本发明属于植物组织工程
技术领域：
。本发明涉及一种植物生物技术克隆工程，特别是针对银杏、红豆杉、铁皮石斛、丹参等药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，以及具有某些药用成分的蔬菜瓜果，例如西瓜，苦瓜等，或者对土地破坏比较严重，例如甘草等植物。
背景技术：
：随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。特别是针对像银杏、红豆杉、铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，其社会效益很大。另一方面，由污染导致的食品安全问题已非常严重，农药残留和重金属超标是中草药植物的一大问题，也亟需解决。随着现代科技进步，植物组织工程方法的优势越来越明显，首先，这种方法不占用土地，节约了耕地资源；其次，不受天气状况影响，产量稳定；第三，无农残重金属残留；第四，可通过人为调整改变目标物质的含量。因此，在污染日益严重，土地资源匮乏的现代社会，通过植物组织工程的高科技手段生产出有效成分含量稳定、过程可控、不消耗过多土地资源的植物原料是大势所趋。本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。针对银杏、红豆杉、铁皮石斛、丹参、西瓜、苦瓜等具体物种，发明了一整套从原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出愈伤组织，直接用愈伤组织或用诱导出的植物愈伤组织进行单细胞悬液制备，再利用组织工程技术对该细胞进行悬浮式的工业化大规模扩增，进而将该方法与人工光源相结合，利用控制温度、酸碱度、氧含量、以及生长调节剂比例等将生产规模扩大到吨级以上的规模。利用本发明的植物悬浮细胞规模培养工艺，其生长速率达到9-50毫克/克·天；相当于自然生长速度的数百甚至数千倍。利用规模化培养基础罐(50升)每7-50天产量可达2-20公斤干品，扩增产能每罐得率均在2.5-25％以上，得干率lo％以上。通过实施本发明的技术工艺，使中药材及某些有疗效的蔬菜水果的生物培养规模从土地种植的低水平向工厂化生产规模转化。同时，由于生产流程得到了良好的控制，使农残重金属几乎检测不到，大大提高了产品长期服用的安全性。技术实现要素：本发明为一种体外规模化悬浮培养扩增细胞的工艺，其培养过程是：植物带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、光源强度及比例、更换培养基成分、以及分批在线收集等手段，最终达到每20-60天收获一次，或者连续、半连续收获，比生物生长速率达9-50毫克/克·天，并保持常年稳定扩增的从20l-吨级单元的大规模植物细胞悬浮培养连续扩增体系。附图说明具体操作为：植物带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待起始胚状体长出后，将胚状体剥离，或待愈伤组织形成后直接剥离愈伤组织，经匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，置于摇床上90-120转/分振荡悬浮培养，获得细胞种子；将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，ph为5-7，固定光源光照12-20h，光照强度2000-8000lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-15天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛胚状体培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与aba的组合，总浓度为在0.05-5mg/l调整。所述基本培养基为ms、1/2ms、1/4ms、b5、n6、nln、white或sh培养基。所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l，总浓度为0.05-5mg/l。优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为iaa/naa/iba0.05-3mg/l:kt0.05-3mg/l:aba0.05-50ug/l，总浓度为0.05-5mg/l。本发明为一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮石斛细胞的工艺，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、更换培养基成分、以及分批在线收集等手段，最终达到每20-50天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，比生物生长速率达9-12毫克/克·天，并保持常年稳定扩增的从20l-吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。培养周期结束后，培养物可一次性收获，或按20％-80％收获率保存种源作连续培养。附图说明附图1，附图简要以流程形式归纳了
发明内容所涵盖的技术要点，悬浮培养植物细胞生产方法流程图。具体实施方式采集植物茎段，灭菌后以幼嫩茎接种到固体培养基上段诱导外植体，在愈伤阶段或者待胚状体诱导形成后，转移到以ms培养基为基础培养基，每升加入5-10克椰汁/苹果汁/香蕉汁，调节ph值至5.8的液体培养基中进行悬浮培养，培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-8000lx，光照时间12-20h/天。待胚状体适应悬浮培养后，将胚状体或愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，继续悬浮培养至稳定增值体系，按10-30％接种至大规模生物反应器中，培养周期为25-60天，或者连续培养。红蓝光比例前一段周期是2-3:4-5，后一段红蓝光比例为3-4:4-6，每阶段交替变换，每一阶段培养时间为10-15天，光强范围为2000-8000lx。大规模生物反应器中的培养基为基本培养基中加入了一定比例混合的生长素、细胞分裂素或者生长素、细胞分裂素以及脱落酸，生长素可以是iaa，iba，naa，细胞分裂素可以是6-ba，kt，zt，脱落酸为aba。生长素浓度为0.05-5mg/l，细胞分裂素浓度为0.05-5mg/l，aba浓度为0.01-2mg/l。培养基在10-25天时换液一次，换液前后生长素与细胞分裂素组合均为：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l。更优选的方案是，换液前生长素与细胞分裂素组合均为：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l，换液后生长素与细胞分裂素、脱落酸组合为：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:kt0.05-3mg/l:aba0.05-50ug/l。培养周期结束后，培养物可一次性收获，或按20％-80％收获率保存种源作连续培养。结合实施案例，对本发明作以阐述，但不是限制本发明的局限性。实施例1.铁皮石斛胚状体的规模化培养方法1.铁皮石斛外植体采集、灭菌：以幼嫩茎接种到固体培养基上段诱导外植体，在愈伤阶段或者待胚状体诱导形成后，转移到以ms培养基为基础培养基，每升加入5-10克椰汁，调节ph值至5.8的液体培养基中进行悬浮培养，培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-8000lx，光照时间12-20h/天。2.愈伤组织的增殖培养基：上述固体培养基接种好外植体三角瓶放在25℃±5，光照强度为2000-4000lx，光照时间10-18h/天，经数天连续培养后，愈伤组织在茎段休眠芽上长出。等到适量大小时，将愈伤组织剥离，转入到固体培养基上，每个三角瓶中放置几个愈伤组织块，进一步促进愈伤组织的增殖。3.铁皮石斛细胞悬浮培养基及筛选程序：a.悬浮培养基：上述固体培养基改变成液体培养基，同上述一样条件灭菌；b.铁皮石斛细胞悬浮培养：在上述固体培养基中长成足够量的愈伤组织后，将愈伤组织进行匀浆酶解消化，使其成为单细胞悬液，按一定接种率接种到三角瓶，90～120转/分震荡，25℃±5，光强为2000lx，光照时间10-18h/天，视生长情况进行继代。c.符合悬浮培养铁皮石斛细胞的筛选：经过3-4次继代后，仔细挑选增殖快、分散性好的铁皮石斛细胞进行进一步扩增，使每个三角瓶中的培养物形态一致，色泽相似，分散性好的培养体系。d.生长速率测试计算公式：(收获量-接种量)÷培养重量÷收获时培养天数＝生长速率本发明在实施过程经检测，其生长速率达到9-9.5毫克/克·天。e.大规模培养方法培养基中激素总浓度为0.05-5mg/l。培养周期：持续培养。将胚状体种子按10-30％接种比例接种到50l不锈钢生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000lx，红蓝光比例每15天更替一次，由2:5更替为3:5，再更替为2:5，以此模式循环；生长素与细胞分裂素比例控制在3:1即可，每15天更换培养基一次。实施例2.铁皮石斛细胞系的规模化培养方法除步骤e外，其余步骤与实施例1相同。e.大规模培养方法培养基中激素总浓度为0.05-5mg/l。培养周期：50天。将胚状体种子按10-30％接种比例接种到50l不锈钢生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000lx，红蓝光比例每15天更替一次，由2:5更替为3:5，再更替为2:5，以此模式循环；生长素与细胞分裂素比例比例控制在3:1即可，每15天更换培养基一次。每培养25天收获30％，并补充30％新鲜培养液，培养周期结束后全部收获。不同激素组合如表所示,从获得的胚状体内物质含量结果看出，只要生长素与细胞分裂素比例控制在3：1，培养获得的胚状体内多糖含量基本一致，即胚状体内物质含量与激素种类无关，而与培养方式以及生长素与细胞分裂素的比例有关。实施例3.铁皮石斛细胞的多糖测定一、实验方法l、试剂配制(l)乙醇溶液，20ml水中加入无水乙醇80ml。(2)苯酚溶液：称取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀释至looml，混匀，备用(溶液置4℃冰箱可保存一个月)。(3)浓硫酸备用。(4)葡萄糖标准储备液：精密称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1.00809，加水溶解并定容至looml，混匀，置4℃冰箱保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖。(5)葡萄糖标准使用溶液：吸取葡萄糖标准储备液2.ooml，置于looml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置于4℃冰箱中保存。2、实验方法(l)葡萄糖标准曲线制备精密吸取葡萄糖标准使用液o，0.2，0.4，0.6，0.8，l.o，(相当于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg)分别置于25ml比色管中准确补充水至2.oml，加入苯酚溶液2.oml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸loml，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，lcm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线。由标准曲线回归曲线方程图得相关系数。样品测定a.样品提取铁皮石斛胚状体在60℃烘箱中烘干，粉碎，称取约o.lg备用。石斛粉经95％乙醇提取后，按20倍体积水加温90℃，1小时。趁热过滤，收取滤液，减压浓缩，加4倍体积无水乙醇混匀，4000rpm，15min离心，沉淀用80％乙醇洗2遍，最终沉淀物溶于50ml水即为石斛粗多糖溶液。b.多糖测定精密取多糖溶液2.oml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.oml，在旋转混匀器上混匀后，小心加入浓硫酸lo.oml后混匀，置于水浴中煮沸lomin,冷却至室温用分光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，lcm比色皿测定葡萄糖标准溶液和样品(按倍比稀释至合适浓度)吸光度值，做葡萄糖标准曲线图，计算样品中粗多糖含量。c.计算方法根据样品的od值从标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，乘以稀释倍数，换算成总多糖含量，再除以烘干样品的干重，即为每克干重样品中含粗多糖的含量，单位为mg/g。多糖含量＝od值×稀释倍数×样品总体积/样品干重二、铁皮石斛细胞多糖测定结果实验对不同培养天数的铁皮石斛细胞团及其培养上清中的多糖含量进行了定量测定.结果表明：所测材料中的多糖含量稳定，其中20至25天的细胞中多糖含量为205-273mg/g干重：占总量的2.3-3.0％。实施例4.铁皮石斛恒定培养方法与阶段培养细胞内物质含量比较将上述培养得到的植物细胞与恒定培养基培养条件下的胚状体进行检测，数据见下表。指标恒定培养阶段培养收获率200克/l280克/l多糖含量170-185mg/g205-273mg/g实施例5.银杏叶细胞的规模化培养工艺(见附图1)1.植物外植体采集、灭菌：以幼嫩叶片为外植体，经过外植体消毒处理，接种到愈伤组织诱导培养基上，经过一段时间的诱导，外植体膨大并产生愈伤组织，将诱导形成的愈伤组织转移到增殖培养基中培养。基本培养基：m6+1/2ms培养基，碳源、果汁、琼脂粉、ph5.8的固体培养基上。培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-6000lx，光照时间12-20h/天。2.愈伤组织的增殖培养基：上述固体培养基接种好外植体三角瓶放在25℃±5，光照强度为2000-4000lx，光照时间10-18h/天，经数天连续培养后，愈伤组织在茎段休眠芽上长出。等到适量大小时，将愈伤组织剥离，转入到固体培养基上，每个三角瓶中放置几个愈伤组织块，进一步促进愈伤组织的增殖。3.植物细胞悬浮培养基及筛选程序：a.悬浮培养基：上述固体培养基改变成液体培养基，同上述一样条件灭菌；b.植物细胞悬浮培养：在上述固体培养基中长成足够量的愈伤组织后，将愈伤组织进行匀浆酶解消化，使其成为单细胞悬液，按一定接种率接种到三角瓶，90～120转/分震荡，25℃±5，光强为2000lx，光照时间10-18h/天，视生长情况进行继代。c.符合悬浮培养植物细胞的筛选：经过3-4次继代后，仔细挑选增殖快、分散性好的植物细胞进行进一步扩增，使每个三角瓶中的培养物形态一致，色泽相似，分散性好的培养体系。d.生长速率测试计算公式：(收获量-接种量)÷培养重量÷收获时培养天数＝生长速率本发明在实施过程经检测，其生长速率达到25-31毫克/克·天。e.银杏叶细胞悬浮大规模培养工艺将植物细胞种子按10％接种比例接种到50l不锈钢生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000lx，前25天红蓝光比例前10-15天为2:5、生长素与细胞分裂素比例为3:1，生长素浓度可以从0.05-5mg/l；后10-25天红蓝光比例为3:5，生长素与细胞分裂素比例为3:1，生长素浓度可以从0.05-5mg/l；每15天更换培养基一次。之后继续培养25天全部收获。实施例6.银杏总黄酮醇苷测定方法一、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇o.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。对照品溶液的制备取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml各含槲皮素30μg、山柰素30μg、异鼠李素20μg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备取本品中粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇回流提取4小时，提取液蒸干，残渣加甲醇25％盐酸溶液(4：1)混合溶液25ml，加热回流30分钟，放冷，转移至50ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51二、测定结果：悬浮大规模培养细胞中总黄酮醇苷含量为0.86-95％。不同激素组合如表所示,从获得的胚状体内物质含量结果看出，只要生长素与细胞分裂素比例控制在3:1，培养获得的胚状体内多糖含量基本一致，即胚状体内物质含量与激素种类无关，而与培养方式以及生长素与细胞分裂素的比例有关。发明人对其它植物：丹参、苦瓜、西瓜等也进行了试验，试验结果表明，本发明的方法同样适用于上述植物，并均达到了较高的生产规模。当前第1页12