相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.119(e)要求2014年12月18日提交的美国专利申请no.62/093,663的权益，该申请通过引用并入本文。背景活病毒(诸如单纯疱疹病毒)通常在高于-80℃的储存温度下在延长的时间段内不稳定。缺乏热稳定性为此类病毒，特别是为液体制剂中的治疗性病毒带来挑战。此类治疗性病毒组合物必须冷冻储存和运输，并且在解冻后立即使用以维持其在治疗上有效的感染性。缺乏热稳定性带来增加制造、储存以及运输成本的操作挑战。在制造操作期间，例如冷冻/解冻循环可能导致次优工艺产率和在供应链中缺乏必要的灵活性。储存和运输也是具挑战性的，导致繁杂的处理和复杂的供应链。缺乏热稳定性还带来商业挑战。需要-80℃储存以确保稳定保质期的活病毒组合物为医疗保健提供者带来复杂的储存和处理方案。如果不恰当储存或如果未使用全部产品，那么此类限制增加产品退回的风险。这有可能增加客户的成本。本发明提供一种活病毒制剂，所述活病毒制剂可用于在多个冷冻/解冻循环期间以及在寒冷条件和环境温度下长期储存期间稳定和保持感染性。所述制剂通过提供灵活性而不损失稳定性和/或感染性减少了在病毒的制造、运输、储存以及使用期间的限制。溶瘤免疫治疗领域不断发展已使溶瘤病毒组合物的治疗用途增加。对在一个或多个冷冻/解冻循环期间和/或在刚刚高于冰点至环境温度范围内的温度下以液体状态长期储存期间维持感染性并且提供改善的病毒稳定性的活病毒组合物的任何改进将在操作上是有利的，以及大大增加医疗保健提供者和患者的方便性和灵活性。本发明通过提供此类组合物来满足此需要。发明概述在一个实施方案中，本发明提供一种活病毒组合物，所述活病毒组合物包含单纯疱疹病毒、蛋白质、至少一种糖、氯化钠以及ph7.4的磷酸钠，其中所述组合物为冷冻的。在一个实施方案中，可将组合物在2℃至至少25℃下解冻并且储存。在一个相关实施方案中，在2℃至至少25℃下解冻之后，将活病毒组合物再次冷冻并且在至少-30℃的温度下储存。在另一个实施方案中，可将组合物在2℃至8℃下解冻并且储存。在一个相关实施方案中，在2℃至8℃下解冻之后，将活病毒组合物再次冷冻并且在至少-30℃的温度下储存。在另一个实施方案中，蛋白质为部分水解的明胶或人类血清白蛋白。在另一个实施方案中，部分水解的明胶的浓度为0.01％至1％(w/v)。在另一个实施方案中，人类血清白蛋白的浓度为0.25％至1％。在另一个实施方案中，至少一种糖为山梨糖醇、肌醇或蔗糖。在一个相关实施方案中，山梨糖醇的浓度为2％(w/v)。在一个相关实施方案中，肌醇的浓度为4％(w/v)。在一个相关实施方案中，蔗糖的浓度为9％(w/v)至15％(w/v)。在另一个实施方案中，氯化钠的浓度为145mm。在另一个实施方案中，氯化钠的浓度为约145mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为100mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为约100mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为102mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为约102mm。在另一个实施方案中，部分水解的明胶为猪明胶。在另一个实施方案中，病毒为单纯疱疹病毒1。在另一个实施方案中，单纯疱疹病毒为临床分离物。在另一个实施方案中，单纯疱疹病毒为来自复发性唇疱疹的临床分离物。在另一个实施方案中，单纯疱疹病毒1株选自由js1株、17+株、f株以及kos株组成的组。在另一个实施方案中，单纯疱疹缺乏一个或多个功能性基因。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒缺乏功能性icp34.5-编码基因。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒缺乏功能性icp47-编码基因。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒还缺乏功能性icp6-编码基因、功能性糖蛋白h-编码基因或功能性胸苷激酶-编码基因。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒缺乏功能性vhs-编码基因。在另一相关实施方案中，单纯疱疹病毒缺乏功能性ul43-编码基因。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒缺乏功能性vmw-编码基因、功能性icpo-编码基因、功能性icp4-编码基因、功能性icp22-编码基因或功能性icp27-编码基因。在一个相关实施方案中，已对单纯疱疹病毒进行修饰，使得us11基因作为早期基因被表达。在一个相关实施方案中，单纯疱疹病毒包含一个或多个异源基因和/或病毒基因。在一个相关实施方案中，异源基因和/或病毒基因选自由编码以下物质的基因组成的组：细胞毒素、免疫调节蛋白、肿瘤抗原、前药激活剂、肿瘤抑制剂、前药转化酶、能够引起细胞与细胞融合的蛋白质、tap抑制剂、病毒蛋白us11、反义rna分子或核糖核酸酶。在另一相关实施方案中，异源基因和/或病毒基因选自由编码以下物质的基因组成的组：il-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶脱氨酶、长臂猿白血病融膜糖蛋白、牛疱疹病毒(bhv)ul49.5多肽或病毒蛋白us11。在另一个实施方案中，单纯疱疹病毒选自由以下组成的组：talimogenelaherparepvec、seprehvirtm(hsv-1716)、g207、orienx010、nv1020、m032、immunovex、nsc-733972、hf-10、bv-2711、jx-594、myb34.5、ae-618、brainweltm、heapweltm以及oncovexgalv/cd。在另一个实施方案中，杀灭患者中的肿瘤细胞的方法包括在有效杀灭患者中的肿瘤细胞的条件下向有需要的受试者施用上文所描述的活病毒组合物。在一个相关实施方案中，将活病毒组合物与检查点抑制剂组合施用。在一个相关实施方案中，在检查点抑制剂之前、同时或之后施用活病毒组合物。在一个相关实施方案中，肿瘤细胞选自由以下组成的组：星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺氏细胞瘤(schwannoma)、神经纤维肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、间皮瘤、膀胱癌细胞以及表皮样癌细胞。在一个相关实施方案中，患者为人类。在一个相关实施方案中，通过注射进行施用。在另一个实施方案中，与缺乏蛋白质的相同活病毒组合物相比感染性增加。附图图1.缓冲液和盐含量对冷冻/解冻稳定性的影响。实心菱形，实线：10mmnaphos，空心圆形，短划线，10mmkphos，实心圆形，实线：100mmkphos；实心方形，实线：73mmnacl；空心方形，短划线：0mmnacl以及实心菱形，短划线：对照。图2a.糖浓度对冷冻/解冻稳定性的影响。实心方形，实线：9％山梨糖醇，空心方形，短划线：15％山梨糖醇以及实心菱形，短划线：对照。图2b.糖浓度对冷冻/解冻稳定性的影响。实心方形，实线，9％山梨糖醇，实心三角形，实线：15％蔗糖，空心方形，短划线：9％海藻糖以及空心三角形，短划线：15％海藻糖。图3蛋白质/糖组合对冷冻/解冻期间的稳定性的影响。实心方形，实线：9％蔗糖、2％抗链霉亲和素mab，空心方形，短划线：9％蔗糖、2％phgelatin，实心圆形，实线：4％rhsa，空心圆形，短划线：4％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图4a糖和蛋白质赋形剂对在2-8℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％rhsa，空心方形，短划线：2％phgelatin；实心圆形，实线：15％海藻糖，空心圆形，短划线：15％蔗糖，实心三角形，实线：9％蔗糖、2％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图4b糖和蛋白质赋形剂对在25℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％rhsa，空心方形，短划线：2％phgelatin，空心圆形，短划线：15％蔗糖，实心三角形，实线：9％蔗糖和2％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图5rhsa和phgelatin浓度对冷冻/解冻循环期间的稳定性的影响。实心方形，实线：1％rhsa，实心三角形，实线：2％rhsa，实心圆形，实线：4％rhsa，空心方形，短划线：1％phgelatin，空心三角形，短划线：2％phgelatin，空心圆形，短划线：4％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图6arhsa和phgelatin浓度对在25℃下的液体储存期间的稳定性的影响。实心方形，实线：1％rhsa，实心三角形，实线：2％rhsa，实心圆形，实线：4％rhsa，空心方形，短划线：1％phgelatin，空心三角形，短划线：2％phgelatin，空心圆形，短划线：4％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图6brhsa和phgelatin浓度对在2-8℃下的液体储存期间的稳定性的影响。实心方形，实线：1％rhsa，实心三角形，实线：2％rhsa，实心圆形，实线：4％rhsa，空心方形，短划线：1％phgelatin，空心三角形，短划线：2％phgelatin以及空心圆形，短划线：4％phgelatin，实心菱形，短划线：对照。图7a不同等级和来源的rhsa对在25℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％phgelatin，实心圆形，实线：2％sigma，空心三角形，短划线：2％novozymealpha，空心圆形，短划线：2％novozymealbix以及空心菱形，短划线：2％novozymeprime。图7b不同等级和来源的rhsa对在25℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％phgelatin，实心圆形，实线：2％sigma，空心三角形，短划线：1％novozymealpha，空心圆形，短划线：2％novozymealpha以及空心菱形，短划线：4％novozymealpha。图7c不同等级和来源的rhsa对在25℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％phgelatin，实心圆形，实线：2％sigma，空心三角形，短划线：1％novozymealbix，空心圆形，短划线：2％novozymealbix以及空心菱形，短划线：4％novozymealbix。图7d不同等级和来源的rhsa对在25℃下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：2％phgelatin，实心圆形，实线：2％sigma，空心三角形，短划线：1％novozymeprime，空心圆形，短划线：2％novozymeprime以及空心菱形，短划线：4％novozymeprime。图8a0.25–1.0％phgelatin对在106pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8b.0.25–1.0％phgelatin对在108pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8c0.25–1.0％phgelatin对在2-8℃下在106pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8d0.25–1.0％phgelatin对在2-8℃下在108pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8e0.25–1.0％phgelatin对在25℃下在106pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8f0.25–1.0％phgelatin对在25℃下在108pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％phgelatin，实心圆形，实线：0.5％phgelatin，实心三角形，实线：1.0％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8g.0.01％-0.5％phgelatin对在2-8℃下在106pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.01％phgelatin，实心三角形，实线：0.05％phgelatin，空心圆形，实线：0.1％phgelatin，星形，短划线：0.25％phgelatin。实心圆形，实线：0.5％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图8h.0.01％-0.5％phgelatin对在25℃下在106pfu/ml下的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.01％phgelatin，实心三角形，实线：0.05％phgelatin，空心圆形，实线：0.1％phgelatin，星形，短划线：0.25％phgelatin。实心圆形，实线：0.5％phgelatin以及实心菱形，短划线：对照。图9a.0.25–2.0％对在106pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图9b.0.25–2.0％对在108pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图9c.0.25–2.0％rhsa对在2-8℃下在106pfu/ml下随时间(周)推移的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图9d.0.25–2.0％rhsa对在2-8℃下在108pfu/ml下随时间(周)推移的液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图9e.0.25–2.0％rhsa对在25℃下在106pfu/ml下随时间(天)推移的稳定性液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图9f.0.25–2.0％rhsa对在25℃下在108pfu/ml108pfu/ml下随时间(周)推移的稳定性液体稳定性的影响。实心方形，实线：0.25％rhsa，实心三角形，实线：0.5％rhsa，空心三角形，实线：1.0％rhsa，星形，实线：2.0％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10a在-30℃下在106pfu/ml下的长期冷冻稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10b在-30℃下在108pfu/ml下的长期冷冻稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10c在-70℃下在106pfu/ml下的长期冷冻稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10d在-70℃下在b)108pfu/ml下的长期冷冻稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10e.在106pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10f.在108pfu/ml下在冷冻/解冻循环期间的稳定性。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10g在2-8℃下在106pfu/ml的长期液体稳定性下，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10h在2-8℃下在108pfu/ml下的长期液体稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10i在25℃下在106pfu/ml下的长期液体稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图10j在25℃下在108pfu/ml下的长期液体稳定性，时间以周计。实心方形：0.5％phgelatin，实心圆形：0.5％rhsa以及实心菱形，短划线：对照。图11a.106pfu/ml在2-8℃下的静态储存，时间以周计。实心方形，短划线：缓冲液+0.5％phgelatin，实心圆形，短划线：缓冲液+0.5％rhsa，实心菱形，短划线：缓冲液对照。实心方形，实线：制剂+0.5％phgelatin，实心圆形，实线：制剂+0.5％rhsa以及实心菱形，实线：制剂对照。图11b.将106pfu/ml在-70℃下冷冻，然后在2-8℃下储存(1个冷冻-解冻循环)，时间以周计。实心方形，短划线：缓冲液+0.5％phgelatin，实心圆形，短划线：缓冲液+0.5％rhsa，实心菱形，短划线：缓冲液对照。实心方形，实线：制剂+0.5％phgelatin，实心圆形，实线：制剂+0.5％rhsa以及实心菱形，实线：制剂对照。图12a.108pfu/ml在2-8℃下的静态储存，时间以周计。实心方形，短划线：缓冲液+0.5％phgelatin，实心圆形，短划线：缓冲液+0.5％rhsa，实心菱形，短划线：缓冲液对照。实心方形，实线：制剂+0.5％phgelatin，实心圆形，实线：制剂+0.5％rhsa以及实心菱形，实线：制剂对照。图12b.将108pfu/ml在-70℃下冷冻，然后在2-8℃下储存(1个冷冻-解冻循环)，时间以周计。实心方形，短划线：缓冲液+0.5％phgelatin，实心圆形，短划线：缓冲液+0.5％rhsa，实心菱形，短划线：缓冲液对照。实心方形，实线：制剂+0.5％phgelatin，实心圆形，实线：制剂+0.5％rhsa以及实心菱形，实线：制剂对照。发明详述本文中所描述的发明提供一种活病毒组合物，所述活病毒组合物可用于在多个冷冻/解冻循环期间以及在近冰点和环境温度下长期储存期间稳定和保持感染性。所述组合物通过为冷冻解冻提供灵活性降低了在制造、运输、储存以及使用期间的挑战。本发明活病毒组合物防止活病毒受到在冷冻/解冻循环期间通常发生的损害，并且其在液体状态下提供在2-8℃下或在环境温度下的稳定性，同时在-30℃和更冷的温度下冷冻储存期间维持良好稳定性。疱疹病毒颗粒为一种复杂结构，其由包装在二十面体蛋白衣壳内的双链dna基因组组成，所述二十面体蛋白衣壳包裹在细胞来源的膜双层结构中。夹在衣壳与脂质包膜之间的是被称为被膜的病毒蛋白层[1,2]。膜包膜的存在是许多不同类型的动物病毒的显著特征。在配制组合物以稳定活病毒时，脂质包膜似乎赋予病毒颗粒显著的物理不稳定性，使得难以稳定此类别的病毒，特别是在与诸如腺病毒、呼肠病毒以及脊髓灰质炎病毒的非包膜哺乳动物病毒相比时。举例来说，在2-8℃下储存，5型腺病毒已被证明稳定达2年，而脊髓灰质炎病毒和呼肠病毒则为至少1年[3–5]。痘病毒似乎为唯一的在相似温度下展现出相似程度的储存稳定性的包膜动物病毒。然而，痘病毒在结构上与其他包膜动物病毒不同，因为它含有双重包膜和其他结构差异[6,7]。事实上，如由在存档组织、环境样品中所观察到的长期储存以及干燥样品在2-8℃下持续超过60年的实验室储存所证实，痘病毒是非常稳定的[8–12]。在美国批准的包膜活病毒产品[13]中，除了一种(痘病毒疫苗；acam2000)以外所有均含有phg(表1)(尽管如上文所论述，然而，痘病毒已知在各种环境中特别稳定)。如表1所示，甚至利用phg的活病毒制剂也需要冻干，表明使用phg不足以在例如2-8℃下赋予液体组合物足够的储存稳定性。虽然未冻干，但可在2-8℃下以液体组合物形式储存，不过持续时间相对短，约为18周。相比之下，本发明的组合物允许活病毒液体制剂在2-8℃下展示至少9个月(39周)的储存稳定性，相对于先前的活病毒液体制剂显著增加。表1.美国批准的活病毒产品的稳定性1参见默克公司网站(merckwebsite)上的默克疫苗-储存-处理2参见fda在线批准的疫苗信息(ucm142831)3参见fda在线批准的疫苗信息(ucm294307)4参见新西兰食品安全管理局在线数据表(newzealandmedsafeonlinedatasheet)5参见新西兰食品安全管理局在线数据表6参见fda在线批准的疫苗信息(ucm142812)7参见fda在线批准的疫苗信息(ucm285015)8参见在线epar产品信息9参见cdc2014年9月5日在线发病率和死亡率每周报告本发明的组合物还防止病毒因冷冻解冻损害而失活。冷冻和解冻药物产品或中间产品而不损失效力(或活性)的能力具有巨大的价值，因为它允许制造工艺设计、标记、包装操作、最终产品的供应链分布以及医疗保健提供者处理中的灵活性。举例来说，如果意外解冻或未使用，那么可将防止冷冻-解冻损害的活病毒制剂再冷冻，因此减少药物损失的量。然而，生物制剂通常因冷冻解冻操作而经历一定的损害，并且因此通常限于单个冷冻-解冻循环以使效力损失最小化[14,15]。在表1中所列的活病毒产品之中，没有一种冻干产品可在复溶之后再冷冻。另外，不可被冷冻以供后面的解冻和使用。如图10e和10f中所示，本发明的组合物在10个冷冻-解冻循环中维持效力，而对照分别损失了>2个对数和>1个对数的效价。如图9a和9b中所示，在相对宽范围的pgh浓度内实现了此益处。此外，向本文所描述的组合物中添加phg防止形成可见和亚可见颗粒。产品外观是重要的产品属性；不符合所规定的外观标准的产品可能导致相关病毒批次的拒收或召回。在制造或后面的时间期间(例如在储存期间)形成微粒是所有生物制剂的显著问题。向组合物中添加phg显著减少了在制造之后(图11a和12a)或在冷冻解冻之后(图11b和12b)存在于最终产品中的微粒的量。应注意，在不存在phg的情况下，组合物展现出高水平的微粒。这似乎是对phg在如此显著的程度上防止微粒形成的首次报道。因此，本发明提供一种活病毒组合物，所述活病毒组合物包含单纯疱疹病毒、蛋白质、至少一种糖、氯化钠以及ph7-8的磷酸钠，其中组合物为冷冻的。本发明还提供一种活病毒组合物，所述活病毒组合物包含单纯疱疹病毒、蛋白质、至少一种糖、氯化钠以及ph7.4的磷酸钠，其中组合物为冷冻的。在一个实施方案中，将活病毒组合物在2℃至至少25℃下解冻并且储存。在另一个实施方案中，将活病毒组合物在2℃至25℃下解冻并且储存。在另一个实施方案中，将病毒组合物在2℃至8℃下解冻并且储存。在另一个实施方案中，在解冻之后，将活病毒组合物再冷冻。在另一个实施方案中，在解冻之后，将活病毒组合物再冷冻并且在-30℃或以下的温度下储存。在一些实施方案中，将病毒组合物解冻、储存并且再冷冻(即经历冷冻/解冻循环)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在一些实施方案中，将病毒组合物解冻、储存并且再冷冻(即经历冷冻/解冻循环)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在另一个实施方案中，蛋白质为部分水解的明胶(phg)或人类血清白蛋白。在一些实施方案中，phg的浓度为0.01％至1％(w/v)。在一个实施方案中，部分水解的明胶为猪明胶。在一些实施方案中，phg的浓度为0.01％至4％、0.1％至4％、0.1％至3.5％、0.1％至3％、0.1％至2.5％、0.1％至2％、0.1％至1.5％、0.01％至1％、0.1％至1％、0.2％至1％、0.3％至1％、0.4％至1％、0.3％至0.9％、0.3％至0.8％、0.3％至0.7％、0.3％至0.6％或0.4％至0.6％(w/v)。在一些实施方案中，phg的浓度为约0.01％至约4％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2.5％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1.5％、约0.01％至约1％、约0.1％至约1％、约0.2％至约1％、约0.3％至约1％、约0.4％至约1％、约0.3％至约0.9％、约0.3％至约0.8％、约0.3％至约0.7％、约0.3％至约0.6％或约0.4％至约0.6％(w/v)。在其他实施方案中，phg的浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％或约4％(w/v)。在其他实施方案中，phg的浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％(w/v)。在一个特定实施方案中，phg的浓度为约0.5％(w/v)。在另一个实施方案中，phg的浓度为0.5％(w/v)。在另一特定实施方案中，猪phg的浓度为约0.5％(w/v)。在另一个实施方案中，猪phg的浓度为0.5％(w/v)。在其中蛋白质为人类血清白蛋白的实施方案中，人类血清白蛋白的浓度为约0.25％至约4％、约0.25％至约3.5％、约0.25％至约3％、约0.25％至约2.5％、约0.25％至约2％、约0.25％至约1.5％或约0.25％至约1％(w/v)。在其中蛋白质为人类血清白蛋白的其他实施方案中，人类血清白蛋白的浓度为0.25％至4％、0.25％至3.5％、0.25％至3％、0.25％至2.5％、0.25％至2％、0.25％至1.5％或0.25％至1％(w/v)。在另一个实施方案中，至少一种糖为山梨糖醇、肌醇或蔗糖。在一些实施方案中，山梨糖醇的浓度为2％(w/v)。在其他实施方案中，山梨糖醇的浓度为约2％(w/v)。在其他实施方案中，山梨糖醇的浓度为约0.5％、约1％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约3％约3.5％、约4％、约4.5％或约5％(w/v)。在其他实施方案中，山梨糖醇的浓度为0.5％、1％、1.5％、1.65,1.7％、1.8％、1.9％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、3％3.5％、4％、4.5％或5％(w/v)。在其他实施方案中，山梨糖醇的浓度为约0.01％至约5％、约0.1％至约5％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3％、约1％至约3％、约1.5％至约2.5％、约1.6％至约2.4％、约1.7％至约2.3％、约1.8％至约2.2％或约1.9％至约2.1％(w/v)。在其他实施方案中，山梨糖醇的浓度为0.01％至5％、0.1％至5％、0.5％至5％、0.5％至4％、0.5％至3％、1％至3％、1.5％至2.5％、1.6％至2.4％、1.7％至2.3％、1.8％至2.2％或1.9％至2.1％(w/v)。在其中至少一种糖为肌醇的实施方案中，肌醇的浓度为4％(w/v)。在另一个实施方案中，肌醇的浓度为约4％(w/v)。在其中至少一种糖为蔗糖的实施方案中，蔗糖的浓度为9％(w/v)至15％(w/v)。在另一个实施方案中，蔗糖的浓度为约9％(w/v)至约15％(w/v)。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为145mm。在另一个实施方案中，氯化钠的浓度为约145mm。在一些实施方案中，氯化钠的浓度为10至500mm、10至300mm、50至300mm、50至250mm、100至250mm、100至200mm、100至190mm、100至180mm、110至180mm、120至180mm、120至170mm、130至170mm、130至160mm、140至160mm或140至150mm。在一些实施方案中，氯化钠的浓度为约10至约500mm、约10至约300mm、约50至约300mm、约50至约250mm、约100至约250mm、约100至约200mm、约100至约190mm、约100至约180mm、约110至约180mm、约120至约180mm、约120至约170mm、约130至约170mm、约130至约160mm、约140至约160mm或约140至约150mm。在一些实施方案中，氯化钠的浓度为135mm、136mm、137mm、138mm、139mm、140mm、141mm、142mm、143mm、144mm、145mm、146mm、147mm、148mm、149mm、150mm、151mm、152mm、153mm、154mm或155mm。在一些实施方案中，氯化钠的浓度为约135mm、约136mm、约137mm、约138mm、约139mm、约140mm、约141mm、约142mm、约143mm、约144mm、约145mm、约146mm、约147mm、约148mm、约149mm、约150mm、约151mm、约152mm、约153mm、约154mm或约155mm。在一个实施方案中，磷酸钠的浓度为100mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为约100mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为102mm。在另一个实施方案中，磷酸钠的浓度为约102mm。在一些实施方案中，磷酸钠的浓度为10至500mm、10至300mm、50至300mm、50至250mm、50至150mm、60至140mm、70至130mm、80至120mm、90至110mm、91至109mm、92至108mm、93至107mm、94至106mm、95至105mm、96至104mm、97至103mm、98至102mm或99至101mm。在一些实施方案中，磷酸钠的浓度为约10至约500mm、约10至约300mm、约50至约300mm、约50至约250mm、约50至约150mm、约60至约140mm、约70至约130mm、约80至约120mm、约90至约110mm、约91至约109mm、约92至约108mm、约93至约107mm、约94至约106mm、约95至约105mm、约96至约104mm、约97至约103mm、约98至约102mm或约99至约101mm。在一些实施方案中，磷酸钠的浓度为90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm、100mm、101mm、102mm、103mm、104mm、105mm、106mm、107mm、108mm、109mm或110mm。在一些实施方案中，磷酸钠的浓度为约90mm、约91mm、约92mm、约93mm、约94mm、约95mm、约96mm、约97mm、约98mm、约99mm、约100mm、约101mm、约102mm、约103mm、约104mm、约105mm、约106mm、约107mm、约108mm、约109mm或约110mm。在一个特定实施方案中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含单纯疱疹病毒、部分水解的明胶、山梨糖醇、氯化钠以及ph7-8或ph7.4的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、部分水解的猪明胶、山梨糖醇、氯化钠以及ph7-8或ph7.4的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为约0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为约2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为约145mm的氯化钠以及浓度为约100mm的ph7-8的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为约0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为约2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为约145mm的氯化钠以及浓度为约102mm的ph7-8的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为约0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为约2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为约145mm的氯化钠以及浓度为约100mm的约ph7.4的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为约0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为约2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为约145mm的氯化钠以及浓度为约102mm的约ph7.4的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为约0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为145mm的氯化钠以及浓度为100mm的ph7.4的磷酸钠。在另一个实施方案中，所述组合物包含单纯疱疹病毒1、浓度为0.5％(w/v)的部分水解的猪明胶、浓度为2％(w/v)的山梨糖醇、浓度为145mm的氯化钠以及浓度为102mm的ph7.4的磷酸钠。在上述实施方案中，单纯疱疹病毒1可为talimogenelaherparepvec。如本文所用，术语“约”是指相较于所指示的值变化5％，或在值的范围的情况下，意指相较于此类范围的下限与上限变化5％。在一个实施方案中，与缺乏蛋白质的相同活病毒组合物相比，活病毒组合物的感染性增加。可通过本领域技术人员已知的方法来测量病毒感染性(效价)，包括蚀斑测定，诸如本文所描述的方法。本发明的病毒可源自单纯疱疹病毒1(hsv1)或单纯疱疹2(hsv2)株，或源自其衍生物，优选为hsv1。衍生物包括含有来自hsv1和hsv2株的dna的类型间重组体。本领域中描述了此类类型间重组体，例如thompson等人,(1998)virusgenes1(3)；275286以及meignier等人,(1998)j.infect.dis.159；602614。单纯疱疹病毒株可源自临床分离物。此类病毒株是从被感染的个体诸如具有复发性唇疱疹的那些个体分离的。如美国专利号7,063,835和美国专利号7,223,593中所描述，可就所需能力或特征(诸如在体外和/或体内与标准实验室株相比在肿瘤和/或其他细胞中增强的复制)对临床分离物进行筛选，这些专利各自以全文引用的方式并入。在一个实施方案中，单纯疱疹病毒为来自复发性唇疱疹的临床分离物。单纯疱疹病毒1病毒株包括但不限于js1株、17+株、f株以及kos株、patton株。可对单纯疱疹病毒进行修饰，例如与其前体株相比，使得修饰过的病毒缺乏一个或多个功能性病毒基因。如本文所用，“缺乏功能性”病毒基因意指在单纯疱疹基因组中基因部分或完全缺失、替换、重排或以其他方式改变，使得单纯疱疹病毒不能再由所述基因表达功能性病毒蛋白。可修饰的基因的实例包括编码蛋白质的毒力基因，诸如icp34.5(γ34.5)。icp34.5在hsv感染期间充当毒力因子，限制非分裂细胞中的复制，并且使得病毒不致病。可修饰的另一种病毒基因为编码icp47的基因，所述基因下调主要组织相容性复合物i类在感染宿主细胞表面上的表达，并且与同抗原呈递相关的转运体(tap)的结合阻断了内质网中的抗原肽转运以及mhci类分子的加载。另一种是核苷酸还原酶的大亚基icp6，其参与非分裂细胞中而不是分裂细胞中的核苷酸代谢和病毒dna合成。负责将阿昔洛韦(acyclovir)磷酸化成阿昔洛韦-单磷酸盐的胸苷激酶、病毒粒子反式激活蛋白vmw65、糖蛋白h、vhs、icp43以及编码icp4、icp27、icp22和/或icp0的立即早期基因也可以被修饰。还可进行修饰以改变单纯疱疹病毒基因表达的时间。举例来说，可通过将us11基因放置于us12启动子下而以早期基因形式表达us11，mulvey等人(1999)jvirology,73:4,3375-3385；美国专利号us5824318,mohr和gluzman(1996)embo15:4759-4766。修饰过的单纯疱疹病毒的实例包括但不限于单纯疱疹病毒1型的seprehvirtm(hsv1716)17+株，其具有位于hsv基因组的长重复区的bamhi片段(0至0-02和0-81至0.83图距单位)的每个拷贝内的759bp缺失，去除‘a’序列的18bpdr～元件的一个完整拷贝并且在立即早期(1e)基因1的5'末端上游ll05bp处终止，参见maclean等人,(1991)journalofgeneralvirology79:631-639)。g207，一种源自野生型hsv-1f株的溶瘤hsv-1，其具有在hsv神经毒力的主要决定簇icp34.5基因的两个拷贝的缺失以及大肠杆菌lacz基因在编码感染细胞蛋白6(icp6)的ul39中的失活插入，参见mineta等人(1995)natmed.1:938–943。orienx010，一种单纯疱疹病毒，其具有γ34.5和icp47基因的两个拷贝的缺失以及icp6基因的中断和人类gm-csf基因的插入，参见liu等人,(2013)worldjournalofgastroenterology19(31):5138-5143。nv1020，一种单纯疱疹病毒，其中长(l)区和短(s)区的连接区缺失，包括icp34.5、ul24以及ul56.34,35的一个拷贝。用hsv-2usdna的片段(us2、us3(pk)、gj以及gg)替换缺失区，参见todo等人(2001)procnatlacadsciusa.98:6396–6401。m032，一种单纯疱疹病毒，其具有icp34.5基因的两个拷贝的缺失和白介素12的插入，参见cassady和nessparker,(2010)theopenvirologyjournal4:103-108。talimogenelaherparepvec，其源自临床株hsv-1js1株，以登录号01010209保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(europeancollectionofcellcultures，ecaac)。在talimogenelaherparepvec中，编码icp34.5和icp47的hsv-1病毒基因已为功能性缺失的。icp47的功能性缺失导致us11的早期表达，us11是一种在肿瘤细胞中促进病毒生长而不降低肿瘤选择性的基因。人类gm-csf的编码序列已插入到病毒基因组中，参见liu等人，genether10:292-303,2003。immunovexhsv2，为一种单纯疱疹病毒(hsv-2)，其具有编码vhs、icp47、icp34.5、ul43以及us5的基因的功能性缺失。oncovexgalv/cd，也是源自hsv-1js1株，其中编码icp34.5和icp47的基因已功能性缺失并且编码胞嘧啶脱氨酶和长臂猿白血病融膜糖蛋白的基因代替icp34.5基因插入病毒基因组中。经修饰的单纯疱疹病毒的额外实例包括nsc-733972、hf-10、bv-2711、jx-594、myb34.5、ae-618、brainweltm以及heapweltm。美国专利号us5824318；us6764675；us6,770,274；us7,063,835；us7,223,593；us7749745；us7744899；us8273568；us8420071；us8470577；wipo公布号：wo199600007；wo199639841；wo199907394；wo200054795；wo2006002394；wo201306795；中国专利号：cn128303、cn10230334以及cn10230335；varghese和rabkin,(2002)cancergenetherapy9:967-97以及cassady和nessparker,(2010)theopenvirologyjournal4:103-108中也描述了疱疹病毒株以及如何制备此类株。本发明的单纯疱疹病毒还可包含一个或多个异源基因。异源基因是指要引入病毒基因组的基因，其中此基因通常不存在于病毒基因组中，或为病毒中所表达的来自不同物种的具有不同核酸序列并经由不同的生物化学机制起作用的基因的同系物。异源基因可编码一种或多种蛋白质，例如细胞毒素、免疫调节蛋白(即增强或抑制对抗原的宿主免疫应答的蛋白质)、肿瘤抗原、前药激活剂、肿瘤抑制剂、前药转化酶、能够引起细胞与细胞融合的蛋白质、tap抑制剂反义rna分子或核糖核酸酶。免疫调节蛋白的实例包括例如细胞因子。细胞因子包括白介素，诸如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-20；α、β或γ-干扰素、肿瘤坏死因子α(tnfα)、cd40l、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)以及粒细胞集落刺激因子(g-csf)、趋化因子(诸如嗜中性粒细胞激活蛋白(nap)、巨噬细胞趋化因子和激活因子(mcaf)、rantes以及巨噬细胞炎症肽mip-1a和mip-1b)、补体组分及其受体、免疫系统辅助分子(例如b7.1和b7.2)、粘附分子(例如icam-1、2以及3)以及粘附受体分子。肿瘤抗原包括人类乳头状瘤病毒的e6和e7抗原、ebv来源的蛋白质、粘蛋白(诸如muc1)、黑素瘤酪氨酸酶以及mz2-e。前药激活剂包括硝酸还原酶和细胞色素p450，肿瘤抑制剂包括p53。前药转化酶包括胞嘧啶脱氨酶。能够引起细胞与细胞融合的蛋白质包括长臂猿白血病融膜糖蛋白。tap抑制剂包括牛疱疹病毒(bhv)ul49.5多肽。可用于阻断细胞或病原体mrna的表达的反义rna分子。rna分子可为核糖核酸酶(例如基于锤头或发夹的核糖核酸酶)，其被设计成修复缺陷细胞rna或破坏不需要的细胞或病原体编码rna。还包括向单纯疱疹基因组中插入多个病毒基因，诸如插入编码病毒蛋白us11的基因的一个或多个拷贝。在治疗人类或动物的方法中可使用本发明的活病毒组合物。特别地，在癌症疗法的方法中可使用本发明的活病毒组合物。可使用本发明的活病毒组合物来治疗各种肿瘤和癌症。本发明还提供一种通过向有需要的患者施用有效量的活病毒组合物来治疗所述个体中的肿瘤的方法。如本文所用，术语“患者”或“受试者”可互换使用，并且意指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，诸如牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。优选地，患者为人类。在患者中的任何实体肿瘤的治疗性治疗中可使用本发明的活病毒组合物。举例来说，可向患具有前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、膀胱癌、结肠癌或子宫颈癌；腺癌；黑素瘤；淋巴瘤；神经胶质瘤；肉瘤，诸如软组织肉瘤和骨肉瘤；或头颈癌以及优选膀胱癌的患者施用本发明的活病毒组合物。可使用本发明的活病毒组合物来治疗患者的癌症，包括所有类型的癌症、赘瘤或恶性肿瘤，包括白血病、癌以及肉瘤。示例性癌症包括乳腺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌以及成神经管细胞瘤。此外，霍奇金氏病(hodgkin’sdisease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma)、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、尿膀胱癌、恶化前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘瘤以及前列腺癌。在某些实施方案中，本文所提供的本发明活病毒组合物可用于杀灭选自由以下组成的组的肿瘤细胞：星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、许旺氏细胞瘤(schwannoma)、神经纤维肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、间皮瘤以及表皮样癌细胞。还可将本发明的活病毒组合物与其他治疗模式组合使用，包括但不限于放射、化疗、热疗、治疗性蛋白质以及手术。可在其他治疗模式之前、同时或之后施用活病毒组合物。治疗性蛋白质包括免疫检查点抑制剂。如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调控t细胞活化或功能。许多检查点蛋白为已知的，诸如ctla-4和其配体cd80和cd86以及pd1与其配体pdl1和pdl2。这些蛋白质负责t细胞应答的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调控和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或源自抗体。检查点抑制剂包括细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)抑制剂。ctla-4的抑制剂包括曲美木单抗(tremelimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10d1、mdx-d010并且以名称yervoytm出售)以及美国专利号5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；以及7,605,238中所描述的抗ctla-4抗体。其他免疫检查点蛋白包括程序性细胞死亡1(pd-1)和程序性细胞死亡配体1和2(pdl1)(pdl2)。抑制pd1和pdl1和pdl2的分子的实例包括纳武单抗(nivolumab)(mdx1106、bms936558、ono4538)，一种通过配体pd-l1和pd-l2结合于pd-1并阻断其活化的完全人类igg4抗体；派姆单抗(pembrolizumab)(拉姆单抗(lambrolizumab)、mk-3475或sch900475)，以keytrudatm出售；mpdl3280a，一种经工程化的抗pdl1抗体(阿特珠单抗(atezolizumab))；ct-011；amp-224；bms-936559(mdx-1105-01和us专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149以及pct公开专利申请号：w003042402、wo2008156712、w02010089411、w02010036959、wo2011066342、wo2011159877、wo2011082400以及wo2011161699中所描述的那些。其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞活化基因-3(lag-3)抑制剂，诸如可溶性ig融合蛋白imp321；b7抑制剂，诸如抗b7-h3抗体mga271。还包括tim3(t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂。医生可施用活病毒组合物，直到达到实现期望效果的剂量。因此，可通过直接注射或其他合适的施用方法以单一剂量或随时间以两次或更多次剂量(其可含有或可不含有相同量的所需分子)施用组合物。可施用本发明的活疫苗组合物例如一次或多于一次，例如在一段时间内以规则间隔来进行。通常，可施用本发明的活病毒组合物，直到患者关于所选择的一种或多种指示剂相对于基线显示医学相关的改善程度。在一个实施方案中，活疫苗组合物包含talimogenelaherparepvec。以第1周的第1天高达4.0ml剂量的106个蚀斑形成单位/ml(pfu/ml)随后在第4周的第1天以及其后每2周(±3天)高达4.0ml剂量的108pfu/ml通过肿瘤内注射至可注射的皮肤、皮下以及淋巴结肿瘤中来施用组合物。要注射到肿瘤中的talimogenelaherparepvec的推荐体积取决于肿瘤的大小。所有可合理注射的病变(可在存在或不存在超声引导的情况下注射的皮肤、皮下以及淋巴结疾病)均应注射单个给药时段可用的最大给药体积。在每次治疗当天，建议注射的优先选择如下：自上次注射以来出现的任何新的可注射肿瘤；根据肿瘤大小，从最大肿瘤开始；现在可注射的任何先前不可注射的肿瘤。除非本文中另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本文所描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常是根据本领域熟知并且如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的常规方法来进行。所识别的所有专利和其他出版物均通过全文引用的方式明确并入本文中。实施例实施例1开发含有猪部分水解明胶(phgelatin)的制剂供与溶瘤病毒一起使用。此制剂防止溶瘤病毒在冷冻条件下长期储存、多个冷冻/解冻循环以及2-8℃和25℃下的液体储存期间发生感染性损失。另外，所述制剂与不含phgelatin的制剂相比减少了可见与亚可见颗粒的形成。此制剂相对于不含phgelatin的制剂在制造、包装以及标记期间提供优势，并且大大增加了医疗保健提供者的方便性和灵活性。样品制备在此实施例中，以106pfu/ml和108pfu/ml的浓度使用溶瘤单纯疱疹病毒(hsv-1)talimogenelaherparepvec(lui等人,(2003)genetherapy,10:292-303)。对于108pfu/ml的病毒浓度，通过以实现期望的最终赋形剂浓度的体积添加浓缩的赋形剂储备溶液(即10-20％w/vphgelatin或重组hsa)来制备样品。对于106pfu/ml的溶瘤hsv-1浓度，通过将108pfu/ml材料简单稀释至所需缓冲液中来制备样品。对于108pfu/ml的溶瘤hsv-1浓度，通过将浓缩的赋形剂储备溶液和缓冲液添加至浓缩的溶瘤hsv-1溶液中来制备样品。将样品储存于即用型2cccrystalzenith树脂小瓶(westpharmaceuticalsinc.exton.pa)中，并且将涂布的氯丁基弹性体塞(west)用密封物(west)密封。蚀斑测定通过将测试样品滴定到易感指示细胞上、观察细胞病变效应(cpe)并且对随后的蚀斑形成单位(pfu)进行计数(检测限≥2.08log10pfu/ml)来定量感染性溶瘤hsv-1的量。简言之，使bhk(幼仓鼠肾；atcc,manassas,va)细胞在补充有l-谷氨酰胺(lifetechnologies,carlsbad,ca)、10％胎牛血清(thermo-fisher,waltham,ma)以及抗生素链霉素和青霉素(lifetechnologies,carlsbad,ca)的dmem(lifetechnologies,carlsbad,ca)中增殖。在测试前一天将bhk细胞接种在12孔板中。将测试样品连续稀释并用于单层感染。在允许病毒吸附的初始孵育期之后，将细胞用含有羧甲基纤维素(cmc)和生长培养基的覆盖培养基覆盖，并且在37℃和5％co2下孵育72小时。随后在吸出接种物并且用pbs洗涤之后将细胞使用0.01％戊二醛溶液(sigma-aldrich,stlouis,mo)固定。然后使用2％结晶紫溶液(sigma-aldrich)将细胞染色以使蚀斑可见。为确定病毒效价，对每一测试样品稀释液所形成的蚀斑进行计数，并且由所测试的重复试验的平均值确定最终效价(log10pfu/ml)。亚可见颗粒分析通过两种技术监测亚可见颗粒：光遮蔽(hiac)和微流成像(mfi)。hiac使用rycohiac颗粒计数器(beckmancoulter,brea,ca)通过光遮蔽监测亚可见颗粒。在测试样品之前分析了15微米标准颗粒计数对照(dukescientific,thermofisherscientific,waltham,ma)。使用四次0.2ml注射来进行亚可见颗粒计数。对最后三次读数取平均值，并且以每毫升的累积计数的形式进行报道。mfi在装配有100μm硅烷涂布型流动池的微流成像(mfi)仪器(4200proteinsimple,santaclara,ca)上进行亚可见颗粒分析。在每次测量之前，将水冲洗通过系统以优化照明并且提供明确的基线。对于每个样品，以0.2ml/min的流速将总共1ml泵送通过细胞。使用前0.35ml来吹扫流动池，并且分析剩余的0.65ml。报道了≥2μm的颗粒总数。冷冻解冻稳定性通过在1和5个冷冻/解冻循环后测试病毒感染性来筛选多个因素。缓冲液和盐已知磷酸钠在冷冻状态下结晶，从而导致在冷冻状态下ph值显著降低。另一方面，磷酸钾不结晶。制剂：2％(w/v)山梨糖醇、4％(w/v)肌醇、145mmnacl以及100mm磷酸钠(ph7.4)充当对照。修改对照制剂，使得磷酸钠的浓度从100mm降至10mm或由10或100mm磷酸钾取代。还测试了其中nacl浓度降至73mm或完全消除的制剂，参见表1。表1.按106pfu/ml来制备样品。如上文所描述，通过蚀斑测定测定感染性(效价)。在-70℃下对样品进行冷冻持续至少1天并且然后解冻至室温持续不超过2小时。对于各个后续冷冻/解冻循环(总共1或5个循环)，将解冻样品在-70℃下再次冷冻至少1天并且然后解冻至室温持续不超过2小时。随着磷酸钠的减少或磷酸钾的取代，在冷冻/解冻循环之后仍见到感染性损失，两者都不被认为提供优于对照的任何优点。类似地，与对照相比，降低nacl的浓度对病毒在冷冻/解冻循环期间的稳定性没有影响。(图1)。糖糖通常用作低温保护赋形剂，因此测试了一系列浓度的不同糖对冷冻/解冻循环期间的溶瘤hsv-1稳定性的影响。修改对照制剂，使得肌醇被去除，并且将山梨糖醇增加至9％或15％(w/v)。在第二组样品中，修改对照制剂，使得肌醇与山梨糖醇均被去除，并且用9％或15％海藻糖(w/v)或9或15％蔗糖(w/v)代替，参见表2。表2按106pfu/ml来制备样品。如上文所描述对样品进行1或5个冷冻-解冻循环。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。含9％和15％山梨糖醇的制剂产生溶瘤hsv-1稳定性的显著增加，并且在5个冷冻/解冻循环之后感染性没有变化。类似地，含15％蔗糖和9％和15％海藻糖的制剂提供针对冷冻/解冻应力的保护。含9％蔗糖的制剂不提供针对冷冻/解冻应力的保护。(图2a和图2b)。糖和蛋白质然后测试了高糖含量和稳定蛋白的组合对冷冻/解冻期间的溶瘤hsv-1稳定性的影响。修改对照制剂，使得肌醇和山梨糖醇被去除，并且用9％蔗糖(w/v)和2％(w/v)抗链霉亲和素mab(内部制备)或2％猪部分水解明胶(phgelatin)(w/v)(gelita,sergeantbluff,ia)代替。在第二组实验中，以添加4％phgelatin(w/v)或4％重组人类血清白蛋白(rhsa)(novozymes,franklinton,nc)(w/v)来维持对照制剂，参见表3。按106pfu/ml来制备样品。对样品进行1或5个冷冻-解冻循环。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。表3添加稳定蛋白rhsa、phgelatin或抗链霉亲和素mab针对冷冻/解冻应力起保护作用，并且在5个冷冻/解冻循环之后无感染性损失。在9％(w/v)蔗糖或2％(w/v)山梨糖醇与4％(w/v)肌醇的对照组合存在下，phgelatin在针对冷冻/解冻应力起保护作用方面同样有效。参见图3。冷冻/解冻稳定性因增加糖含量或因添加稳定蛋白而得到改善。在所有所测试的制剂中，溶瘤hsv-1经受住5个冷冻/解冻循环而不损失感染性，证实三种非常不同的蛋白质可提供针对防冻/解冻压力的保护。在这三种蛋白质中，rhsa和phgelatin提供最佳稳定性，并且因为它们已被批准用于治疗性制剂中，所以选择它们进行进一步研究。液体储存测试针对冷冻/解冻应力起保护作用的那些糖和蛋白质在2-8℃和25℃下对溶瘤hsv-1液体稳定性的影响。在一组实验中，修改对照制剂，使得山梨糖醇和肌醇用15％海藻糖、15％蔗糖或9％山梨糖醇和2％rhsa代替。在另一组实验中，以添加2％rhsa或2％phgelatin来维持对照制剂，参见表4。表4通过在测试制剂中稀释至106pfu/ml，在-70℃下冷冻至少1天并且然后在2-8℃下或在25℃下储存来制备样品。因为溶瘤hsv-1在较高温度下显示降低的稳定性，所以将样品在2-8℃下维持14天，并且在25℃下维持3天以检测制剂之间的差异。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。将山梨糖醇和肌醇用15％海藻糖代替在2-8℃或25℃下在液体储存期间不使溶瘤hsv-1稳定。用15％蔗糖代替产生不一致的结果，在25℃下观察到一定程度的稳定作用，但在2-8℃下观察不到稳定作用。相比之下，在2％山梨糖醇+4％肌醇或9％蔗糖存在下，添加2％rhsa或2％phgelatin在两种温度下在液体储存期间提供良好稳定性，参见图4a和4b。总之，添加稳定蛋白(phgelatin或rhsa)在冷冻/解冻和液体储存期间提供改善的稳定性。修改糖含量在冷冻/解冻期间提供额外的稳定性，但在液体储存期间具有相对小的影响。因此，进一步的努力集中在不同水平和类型的稳定蛋白的影响。实施例2蛋白质浓度改善的冷冻/解冻和液体稳定性的组合将为制造、包装以及标记提供实质性优势。在2-8℃下储存的能力将为医疗保健提供者提供大大改善的灵活性和方便性。以添加1％、2％或4％phgelatin或1％、2％或4％rhsa来维持对照制剂。按106pfu/ml来制备样品。如上文所描述，通过蚀斑测定测定感染性(效价)。如上文所描述对样品进行5个冷冻/解冻循环。改变rhsa和phgelatin的浓度以确定蛋白质浓度对溶瘤hsv-1稳定性的影响。在所测试的整个范围内，phgelatin与rhsa均在冷冻/解冻循环期间提供保护，参见图5。然后测试不同蛋白质浓度对2-8℃和25℃下的溶瘤hsv-1液体稳定性的影响。以添加1％、2％或4％phgelatin或1％、2％或4％rhhsa来维持对照制剂。按106pfu/ml制备样品并且在-70℃下冷冻至少1天(预冷冻)，并且然后在2-8℃和25℃下储存。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。在液体储存期间，phgelatin制剂表现好得多，并且在25℃下在3天之后不损失活性。相比之下，所有含rhsa的制剂在相同时段内均显示感染性损失。另外，含有rhsa的制剂随着rhsa浓度增加在25℃下实际上表现较差。在这段时间内，在2-8℃下几乎未观测到感染性变化；参见图6a和图6b。rhsa等级为确定与类似量的phgelatin相比，具有增加量的rhsa的制剂为何产生较差的稳定性，检查了rhsa本身。假设所述结果可能是归因于rhsa中的组分，诸如污染物或为稳定rhsa而添加的化合物。或者，所述结果可能是归因于rhsa本身的作用。测试了四种不同等级的rhsa在25℃下的液体储存期间稳定溶瘤hsv-1的能力。以添加2％sigma；1％、2％或4％novozymealpha；1％、2％或4％novozymealbix；或1％、2％或4％novozymeprimerhsa来维持对照制剂。另外，还以添加2％phgelatin来制备对照制剂，参见表5。如上文所描述，测试制剂在25℃下的液体稳定性持续2周。表5每个rhsa等级具有不同水平的纯度和旨在稳定rhsa的其他组分。sigma材料为研究级，并且具有最低的稳定效果。来自novozymes的三个等级(alpha、abix及prime)具有显著更高的纯度，但各自具有不同水平的其他组分。novozymerhsa等级提供比sigma等级更佳的稳定性，但在novozymerhsa之间没有差异。另外，当以增加的浓度添加时，所有三种novozymerhsa显示较差的稳定性。最后，rhsa等级表现得不像phgelatin那样好，参见图7a-7d。蛋白质的下限进行进一步的筛选以确定稳定106和108pfu/ml溶瘤hsv-1浓度所需的最小量的rhsa和phgelatin。以添加0.25％、0.5％以及1％w/vphgelatin以及0.25％、0.5％以及1％w/vrhsa(novozymeprime)来维持对照制剂。以106和108pfu/ml的溶瘤hsv-1浓度制备样品。如上文所描述对一组样品进行5个冷冻/解冻循环。如上文所描述，测试两组样品的液体稳定性，一组在2-8℃下持续四周，而另一组在25℃下持续2周。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。在106与108pfu/ml病毒浓度下，在2-8℃和25℃下在冷冻/解冻循环和液体储存期间在所测试的整个范围0.25％-1％w/v内phgelatin提供保护(图8a-8f)。在2-8℃和25℃下在所测试的整个蛋白质浓度范围内在106与108pfu/ml病毒浓度下在液体储存期间所有含rhsa的制剂显示感染性损失，但在冷冻解冻循环期间未见到感染性损失(图9a-9f)。进行额外的筛选，其中在较低水平上测试了phgelatin。以添加0.01％-0.5％(w/v)phgelatin来维持对照制剂。以106和108pfu/ml的溶瘤hsv-1浓度来制备样品并且如上文所描述在2-8℃和25℃下测试液体稳定性。通过蚀斑测定测定感染性(效价)。phgelatin在液体储存期间在所测试的整个蛋白质浓度范围(0.01％-0.5％)内提供保护，参见图8g和8h。长期稳定性进行长期研究以确定含蛋白质制剂与对照制剂相比的稳定性。溶瘤hsv-1在对照制剂中按106pfu/ml和108pfu/ml配制或其中对照制剂含有0.5％(w/v)rhsa或phgelatin。如上文所描述在2-8℃和25℃下在液体储存期间；在-30℃和-70℃下在冷冻储存期间并且如上文所描述在10个冷冻解冻循环期间评估样品。如上文所描述，通过蚀斑测定测定感染性(效价)。在所评估的所有储存条件下，含phgelatin的制剂再次提供优异的稳定性。仅对于在-30℃下(图10a和10b)以及在-70℃下(图10c和10d)以冷冻状态储存并且在进行10个冷冻解冻循环时(图10e和10f)的那些制剂来说，含rhsa的制剂提供类似稳定性(在测定误差以内)。然而，对于以液体状态储存来说，phgelatin制剂显示更佳的稳定效果，这在106pfu/ml溶瘤hsv-1浓度在2-8℃下(图10g和10h)和在25℃下(图10i和10j)储存时最明显。在2-8℃下储存39周之后，含phgelatin的制剂显示1.7个对数损失，而含rhsa的制剂显示2.9个对数损失。在2-8℃下储存12周之后，对照制剂失去所有活性。在25℃下储存4周期间，含phgelatin的制剂显示2.3个对数损失，而含rhsa的制剂显示3.6个对数损失。在25℃下储存2周之后，对照制剂失去所有活性。制剂的颗粒研究通过添加20％(w/v)rhsa或phgelatin(或当量体积的对照制剂缓冲液)达到108pfu/ml病毒和0.5％稳定蛋白的最终浓度来配制溶瘤hsv-1。然后使用无硅油一次性注射器(luerslipcentricti,bellefonte,pa)使溶液穿过0.22μm过滤器(sterivextmemdmillipore,billerica,ma)以产生不含颗粒的原料。如上文所描述，将一组样品在2-8℃下储存(静态)，并且将第二组样品在-70℃下冷冻并且然后在2-8℃下储存(1个冷冻解冻循环)。通过亚可见分析或目视观察来测量颗粒。如通过亚可见分析技术所测量，与对照制剂相比，含有0.5％(w/v)rhsa或phgelatin的制剂显示出减少的颗粒形成(图11a-11b和12a-12b)。另外，在对照制剂中，在108pfu/ml的浓度下溶瘤hsv-1形成可见的颗粒，但在含有0.5％phgelatin或rhsa的制剂中未形成。参考文献1.roizmanb(1982)thefamilyherpesviridae：generaldescription，taxonomyandclassification.thevirusesvola，herpesviruses.newyork：plenumpress.2.mettenleitertc(2002)herpesvirusassemblyandegress.journalofvirology76：1537-1547.3.sokheyj，guptack，sharmab，singhh(1988)stabilityoforalpoliovaccineatdifferenttemperatures.vaccine6：12-13.4.berarda，coombskm(2009)mammalianreoviruses：propagation，quantification，andstorage.currentprotocolsinmicrobiology：15c-l5.evansrk，nawrockidk，isopila，williamsdm，casimirodr，etal(2004)developmentofstableliquidformulationsforadenovirus-basedvaccines.jpharmsci93：2458-2475.6.conditrc，moussatchen，traktmanp(2006)inanutshell：structureandassemblyofthevacciniavirion.advancesinvirusresearch66：31-124.7.mossb(1987)themolecularbiiologyofpoxvruses.themolecularbasisofviralreplication.springer.pp.499-516.8.mccollumam，liy，wilkinsk，karemkl，davidsonwb，etal(2014)poxvirusviabilityandsignaturesinhistoricalrelics.emerginginfectiousdiseases20：177.9.fdafoundmorethansmallpoxvialsinstorageroom(n.d.).available：https：//www.washingtonpost.com/national/health-science/fda-found-more-than-smallpox-vials-in-storage-room/2014/07/16/850d4b12-0d22-1le4-8341-b8072b1e7348_storyhtml.accessed7november2015.10.cdcmediastatementonnewlydiscoveredsmallpoxspecimens(n.d.).available：http：//www.cdc.gov/media/releases/2014/s0708-nihhtml.accessed7november2015，11.rheinbabenfv，gebelj，exnerm，schmidta(2007)environmentalresistance，disinfection，andsterilizationofpoxviruses.poxviruses.springer.pp.397-405.12.essbauers，meyerh，m，pfefferm(2007)long-lastingstabilityofvacciniavirus(orthopoxvirus)infoodandennvironmentalsamples.zoonosesandpublichealth54：118-124.13.completelistofvaccineslicensedforimmunizationanddistributionintheus(n.d.).available：http：//www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/vaccines/approvedproducts/ucm093833.htm.accessed4november2015.14.shiresj(2009)formulationnandmanufacturabilityofbiologics.currentopinioninbiotechnology20：708-714.15.kueltzola，wangw，randolphtw，carpenterjf(2008)effectsofsoiutionconditions，processingparameters，andcontainerroaterialsonaggregationofamonoclonalantibodydunngfreeze-thawing.jpharmsci97：1801-1812.当前第1页12当前第1页12