治疗前述疾病。在本发明中，术语“治疗”涵盖预防前述疾病；改善疾病；及预后的改善，例如，并且它可以意指它们中的任一者。前述疾病不作具体限制，并且例如，前述抑制表达的序列可以根据目的疾病适当地设定。前述疾病的例子包括癌症如乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、胆囊癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、白血病等及疾病如肺纤维化、肝纤维化等。
使用本发明天然型mirna的方法不作具体限制。例如，前述天然型mirna可以施用至具有前述靶基因的受试者。
前述受试者的例子包括细胞、组织和器官。前述受试者的例子还包括人、非人类动物如不包括人类的非人类哺乳动物。前述施用可以例如在体内或在体外进行。前述细胞不作具体限制，并且其例子包括：各种培养的细胞如hela细胞、293细胞、nih3t3细胞、cos细胞等；干细胞如es细胞、造血干细胞等；和从活生物分离的细胞，如原代培养的细胞等。
在本发明中，待抑制其表达的前述靶基因不作具体限制，并且任何期望的基因可以设定成靶基因。如上文提到，前述的成熟mirna可以根据前述靶基因的种类选择。
对于本发明天然型mirna的用途，可以参考以下关于根据本发明待描述的组合物、表达抑制方法、治疗方法等的描述。
由于本发明的天然型mirna可以如上文所述那样抑制靶基因表达，例如，它可用作医药品、诊断剂、农药和在农学、医学、生命科学中实施研究的工具等。
用于合成本发明天然型mirna的方法不作具体限制，并且可以使用生产核酸的常规已知方法。前述合成方法的例子包括根据基因工程方法的合成方法、化学合成方法等。基因工程方法的例子包括：利用体外转录的合成方法；使用载体的方法；使用pcr盒实施的方法等。前述载体不作具体限制，并且其例子包括非病毒载体如质粒等，和病毒载体等。前述的化学合成方法不作具体限制，并且其例子包括亚磷酰胺(phosphoramidite)方法、h-膦酸酯方法等。前述的化学合成方法可以例如使用市售自动化核酸合成仪实施。在前述的化学合成方法中，通常使用亚酰胺(amidite)。前述的亚酰胺不作具体限制。市售亚酰胺的例子包括rna亚磷酰胺(2’-o-tbdmsi，商标，samchullypharm.co.,ltd.)、ace亚酰胺、tom亚酰胺、cee亚酰胺、cem亚酰胺、tem亚酰胺等。
(2)组合物
如上文所述，本发明的表达抑制用组合物是抑制靶基因表达的组合物，其特征在于含有本发明的前述天然型mirna。本发明组合物的特征在于，它含有本发明的前述天然型mirna，并且无论如何，其他构成不作限制。本发明的表达抑制用组合物也可以例如作为表达抑制用试剂提到。
根据本发明，例如，通过向其中存在前述靶基因的受试者施用，可以抑制前述靶基因的表达。
另外，如上文所述，本发明的药物组合物特征在于含有本发明的前述天然型mirna。本发明组合物的特征在于，它含有本发明的前述天然型mirna，并且无论如何，其他构成不作限制。本发明的药物组合物也可以例如作为医药品提到。
根据本发明，例如，向患有因基因所致疾病的患者施用可以抑制前述基因的表达，因而治疗前述疾病。在本发明中，如上文提到，术语“治疗”涵盖预防前述疾病；改善疾病；及预后的改善，例如，并且它可以意指它们中的任一者。
在本发明中，待治疗的疾病不作具体限制，并且其例子包括由基因的表达引起的疾病。取决于前述疾病的种类，引起疾病的基因可以设定为前述的靶基因，并且另外，取决于前述靶基因，可以是选择前述成熟mirna的前述引导链序列。
使用本发明的表达抑制用组合物和药物组合物(下文，这两种组合物简单地称作“组合物”)的方法不作具体限制，并且其例子包括向具有前述靶基因的受试者施用前述天然型mirna。
前述受试者的例子包括细胞、组织和器官。前述受试者的例子还包括人、非人类动物如不包括人类的非人类哺乳动物。前述施用可以例如在体内或在体外进行。前述细胞不作具体限制，并且其例子包括：各种培养的细胞如hela细胞、293细胞、nih3t3细胞、cos细胞等；干细胞如es细胞、造血干细胞等；和从活生物分离的细胞，如原代培养的细胞等。
前述施用方法不作具体限制，并且例如，如果适宜，可以根据受试者确定。当前述受试者是培养的细胞时，施用方法可以例如是使用转染试剂的方法、电穿孔方法等。
例如，本发明的每种组合物可以仅含有本发明的天然型mirna或还可以含有除天然型mirna之外的添加物。前述添加物不作具体限制，并且优选地例如是可药用的添加物。前述添加物的种类不作具体限制，并且例如，如果适宜，可以根据受试者的种类选择。
在本发明的组合物中，例如，前述天然型mirna可以与前述添加物形成复合物。前述添加物也可以例如作为复合化剂提到。前述复合物形成允许例如高效递送前述天然型mirna。
前述复合化剂不作具体限制，并且其例子包括聚合物、环糊精、金刚烷胺(adamantine)等。前述环糊精的例子包括线型环糊精共聚物、线性氧化环糊精共聚物等。
前述添加物的其他例子包括载体、与靶细胞结合的结合物质、缩合剂、融合剂、赋形剂等。
(3)表达抑制方法
如上文所述，根据本发明的表达抑制方法是一种用于抑制靶基因表达的方法，其中特征在于使用本发明的前述天然型mirna。本发明的表达抑制方法的特征在于使用本发明的前述天然型mirna，并且无论如何，其他步骤和条件不作限制。
在本发明的表达抑制方法中，抑制前述靶基因表达的机制不作具体限制，并且其例子包括通过成熟mirna抑制表达。
本发明的表达抑制方法例如包括向其中存在前述靶基因的受试者施用前述天然型mirna的步骤。通过前述施用步骤，例如，使前述天然型mirna与前述受试者接触。前述受试者的例子包括细胞、组织和器官。前述受试者的例子还包括人、非人类动物如不包括人类的非人类哺乳动物。前述施用可以例如在体内或在体外进行。
在本发明的表达抑制方法中，例如，可以施用单独的前述天然型mirna，或可以施用含有前述天然型mirna的本发明前述组合物。前述施用方法不作具体限制，并且如果适宜，可以例如根据受试者的种类选择。
(4)治疗方法
如上所述，用于治疗疾病的本发明方法包括向患者施用本发明的前述天然型mirna的步骤，并且特征在于，前述天然型mirna中的前述引导链序列是抑制引起前述疾病的基因表达的成熟mirna的引导链序列。本发明的治疗方法的特征在于使用本发明的前述天然型mirna，并且无论如何，其他步骤和条件不作限制。
前述本发明的表达抑制方法还适用于例如本发明的治疗方法。前述施用方法不作具体限制并且可以例如是经口施用和非经口施用的任一者。
(5)天然型mirna的用途
根据本发明的使用是本发明的前述天然型mirna用于前述抑制靶基因的表达。
根据本发明的单链核酸是用于治疗疾病的单链核酸。前述单链核酸是本发明的前述天然型mirna，并且特征在于，前述天然型mirna中的前述引导链序列是抑制引起前述疾病的基因表达的成熟mirna的引导链序列。
在下文，将参考实施例等详述本发明。然而，显然易见本发明是无论如何不限于此。
实施例
(实施例1)
基于成熟mir-34a的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000268)，合成具有不同碱基长度的附加序列(间隔子(spacer))的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因axlmrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
合成由下文显示的引导链(seqidno:1)和过客链(seqidno:2)组成的双链人成熟mir-34a(ni-0208)作为阳性对照mirna，并且合成其中前述引导链与前述过客链借助pre-mir-34a的环区的序列连接的单链天然型mir-34a(nm-0004)。
作为阴性对照，合成了由与核酸数据库上记录的全部序列均不互补的序列和与其互补的序列组成的双链rna(ni-0000)。
在前述序列中，星号表示与相应引导链碱基不互补的碱基。
在以下序列中，加下划线的部分是前述的引导链序列，并且小写字母表示前述的过客链序列。
nm-0004(seqidno:11)
5’-uggcagugucuuagcugguuguugugagcaauaguaaggaagcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ni-0208(seqidno:1/seqidno:2)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-3’/5’-caaucagcaaguauacugcccu-3’
ni-0000(seqidno:12/seqidno:13)
5’-uacuauucgacacgcgaagtt-3’/5’-cuucgcgugucgaauaguatt-3’
作为本实施例的天然型mirna，合成了天然型mir-34a，其中由前述引导链(seqidno:1)和附加序列(0、3、5或7碱基长度)组成的x区、和在前述过客链的5’末端具有前述引导链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助以下式的脯氨酸衍生物的非核苷酸结构连接。在合成前述天然型mirna时，通过使用l-脯氨酰二酰胺亚酰胺(l-prolinediamideamidite)引入以下式的脯氨酸衍生物的非核苷酸结构(参见wo2012/017919)。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。此外，“间隔子”后的数字表示前述x区的附加序列的碱基长度。
在以下序列中，加下划线的部分是前述的引导链序列，并且小写字母表示前述的过客链序列。此外，[p]显示前述脯氨酸衍生物的非核苷酸结构。
ph-0036(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[p]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0038(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[p]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0066(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[p]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0068(seqidno:17)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccggcc-[p]-ggccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
(2)测量axl基因的表达水平
将前述每种rna按2μmol/l溶解于注射用蒸馏水(otsukapharmaceuticalco.,ltd.)中，因而配制rna溶液。
作为细胞，使用h1299细胞(atcc)。作为培养基，使用含有10％fbs的rpmi培养基1640(lifetechnologies)。培养条件设定至37℃，5％co2。
首先，在前述培养基中培养细胞，并且将培养液分配至24孔平板，从而每个孔含有400μl培养液以实现密度4×104个细胞/孔。根据随附前述转染试剂的方案，使用(a)转染试剂lipofectaminernaimax(lifetechnologies)，以前述rna转染细胞。具体而言，如下通过设定每孔的组成实施转染。在以下组成中，(b)是opti-mem(lifetechnologies)，(c)是前述2μmol/lrna溶液，添加二者总计98.5μl。前述孔中前述rna的终浓度设定至1nmol/l。
表1
在转染后，将前述孔中的细胞培养24小时，并且随后，使用rneasy微量试剂盒(rneasyminikit)(qiagen，荷兰)根据随其提供的方案，收集rna。随后，通过使用转录子第一链cdna合成试剂盒(transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit)(roche)，根据随其提供的方案，从前述rna合成cdna。随后，如下文显示，使用前述合成的cdna作为模板，实施pcr，并且测量axl基因的表达水平及作为内标物的gapdh基因的表达水平。参比上文提到的gapdh基因，对axl基因的前述表达水平归一化。
使用lightcycler480sybrgreenimaster(商标，roche)作为试剂并使用lightcycler480instrumentii(商标，roche)作为仪器(下文相同)，实施前述pcr。使用以下引物集(primerset)分别扩增前述的axl基因和gapdh基因。axl基因的pcr引物集
(seqidno:18)5’-ctcaaccaggacgactccat-3’
(seqidno:19)5’-agaccgcttcactcaggaaa-3’
gapdh基因的引物集
(seqidno:20)5’-atggggaaggtgaaggtcg-3’
(seqidno:21)5’-gggtcattgatggcaacaatatc-3’
作为对照1，对于已经单独添加100μl前述溶液(b)至前述培养液的细胞，还测量这些基因的表达水平(-)。另外，作为对照2，对于经历与上文相同的转染程序(例外在于不添加前述rna溶液并且添加前述(b)和1.5μl前述(a)，从而总量(a和b)将是100μl)的细胞，还测量这些基因的表达水平(模拟(mock))。
关于归一化axl基因的表达水平，基于对照细胞(-)中作为1的表达水平，测定引入每种rna的细胞中表达水平的相对值。
(3)结果
如图2中所示，本实施例的天然型mir-34a按照与阳性对照成熟mir-34a和pre-mir-34a变体相同的水平抑制axlmrna的表达。此外，甚至改变x区的附加序列的碱基长度时，也维持对axlmrna表达的抑制作用。
(实施例2)
在实施例1的天然型mir-34a(ph-0036)中，修饰连接子区的非核苷酸结构，并且类似地检验到对axlmrna表达的抑制作用。
(1)合成mirna
如下文显示，各自合成以下分子：分子(kh-0006)，其中下式的赖氨酸衍生物的非核苷酸结构由ph-0036的连接子区置换，
分子(xh-0011)，其中下式的甘氨酸衍生物的非核苷酸结构由ph-0036的连接子区置换，
分子(xh-0013)，其中下式的甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构由ph-0036的连接子区置换，
前述化学式(g2)中的glygly是由以下化学式(glygly)代表的原子团，其中末端羰基碳与上文提到的化学式(g2)中的n原子结合，并且如下化学式(glygly)中的末端氮原子与上文提到的化学式(g2)中的羰基碳结合，
(glygly)
-hn-ch2-co-hn-ch2-co-，和
分子(xh-0015)，其中下式的对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构由ph-0036的连接子区置换，
通过使用l-赖氨酸酰胺亚酰胺引入前述赖氨酸衍生物的非核苷酸结构(参见wo2013/103146)，通过使用甘氨酸酰胺亚酰胺引入前述甘氨酸衍生物的非核苷酸结构(参见wo2013/103146)，通过使用甘氨酰甘氨酸酰胺亚酰胺引入前述甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构(参见wo2013/133221)，并且通过使用对苯二甲酸亚酰胺引入前述对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构(参见wo2013/133221)。
在以下序列中，[k]表示前述赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示前述甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，[glygly]表示前述甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[tp]表示前述对苯二甲酸的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，加下划线的部分是前述的引导链序列，其余是前述的附加序列，并且每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，小写字母表示前述的过客链序列。
kh-0006(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[k]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0011(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[gly]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0013(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[glygly]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0015(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[tp]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
类似于实施例1，使用nm-0004和ni-0208作为阳性对照，并且使用ni-0000作为阴性对照。
(2)测量axl基因的表达水平
通过与实施例1中相同的方法，将h1299细胞(atcc)用每种前述rna转染，并且测定axlmrna的表达水平。
(3)结果
如图3中所示，甚至改变连接子区的非核苷酸结构时，也维持对axlmrna表达的抑制作用。
(实施例3)
随后，检验向x区引入附加序列对实施例2中所用的xh-0015的影响，所述xh-0015具有对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构的连接子区。下文显示使用的天然型mir-34a的结构和序列。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。“间隔子”表示前述的x区含有附加序列。
在以下序列中，加下划线的部分是前述的引导链序列，并且小写字母表示前述的过客链序列。[tp]表示前述对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构。
xh-0015(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[tp]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0024(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[tp]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
通过与实施例1中相同的方法，将h1299细胞(atcc)用每种前述rna转染，并且测定axlmrna的表达水平。
作为结果，如图4中所示，甚至将附加序列添加至x区时，也维持对axlmrna表达的抑制作用。
(实施例4)
基于成熟let-7a的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000060)，合成具有不同的连接子区的非核苷酸结构的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因hmga2mrna的表达的抑制性作用。当天然型mirna使用具有脯氨酸衍生物的非核苷酸结构的连接子时，还合成了向x区引入具有附加序列的一种天然型mirna。
(1)合成mirna
合成由下文显示的引导链(seqidno:3)和过客链(seqidno:4)组成的双链人成熟let-7a(ni-0205)作为阳性对照mirna，并且合成其中前述引导链与前述过客链借助pre-let-7a的环区的序列连接的单链天然型let-7a(nm-0003)。
此外，作为阴性对照，使用前述的ni-0000。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。
在以下序列中，加下划线的部分表示前述的引导链序列，并且小写字母表示前述的过客链序列。
nm-0003(seqidno:22)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuuagggucacacccaccacugggagauaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
ni-0205(seqidno:3/seqidno:4)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-3’/5’-cuauacaaucuacugucuuuc-3’
如下文显示，合成了多种天然型let-7a，其中由前述引导链(seqidno:3)和附加序列(0、3碱基长度)组成的x区、和在前述过客链的5’末端具有前述引导链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助前述脯氨酸衍生物([p])、赖氨酸衍生物([k])、甘氨酸衍生物([gly])、甘氨酰甘氨酸衍生物([glygly])或对苯二甲酸衍生物([tp])的连接子连接。在前述的天然型mirna合成中，每个非核苷酸结构按照与实施例1和2相同的方式引入。
在前述序列中，“间隔子”表示前述的x区含有附加序列。
在以下序列中，[p]表示前述脯氨酸衍生物的非核苷酸结构，[k]表示前述赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示前述甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，[glygly]表示前述甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[tp]表示前述对苯二甲酸的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，加下划线的部分是前述的引导链序列，并且其余是前述的附加序列，并且每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，小写字母表示前述的过客链序列。
ph-0011(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[p]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
kh-0003(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[k]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0002(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[gly]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0004(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[glygly]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0006(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[tp]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
ph-0014(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[p]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
(2)测量hmga2基因的表达水平
将前述每种rna按0.2μmol/l溶解于注射用蒸馏水(otsukapharmaceuticalco.,ltd.)中，因而配制rna溶液。
作为细胞，使用a549细胞(dspharmabiomedicalco.,ltd.)。使用含有10％fbs的dmem(lifetechnologies)作为培养基。培养条件设定至37℃和5％co2。
首先，在前述培养基中培养细胞，并且将培养液分配至24孔平板，从而每个孔含有400μl培养液以实现密度4×104个细胞/孔。根据随附前述转染试剂的方案，使用(a)转染试剂lipofectaminernaimax(lifetechnologies)，以前述rna转染细胞。具体而言，如下通过设定每孔的组成实施转染。在以下组成中，(b)是opti-mem(lifetechnologies)，并且(c)是0.2μmol/l前述rna溶液，并且添加二者总计98.5μl。前述孔中前述rna的终浓度设定至0.1nmol/l。
表2
在转染后，将前述孔中的细胞培养24小时，并且随后，使用rneasy微量试剂盒(qiagen，荷兰)根据随其提供的方案，收集rna。随后，通过使用转录子第一链cdna合成试剂盒(roche)，根据随其提供的方案，从前述rna合成cdna。随后，如下文显示，使用前述合成的cdna作为模板，实施pcr，并且测量hmga2基因的表达水平及作为内标物的gapdh基因的表达水平。参比上文提到的gapdh基因，对hmga2基因的前述表达水平归一化。
使用lightcycler480sybrgreenimaster(商标，roche)作为试剂并使用lightcycler480instrumentii(商标，roche)作为仪器(下文相同)，实施前述pcr。使用以下引物集分别扩增前述的hmga2基因和gapdh基因。
hmga2基因的pcr引物集
(seqidno:25)5’-gaagccactggagaaaaacg-3’
(seqidno:26)5’-cttcggcagactcttgtgag-3’
gapdh基因的引物集
(seqidno:20)5’-atggggaaggtgaaggtcg-3’
(seqidno:21)5’-gggtcattgatggcaacaatatc-3’
作为对照1，对于已经单独添加100μl前述溶液(b)至前述培养液的细胞，还测量这些基因的表达水平(-)。另外，作为对照2，对于经历与上文相同的转染程序(例外在于不添加前述rna溶液并且添加前述(b)和1.5μl前述(a)，从而总量(a和b)将是100μl)的细胞，还测量这些基因的表达水平(模拟)。
关于归一化hmga2基因的表达水平，基于对照细胞(-)中作为1的表达水平，测定引入每种rna的细胞中表达水平的相对值。
(3)结果
如图5中所示，本实施例的天然型let-7a按照与阳性对照成熟let-7a和pre-let-7a变体相同的水平抑制hmga2mrna的表达。此外，甚至改变连接子的非核苷酸结构或将附加序列引入x区时，也维持对hmga2mrna表达的抑制作用。
(实施例5)
基于成熟mir-29b的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000105)，合成具有不同的连接子区的非核苷酸结构的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因col1a1mrna的表达的抑制性作用。当天然型mirna使用具有脯氨酸衍生物的非核苷酸结构的连接子时，还合成了向x区引入具有附加序列的一种天然型mirna。
(1)合成mirna
合成由下文显示的引导链(seqidno:9)和过客链(seqidno:10)组成的双链人成熟mir-29b(ni-0210)作为阳性对照mirna，并且合成其中前述引导链与前述过客链借助pre-mir-29b的环区的序列连接的单链天然型mir-29b(nm-0005)。
此外，作为阴性对照，使用前述的ni-0000。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。
在以下序列中，加下划线的部分是前述的引导链序列，小写字母表示前述的过客链序列。
nm-0005(seqidno:27)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuaaauagugauugucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ni-0210(seqidno:10/seqidno:9)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-3’/5’-uagcaccauuugaaaucaguguu-3’
如下文显示，合成了多种天然型mir-29b，其中由前述过客链(seqidno:10)和附加序列(0、3碱基长度)组成的x区、和在前述引导链的5’末端具有前述过客链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助前述脯氨酸衍生物([p])、赖氨酸衍生物([k])、甘氨酸衍生物([gly])、甘氨酰甘氨酸衍生物([glygly])或对苯二甲酸衍生物([tp])的连接子连接。在前述的天然型mirna合成中，每个非核苷酸结构按照与实施例1和2相同的方式引入。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。“间隔子”表示前述的x区含有附加序列。
在以下序列中，[p]表示前述脯氨酸衍生物的非核苷酸结构，[k]表示前述赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示前述甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，[glygly]表示前述甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[tp]表示前述对苯二甲酸的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，小写字母表示前述的过客链序列，其余是前述的附加序列，每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，加下划线的部分表示前述的引导链序列。
ph-0040(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[p]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
kh-0008(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[k]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0017(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[gly]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0019(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[glygly]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0021(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[tp]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0042(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[p]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
作为阴性对照，使用实施例1中合成的ni-0000。
(2)测量col1a1基因的表达水平
将前述每种rna按2μmol/l溶解于注射用蒸馏水(otsukapharmaceuticalco.,ltd.)中，因而配制rna溶液。
作为细胞，使用a549细胞(dspharmabiomedical)。作为培养基，使用含有10％fbs的dmem(lifetechnologies)。培养条件设定至37℃，5％co2。
首先，在前述培养基中培养细胞，并且将培养液分配至24孔平板，从而每个孔含有400μl培养液以实现密度4×104个细胞/孔。根据随附前述转染试剂的方案，使用(a)转染试剂lipofectaminernaimax(lifetechnologies)，以前述rna转染细胞。具体而言，如下通过设定每孔的组成实施转染。在以下组成中，(b)是opti-mem(lifetechnologies)，(c)是前述2μmol/lrna溶液，添加二者总计98.5μl。前述孔中前述rna的终浓度设定至1nmol/l。
表3
在转染后，将前述孔中的细胞培养24小时，并且随后，使用rneasy微量试剂盒(qiagen，荷兰)根据随其提供的方案，收集rna。随后，通过使用转录子第一链cdna合成试剂盒(roche)，根据随其提供的方案，从前述rna合成cdna。随后，如下文显示，使用前述合成的cdna作为模板，实施pcr，并且测量col1a1基因的表达水平及作为内标物的gapdh基因的表达水平。参比上文提到的gapdh基因，对col1a1基因的前述表达水平归一化。
使用lightcycler480sybrgreenimaster(商标，roche)作为试剂并使用lightcycler480instrumentii(商标，roche)作为仪器(下文相同)，实施前述pcr。使用以下引物集分别扩增前述的col1a1基因和gapdh基因。
col1a1基因的pcr引物集
(seqidno:30)5’-cccaaggacaagaggcatgt-3’
(seqidno:31)5’-ccgccatactcgaactggaa-3’
gapdh基因的引物集
(seqidno:20)5’-atggggaaggtgaaggtcg-3’
(seqidno:21)5’-gggtcattgatggcaacaatatc-3’
作为对照1，对于已经单独添加100μl前述溶液(b)至前述培养液的细胞，还测量这些基因的表达水平(-)。另外，作为对照2，对于经历与上文相同的转染程序(例外在于不添加前述rna溶液并且添加前述(b)和1.5μl前述(a)，从而总量(a和b)将是100μl)的细胞，还测量这些基因的表达水平(模拟)。
关于归一化col1a1基因的表达水平，基于对照细胞(-)中作为1的表达水平，测定引入每种rna的细胞中的相对值。
(3)结果
如图6中所示，本实施例的天然型mir-29b按照与阳性对照成熟mir-29b和pre-mir-29b变体相同的水平抑制col1a1mrna的表达。此外，甚至改变连接子的非核苷酸结构或将附加序列引入x区时，也维持对col1a1mrna表达的抑制作用。
(实施例6)
基于成熟mir-34a的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000268)，合成在x区具有不同的连接子区的非核苷酸结构和不同碱基长度的附加序列的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因axlmrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例1中相同的方法，合成了天然型mir-34a(ph-0036、ph-0038、ph-0066和ph-0068)，其中由引导链(seqidno:1)和附加序列(0、3、5或7碱基长度)组成的x区、和在过客链的5’末端具有前述引导链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助脯氨酸衍生物的非核苷酸结构连接。
此外，上文提到的天然型mir-34a，合成了具有碱基长度为0、3或5的附加序列的天然型mir-34a(ph-0036、ph-0038或ph-0066)，其中通过与实施例2中相同的方法修饰连接子区的非核苷酸结构。
在以下序列中，[k]表示赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[tp]表示对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[glygly]表示甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，加下划线的部分是引导链序列，其余是前述的附加序列，并且每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，小写字母表示过客链序列。
kh-0006(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[k]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
kh-0018(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[k]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
kh-0019(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[k]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0015(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[tp]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0024(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[tp]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0042(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[tp]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0011(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[gly]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’xh-0043(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[gly]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0044(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[gly]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0013(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[glygly]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0045(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[glygly]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
xh-0046(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[glygly]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
作为阳性对照，使用实施例1的ni-0208。
(2)测量axl基因的表达水平
通过与实施例1中相同的方法(例外在于前述每种rna的终浓度是2nmol/l)，测定axl基因的表达水平。
(3)结果
如图7中所示，本实施例的天然型mir-34a按照与阳性对照mir-34a变体相同的水平抑制axlmrna的表达。此外，甚至改变连接子的非核苷酸结构或将附加序列引入x区时，也维持对axlmrna表达的抑制作用。
(实施例7)
基于成熟let-7a的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000060)，合成在x区具有不同的连接子区的非核苷酸结构的和不同碱基长度的附加序列的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因hmga2mrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例4中相同的方法，合成了多种天然型let-7a，其中由引导链(seqidno:3)和附加序列(0、3或5碱基长度)组成的x区、和在过客链的5’末端具有前述引导链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助脯氨酸衍生物([p])、赖氨酸衍生物([k])、对苯二甲酸衍生物([tp])、甘氨酸衍生物([gly])或甘氨酰甘氨酸衍生物([glygly])的连接子连接。在前述的天然型mirna合成中，每个非核苷酸结构按照与实施例1和2相同的方式引入。
在以下序列中，[p]表示脯氨酸衍生物的非核苷酸结构，[k]表示赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[tp]表示对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[glygly]表示甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，加下划线的部分是前述的引导链序列，其余是前述的附加序列，并且每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，小写字母表示前述的过客链序列。
ph-0011(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[p]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
ph-0014(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[p]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
ph-0107(seqidno:32)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuccgg-[p]-ccggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
kh-0003(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[k]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
kh-0020(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[k]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
kh-0021(seqidno:32)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuccgg-[k]-ccggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0006(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[tp]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0047(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[tp]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0048(seqidno:32)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuccgg-[tp]-ccggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0002(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[gly]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0049(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[gly]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0050(seqidno:32)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuccgg-[gly]-ccggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0004(seqidno:23)
5’-ugagguaguagguuguauaguu-[glygly]-aacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0051(seqidno:24)
5’-ugagguaguagguuguauaguuucc-[glygly]-ggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
xh-0052(seqidno:32)
5’-ugagguaguagguuguauaguuuccgg-[glygly]-ccggaaacuauacaaucuacugucuuuc-3’
作为阳性对照，使用实施例4的ni-0205。
(2)测量hmga2基因的表达水平
通过与实施例4中相同的方法(例外在于将前述每种rna引入其中的细胞是hepg2(atcc)，以及前述每种rna的终浓度是0.2nmol/l)，测定hmga2基因的表达水平。
(3)结果
如图8中所示，本实施例的天然型let-7a按照与阳性对照pre-let-7a变体相同的水平抑制hmga2mrna的表达。此外，甚至改变连接子的非核苷酸结构或将附加序列引入x区时，也维持对hmga2mrna表达的抑制作用。
(实施例8)
基于成熟mir-29b的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000105)，合成在x区具有不同的连接子区的非核苷酸结构的和不同碱基长度的附加序列的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因col1a1mrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例5中相同的方法，合成了多种天然型mir-29b，其中由过客链(seqidno:10)和附加序列(0、3或5碱基长度)组成的x区、和在引导链的5’末端具有前述过客链的突出端区及与前述附加序列完全互补的序列的y区借助脯氨酸衍生物([p])、赖氨酸衍生物([k])、对苯二甲酸衍生物([tp])、甘氨酸衍生物([gly])或甘氨酰甘氨酸衍生物([glygly])的连接子连接。在前述的天然型mirna合成中，每个非核苷酸结构按照与实施例1和2相同的方式引入。
在以下序列中，[p]表示脯氨酸衍生物的非核苷酸结构，[k]表示赖氨酸衍生物的非核苷酸结构，[tp]表示对苯二甲酸衍生物的非核苷酸结构，[gly]表示甘氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[glygly]表示甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，并且在前述x区中，小写字母表示前述的过客链序列，其余是前述的附加序列，并且每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，加下划线的部分是前述的引导链序列。
ph-0040(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[p]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0042(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[p]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0108(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[p]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
kh-0008(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[k]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
kh-0022(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[k]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
kh-0023(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[k]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0021(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[tp]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0053(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[tp]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0054(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[tp]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0017(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[gly]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0055(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[gly]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0056(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[gly]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0019(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[glygly]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0057(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[glygly]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0058(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[glygly]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
作为阳性对照，使用实施例5的ni-0210。
(2)测量col1a1基因的表达水平
通过与实施例5中相同的方法(例外在于前述每种rna的终浓度是0.5nmol/l)，测定col1a1基因的表达水平。
(3)结果
如图9中所示，本实施例的天然型mir-29b变体按照与阳性对照pre-mir-29b变体相同的水平抑制col1a1mrna的表达。此外，甚至改变连接子的非核苷酸结构或将附加序列引入x区时，也维持对col1a1mrna表达的抑制作用。
(实施例9)
基于成熟mir-34a的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000268)，合成x区中具有不同碱基序列的附加序列(0、3、5或7碱基长度)的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因axlmrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例1中相同的方法，合成了天然型mir-34a，其中由引导链(seqidno:1)和附加序列(0、3、5或7碱基长度)组成的x区、和在过客链的5’末端具有前述引导链的突出端区及与前述附加序列互补(完全互补或部分互补)的序列的y区借助脯氨酸衍生物的非核苷酸结构连接。
在前述序列中，星号表示与相应引导链不互补的碱基。“间隔子”后的数字表示前述x区的附加序列的碱基长度。
在以下序列中，加下划线的部分是前述的引导链序列，并且小写字母表示前述的过客链序列。[p]表示前述脯氨酸衍生物的非核苷酸结构。
ph-0036(seqidno:14)
5’-uggcagugucuuagcugguugu-[p]-acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0038(seqidno:15)
5’-uggcagugucuuagcugguuguucc-[p]-ggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0058(seqidno:34)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuaa-[p]-uuaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0059(seqidno:35)
5’-uggcagugucuuagcugguuguugg-[p]-uuaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0060(seqidno:36)
5’-uggcagugucuuagcugguugucgg-[p]-ccgacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0061(seqidno:37)
5’-uggcagugucuuagcugguugucaa-[p]-uugacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0062(seqidno:38)
5’-uggcagugucuuagcugguugucgg-[p]-uugacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0063(seqidno:39)
5’-uggcagugucuuagcugguuguugg-[p]-ccgacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0064(seqidno:40)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuaa-[p]-uugacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0065(seqidno:41)
5’-uggcagugucuuagcugguuguugg-[p]-uugacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0066(seqidno:16)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccgg-[p]-ccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0067(seqidno:42)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuaauu-[p]-aauuaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0068(seqidno:17)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuccggcc-[p]-ggccggaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
ph-0069(seqidno:43)
5’-uggcagugucuuagcugguuguuaauuaa-[p]-uuaauuaacaaucagcaaguauacugcccu-3’
作为阳性对照，使用实施例1的ni-0208。
(2)测量axl基因的表达水平
通过与实施例1中相同的方法，测定axl基因的表达水平。
(3)结果
如图10中所示，本实施例的天然型mir-34a按照与阳性对照pre-mir-34a变体相同的水平抑制axlmrna的表达。此外，甚至x区中附加序列的碱基序列(3、5或7碱基长度)不同时，也维持对axlmrna表达的抑制作用。
(实施例10)
基于成熟mir-29b的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000105)，合成x区中具有不同碱基序列的附加序列(0、3、5或7碱基长度)的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因col1a1mrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例5中相同的方法，合成了多种天然型mir-29b，其中由过客链(seqidno:10)和附加序列(0、3、5或7碱基长度)组成的x区、和在引导链的5’末端具有前述过客链的突出端区及与前述附加序列互补(完全互补或部分互补)的序列的y区借助脯氨酸衍生物的非核苷酸结构连接。
在前述序列中，“间隔子”后的数字表示前述x区的附加序列的碱基长度。
在以下序列中，连接子的5’侧区是x区，在前述x区中，小写字母表示前述的过客链序列，其余是前述的附加序列，并且连接子的3’侧区是是y区，并且在前述y区中，加下划线的部分是前述的引导链序列。[p]表示前述脯氨酸衍生物的非核苷酸结构。
ph-0040(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[p]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0042(seqidno:29)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaucc-[p]-ggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0109(seqidno:44)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaa-[p]-uuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0110(seqidno:45)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaugg-[p]-uuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0111(seqidno:46)
5’-gcugguuucauauggugguuuagacgg-[p]-ccgucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0112(seqidno:47)
5’-gcugguuucauauggugguuuagacaa-[p]-uugucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0113(seqidno:48)
5’-gcugguuucauauggugguuuagacgg-[p]-uugucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0114(seqidno:49)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaugg-[p]-ccgucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0115(seqidno:50)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaa-[p]-uugucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0116(seqidno:51)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaugg-[p]-uugucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0108(seqidno:33)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccgg-[p]-ccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0117(seqidno:52)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaauu-[p]-aauuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0118(seqidno:53)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauccggcc-[p]-ggccggaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0119(seqidno:54)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaauuaa-[p]-uuaauuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
作为阳性对照，使用实施例5的ni-0210。
(2)测量col1a1基因的表达水平
通过与实施例5中相同的方法(例外在于前述每种rna的终浓度是0.5nmol/l)，测定col1a1基因的表达水平。
(3)结果
如图11中所示，本实施例的天然型mir-29b变体按照与阳性对照pre-mir-29b变体相同的水平抑制col1a1mrna的表达。此外，甚至x区中附加序列的碱基序列(3、5或7碱基长度)不同时，也维持对col1a1mrna表达的抑制作用。
(实施例11)
基于成熟mir-29b的引导链和过客链的序列信息(mirbase登录号mi0000105)，合成在x区具有不同的连接子区的非核苷酸结构的和不同碱基序列的附加序列(0、4或5碱基长度)的本发明多种天然型mirna，引入至培养的细胞，并且检验对靶基因col1a1mrna的表达的抑制性作用。
(1)合成mirna
通过与实施例5中相同的方法，合成了多种天然型mir-29b，其中由过客链(seqidno:10)和附加序列(0、4或5碱基长度)组成的x区、和在引导链的5’末端具有前述过客链的突出端区及与前述附加序列互补(完全互补或部分互补)的序列的y区借助脯氨酸衍生物([p])或甘氨酰甘氨酸衍生物([glygly])的连接子连接。在前述的天然型mirna合成中，每个非核苷酸结构按照与实施例1和2相同的方式引入。
在以下序列中，[p]表示脯氨酸衍生物的非核苷酸结构，并且[glygly]表示甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构。在以下序列中，每个连接子的5’侧区是x区，在前述x区中，小写字母表示前述的过客链序列，其余是前述的附加序列，每个连接子的3’侧区是y区，并且在前述y区中，加下划线的部分是前述的引导链序列。
ph-0040(seqidno:28)
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[p]-ucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0117(seqidno:52)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaauu-[p]-aauuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0120(seqidno:55)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuuu-[p]-aaaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0121(seqidno:56)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuua-[p]-uaaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0122(seqidno:57)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuau-[p]-auaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0123(seqidno:58)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuauu-[p]-aauaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0124(seqidno:59)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauauuu-[p]-aaauaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0125(seqidno:60)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuaa-[p]-uuaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0126(seqidno:61)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuaua-[p]-uauaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0127(seqidno:62)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauauua-[p]-uaauaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0128(seqidno:63)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuaau-[p]-auuaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0129(seqidno:64)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauauau-[p]-auauaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0130(seqidno:65)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuaaa-[p]-uuuaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0131(seqidno:66)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauauaa-[p]-uuauaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0132(seqidno:67)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaaua-[p]-uauuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0133(seqidno:68)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaaau-[p]-auuuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0134(seqidno:69)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaaaa-[p]-uuuuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0135(seqidno:70)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuugg-[p]-uuaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0136(seqidno:71)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuuu-[p]-uuaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0137(seqidno:72)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaauuaa-[p]-uuaauucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0138(seqidno:73)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaauuuu-[p]-aaaauucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0139(seqidno:74)
5’-gcugguuucauauggugguuuagacuuaa-[p]-uuaagucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0140(seqidno:75)
5’-gcugguuucauauggugguuuagacuuuu-[p]-aaaagucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0141(seqidno:76)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaguuaa-[p]-uuaacucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0142(seqidno:77)
5’-gcugguuucauauggugguuuagaguuuu-[p]-aaaacucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0143(seqidno:78)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauaau-[p]-auuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0144(seqidno:79)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuaa-[p]-uuaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0145(seqidno:80)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauugg-[p]-uuaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
ph-0146(seqidno:81)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuu-[p]-uuuaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
xh-0059(seqidno:60)
5’-gcugguuucauauggugguuuagauuuaa-[glygly]-uuaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu-3’
作为阳性对照，使用实施例5的ni-0210。
(2)测量col1a1基因的表达水平
通过与实施例5中相同的方法(例外在于前述每种rna的终浓度是0.5nmol/l)，测定col1a1基因的表达水平。
(3)结果
如图12和图13中所示，本实施例的天然型mir-29b变体按照与阳性对照pre-mir-29b变体相同的水平抑制col1a1mrna的表达。此外，甚至x区中附加序列的碱基序列(4或5碱基长度)不同时，也维持对col1a1mrna表达的抑制作用。
尽管上文已经将参考说明性实施方案描述了本发明，本发明是无论如何不限于此。可以在本发明的构成和细节方面作出本领域技术人员可能显而易见的各种变化变，而不脱离本发明的范围。
此外，本文中援引的任何出版物(包括专利和专利申请)中公开的内容因而按照它们已经在本文公开的程度，通过引用的方式完整并入。
产业上的可利用性
由于本发明的天然型mirna可以按低成本容易地合成，并且可以抑制由前述基因编码的蛋白质翻译，因此，本发明的天然型mirna可例如用作医药品、诊断剂、农药和在农学、医学科学、生命科学中实施研究的工具等。
本申请基于在日本提交的专利申请号2014-266918(申请日：2014年12月27日)和在日本提交的专利申请号2015-130496(申请日：2015年6月29日)，所述文献的内容完整并入本文。
序列表
<110>株式会社博纳克
<120>控制基因表达的天然型mirna及其用途
<130>092400
<150>jp2014-266918
<151>2014-12-27
<150>jp2015-130496
<151>2015-06-29
<160>81
<170>patentinversion3.5
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caaucagcaaguauacugcccu22
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ugagguaguagauuguauaguu22
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<212>rna
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cuauacaaucuauugccuuccc22
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cugguacaggccugggggacag22
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cccu64
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atggggaaggtgaaggtcg19
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gggtcattgatggcaacaatatc23
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cuacugucuuuc72
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ugagguaguagguuguauaguuaacuauacaaucuacugucuuuc45
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uguu64
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<212>rna
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guu63
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guu63
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<213>人工序列
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<223>寡核苷酸
<400>58
gcugguuucauauggugguuuagauuauuaauaaucuagcaccauuugaaaucaguguu59
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<212>rna
<213>人工序列
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<223>寡核苷酸
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<223>寡核苷酸
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gcugguuucauauggugguuuagauuuaauuaaaucuagcaccauuugaaaucaguguu59
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<211>59
<212>rna
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<223>寡核苷酸
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<223>寡核苷酸
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<223>寡核苷酸
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