本发明涉及一种塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法。属生物技术领域。
背景技术：
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曲霉(Aspergillus)是发酵工业和食品加工业的重要菌种，已被利用的近60种。现代工业利用曲霉生产各种酶制剂(如淀粉酶、蛋白酶、及果胶酶)、有机酸(柠檬酸、葡萄糖酸、及五倍子酸)，农业上用作糖化饲料菌种。塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)被广泛发现于发酵食品中，如普洱茶及黄酒酒曲。塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)是黑色曲霉组(Aspergillus section Nigri)的一种，至2011年，黑色曲霉组已被鉴定和细化为26个种。应用分子生物学方法鉴定黑色曲霉组真菌时，分析比对真菌常用的核糖体rDNA ITS序列的解析度较低，无法区分每一个种；而测定分析钙调蛋白(calmodulin)基因序列和β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列能够区分所有种。
茶褐素(Theabrownins,TB)是指由茶叶中以儿茶素为主的多酚类化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素。它是一类易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有机溶剂的高聚合物质。具有调节血脂异常、抗动脉粥样硬化、抗氧化的作用，是普洱茶的主要活性物质，在普洱熟茶中茶褐素含量平均为12％。
现有技术主要是从经固态发酵后的普洱熟茶中提取茶褐素。但普洱熟茶存在生产周期长(30天以上)、茶褐素含量高低不均、生产过程易污染杂菌、生产过程可控性和自动化差的技术问题。因此，现有的茶褐素提取方法也受到限制。
本发明通过从普洱茶固态发酵中分离而获得塔宾曲霉，用塔宾曲霉KUtea 01接种生产茶褐素。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种生产条件及环境容易控制，且不受茶叶生产季节限制，能实现自动化、效率高、成本低的塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法。
本发明提供的塔宾曲霉，从普洱茶固态发酵中分离、纯化所得。生产菌株为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月20日，保藏号：CGMCC No.10022。
本发明用塔宾曲霉KUtea 01接种生产茶褐素，其生产方法包括以下步骤：
(1)制备绿茶茶汤：按1g:10-50mL的比例将绿茶加入到沸蒸馏水中，沸水浴15分钟，后减压过滤而得到茶汤，将茶汤冷却后定容至10-50mL，在80℃下进行巴氏杀菌30分钟，制得绿茶茶汤；
(2)制备种子培养基：将上述1所述的塔宾曲霉KUtea 01孢子在无菌操作下接种于上述(1)所得到的巴氏杀菌后的绿茶茶汤中，在250rpm，37℃下摇瓶培养24h后得到种子培养基；
(3)液态发酵：按10％的种子培养基接种量将上述(2)所得的种子培养基在无菌操作下接种于上述(1)所得的的巴氏杀菌后的绿茶茶汤中，在30-45℃下，以100-500rpm，摇瓶发酵1-4天后生成茶褐素。
本发明的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01经公知的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)分离、纯化，经可靠的分子生物学测序技术鉴定，其GenBank/EMBL/DDBJ编号分别为：ITS序列(KJ948640)、钙调蛋白(calmodulin)基因序列(KJ948650)、β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列(KJ948652)。
本发明的优点在于：
1、本发明的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01菌株能直接在绿茶茶汤中生长繁殖，无需额外添加任何碳源氮源，并能快速地将绿茶茶汤中的多酚类物质生物转化为大分子水溶性茶褐素。
2、方法生产条件及环境容易控制，且不受茶叶生产季节限制，能实现自动化、效率高、成本低。
具体实施方式：
实施例1：塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01的分离鉴定
(1)固态发酵普洱茶：按400g大叶晒青绿茶(Camellia sinensis var.assamica)喷洒蒸馏水200mL，使茶叶初始水分含量达到35％，用透气性食品薄膜包裹后，置于45℃，相对湿度70％的全自动恒温恒湿发酵箱中发酵14d。在第8天时，翻堆茶叶并适当喷洒补充水分，发酵结束后于60℃下鼓风干燥，得到普洱熟茶。经传统萃取比色法分析测定，所得普洱熟茶样品中茶褐素含量为10％。
(2)真菌的分离、纯化和鉴定：在固态发酵期间，每天取样，采用稀释平板法进行微生物的分离。称取1g样品放入含9mL无菌水的锥形瓶中，150rpm摇床震荡15min。将制备的菌悬液依次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，均匀涂布到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯淀粉4g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、自然pH、在121℃高压锅中灭菌15min)平板上，37℃恒温培养2d后，进行菌落计数。
挑取单菌落进行三点接种纯化培养2-3次后，得到一株纯菌株并命名为KUtea 01，将其划线培养于PDA斜面上，37℃恒温培养2d后转至4℃冰箱中保存，用于后续测序鉴定及液态发酵产茶褐素试验。
菌株的分类鉴定采用分子生物学测序技术。将KUtea 01菌株接种于已121℃高压灭菌15min的20mL YM肉汤中(酵母抽提物3g,麦芽抽提物3g,蛋白胨5g,葡萄糖10g，蒸馏水1000mL),37℃,250rpm摇瓶培养24h。采用离心法(1700g，5min)分离菌丝，并用已灭菌的去离子水冲洗菌丝2次。用公知的CTAB法从新鲜菌丝中提取菌种DNA后，采用引物对ITS1和ITS4，Bt2a和Bt2b,CF1L和CF4分别对真菌的内转录间隔区(ITS)，钙调蛋白(calmodulin)基因和β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行PCR扩增，并测定其序列组成。然后通过序列比对的方式在GenBank数据库中对未知真菌KUtea 01进行鉴定。经鉴定为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，将所得序列提交至GenBank/EMBL/DDBJ数据库，获得编号如下：ITS序列(KJ948640)、钙调蛋白(calmodulin)基因序列(KJ948650)、β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列(KJ948652)。
实施例2：将实施例1所得塔宾曲霉KUtea 01用于液态发酵绿茶茶汤生产茶褐素
(1)绿茶茶汤制备：大叶晒青绿茶(Camellia sinensis var.assamica)，按1g:30mL的比例加入沸蒸馏水，沸水浴15分钟后减压过滤得到茶汤，冷却后定容至30mL。茶汤巴氏杀菌(80℃,30min)后冷却至室温用于后续塔宾曲霉KUtea 01液态发酵生产茶褐素。
(2)种子培养基：将1-2环塔宾曲霉KUtea 01孢子在无菌操作下接种于含25mL上述已巴氏杀菌绿茶茶汤(按1g:30mL的茶水比制备绿茶茶汤)的125mL三角瓶中，在250rpm，37℃下摇瓶培养24h，所得为种子培养基。
(3)液态发酵生产茶褐素：将25mL上述种子培养基在无菌操作下接种于含225mL已巴氏杀菌绿茶茶汤(按1g:30mL的茶水比制备绿茶茶汤)的500mL三角瓶中(即种子培养基接种量10％)，250rpm，40℃下摇瓶培养4d，发酵期间每天取样测定茶褐素含量。结果表明，在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.19、0.73、6.58、11.40、12.44g/L。由于固态发酵14d后，茶褐素含量为10％，经计算对比，采用塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01液态发酵绿茶茶汤生产茶褐素时，容产率比固态发酵高11倍，实现了快速、低成本、高度可控化生产茶褐素。
实施例3：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素温度为30℃，在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.62、0.60、1.92、9.11、10.48g/L。
实施例4：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素温度为37℃，在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.64、0.80、5.22、9.28、11.28g/L。
实施例5：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素温度为42℃，在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.65、0.62、0.73、3.39、6.46g/L。
实施例6：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素温度为45℃，在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.93、0.98、0.97、1.14、4.16g/L。
实施例7：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素时，所用绿茶茶汤的制备是按1g:10mL的比例加入沸蒸馏水，沸水浴15分钟后减压过滤得到茶汤，冷却后定容至10mL。在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为1.13、1.46、3.41、6.68、12.43g/L。
实施例8：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素时，所用绿茶茶汤的制备是按1g:50mL的比例加入沸蒸馏水，沸水浴15分钟后减压过滤得到茶汤，冷却后定容至50mL。在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.42、0.66、4.13、4.41、5.54g/L。
实施例9：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素时，摇床转速为100rpm,在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.19、0.63、5.58、8.40、9.43g/L。
实施例10：
基本同实施例2。与实施例2的不同之处仅在于：液态发酵生产茶褐素时，摇床转速为500rpm,在发酵0d、1d、2d、3d、4d时发酵液中茶褐素浓度分别为0.19、1.73、9.58、12.40、13.44g/L。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南农业大学
<120> 一种塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法
<130> KUtea 01
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 524
<212> DNA
<213> Aspergillus tubingensis
<400> 1
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<212> DNA
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aacttcgtct tcggccagtc cggtgctggt aacaactggg acaagggtca cta 533