早期鉴定‘Hort16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法与流程

本发明属于植物的遗传育种，涉及可早期鉴定植物后代性别的方法。

背景技术：

猕猴桃，藤本，多年生，大多为雌雄异株，为一类植物的总称。在猕猴桃属中，中华猕猴桃‘Hort 16A’果肉呈金黄色，富含不饱和脂肪酸和大量亚麻酸，果肉脆滑香甜，爽口多汁，单果的重量最高140g，每公斤果实中维生素C含量可达1200mg，是公认的优良品种，广泛栽培于亚热带地区，其性别表现有雌株、雄株、雌雄同株三种类型，有些雌株能产生有活力的花粉，有些雄株却不能正常传粉，甚至有能结果的雄株(McNeilage M A.Progress in breeding hermaphrodite kiwifruit cultivars and understanding the genetics of sex determination[J].Biologia Plantarum,1997,39(2):271-280)。对于种子和果实生产，‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代的雌株具有更重要的存在意义，其开放授粉后代遗传了母本的大部分的优良品质，同时后代出现了明显的性别分化，雌株和雄株的数量相当。但是，处于生长期的‘Hort 16A’猕猴桃植株从外部形态上不能区分出植株的性别，性别区分发生在花器官发育的后期差异上。雄花的花柱和柱头停止发育，雌蕊败育不形成胚珠，雄蕊饱满，充满有活力的花粉；雌花的雄蕊败育，几乎被发达似羽扇的花柱和柱头掩盖。然而，从种子播种到开花区分出雌雄，一般需要3～5年的时间。这期间内，没有多少生产意义的雄株不但增加了大量的培育成本，而且延长了杂交育种、改良品种、获得果实、选育雌性植株等的年限。早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株性别成为研究者们探索的重要问题。

现有技术中，SCAR标记、AFLP标记等体系均可在核苷酸水平上比对筛查目标序列。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

以上术语的中英文含义是：

SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions，特征序列扩增区域)标记。

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)标记。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种可早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的方法，或者说，针对‘Hort 16A’猕猴桃的开放授粉后代，通过验证SCAR标记、筛选AFLP标记、筛查SNP标记，在DNA水平上发现该开放授粉后代植株的雌雄鉴别的早期鉴定方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下途径实现：

可早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法，包括以下步骤：

(1)取‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代植株，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA作为样本；

(2)SNP标记的筛选，包括：

针对性别相关基因片段，建立PCR反应体系，配置25μLPCR反应体系，其反应体系以下表的引物序列作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，扩增样本，筛选雌雄株之间的SNP差异：

表1 SNP标记的引物序列

(3)将步骤(2)扩增的核苷酸序列作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，筛选区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别 的SNP标记位点。

进一步，所述的方法是：所述的步骤(2)是针对性别相关基因片段，以引物2-1R：5’ttagcacgctagggtcac3’和2-1F：5’aaggttagggtcgcaagt3’作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，使扩增出的序列具有雌雄之间的SNP差异。

进一步，所述的方法是：所述的步骤(3)是将步骤(2)扩增的295bp核苷酸序列的雄性6号样本(X6)：

作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，以59bp和71bp处作为区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记位点：

其中，59bp处碱基表现为t纯合的为雌性个体，表现为t/c杂合的为雄性个体，71bp处碱基表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的雄性个体。

本发明的有益效果是：

以‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代为研究对象，通过验证SCAR标记、筛选AFLP标记以及筛查SNP标记之分子生物学方法，取得DNA水平的性别标记，提供了中华猕猴桃‘Hort 16A’开放授粉后代植株的雌雄鉴别的一种早期鉴定方法。具体是：

(1)SCAR标记的验证：

参考Gill的研究成果，验证SCAR标记引物在‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株之间的检测率。

(2)基于AFLP标记的分析：

建立AFLP遗传分析体系，比对条带，分析各项遗传参数，寻找与性别相关的AFLP标记。

(3)基于SNP标记的筛查：

通过SNP标记的筛查，找到一对可以在已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株之间稳定扩增的引物；通过PCR扩增和测序比对，找到在雌雄株之间的SNP标记。即引物2-1F和引物2-1R扩增出来约295bp的核苷酸序列中，以雄 性6号样本(X6)为对照序列，59bp和71bp处可作为区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记。其中，59bp处碱基表现为t纯合的雌性个体，表现为t/c杂合的为雄性个体；71bp处碱基表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的雄性个体。

本发明属于国家林业局948项目(2012-4-62)云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y332)和云南省高校林木遗传与繁育重点实验室研究生开放基金项目(YNGB201508)的资助项目。

附图说明

图1为已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代聚类图。图中，C10、CB1、C14、C16、C18、C21、C8、C21、C8、C11、C19、C20、C14、C12、C101、CB2均为雌性个体；X1、X9、X7、X2、X6、X13、X22、X15、X5、X24均为雄性个体。

图2为雌雄株扩增序列比对结果。

图3为通过步骤(2)引物扩增的295bp核苷酸序列的雄性6号样本(X6)。

以下结合附图对本发明做进一步说明。

具体实施方式

1.以‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代已知性别植株为实验材料，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA。

2.SCAR标记的验证

(1)PCR反应体系

根据Gill等(Gill G P,Harvey C F,Gardner R C,et al.Development of sex-linked PCR markers for gender identification in Actinidia[J].Theoretical&Applied Genetics,1998,97(97):439-445)的研究成果，分别验证3对SCAR标记引物：SMX、SMY、SMY1，具体序列见表1。配置25μLPCR反应体系，见表2。

表1SCAR引物序列及Tm值

Table 1The sequences and Tm value of SCAR primers

表2PCR反应体系25μL

Table 2The system of PCR reaction 25μL

(2)PCR扩增条件

将25μL反应体系配制好后，按照下面程序设置好PCR仪，放入样品进行扩增。

扩增完成后，取5μL样品，利用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测；结果拍照记录。统计其在24株已知性别后代样本中的检出率，SMX检出性别的比率为35％，SMY检出性别的比率为60％，SMY1检出性别的比率为80％，检出率都较低。

3.AFLP标记的分析

通过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等一系列过程建立AFLP标记分析体系，其中为了优化实验过程，我们对酶切时间、预扩增产物稀释倍数进行了筛选，最后确定5对选择性扩增引物进行AFLP分析。

当酶切8小时，预扩增产物稀释到20倍时，选取5对聚丙烯酰胺凝胶电泳较清晰且条带较丰富的引物进行荧光标记，用于对已知性别后代DNA样本的选择性扩增，由GENEMARKER导出峰值数据后，统计0/1矩阵，结果见表3，这5 对引物的多态带百分率都较高，适合作为已知性别后代不同个体之间各项遗传参数的分析。利用POPGENE分析遗传参数，由表4中可知，雄性群体的各项遗传参数均大于雌性群体的各项遗传参数，但由于雌雄两组的样本数和多态位点数都存在差异，所以这并不能作为区分性别的标志。表5中可知，已知性别后代的遗传分化系数很低，基因流很高，说明其后代个体间的亲缘关系很近。

再利用NTSYS对24株已知性别后代个体间进行聚类，从聚类图(图2)上可以看到，在任何一个分支点上，都没有把雌雄个体间区分开来。所以AFLP标记并不是区分‘Hort 16A’猕猴桃性别高效且便捷的方法。

表3对荧光标记AFLP引物扩增结果

Table 3The amplification results of 5pairs AFLP primers labeled with fluorescent

表4已知性别后代遗传多样性分析

Table 4The genetic diversity analysis of known-gender offsprings

表5遗传分化和遗传结构分析

Table 5The analysis of genetic differentiation and genetic structure

4.SNP标记的筛查

(1)PCR扩增体系的建立

在网上下载红阳猕猴桃全基因组序列，通过Gill G P已经在中华猕猴桃中找到的SCAR标记片段为目标序列，在红阳猕猴桃全基因组中比对筛查与之同源性较高区域6个，以之分别设计上下游引物，具体序列见表6。

表6SNP标记的引物序列

Table 6The sequences of SNP marker

首先在已知性别的10株‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代(5株为雄株，5株为雌株)中进行PCR扩增，扩增体系见表7。

表7PCR扩增体系25μL

Table 7The system of PCR amplification 25μL

(2)PCR扩增条件

将PCR反应体系配制好后，设置好退火温度，将体系放入PCR仪中按照下 面的程序进行扩增。

扩增结果通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，拍照记录。扩增产物委托生工测序。

(3)性别差异SNP标记的筛选及验证

在扩增结果较清晰，测序结果较好的情况下，分别比对已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株(5株雄株，5株雌株)之间的序列信息。测序结果在Contig中进行比对分析，逐一比对个体之间每个位点的碱基峰值，统计存在的SNP位点，比较分析性别差异，找到雌雄株之间可能存在的SNP位点。

经筛选，找到了雌雄株之间的特征差异SNP标记，确定了扩增出SNP差异的上下游引物。在引物2-1即2-1F：5’AAGGTTAGGGTCGCAAGT3’和2-1R：5’TTAGCACGCTAGGGTCAC3’扩增的核苷酸序列中，统计SNP标记位点，统计结果见表8。其中：

59bp和71bp处可作为区分性别的SNP标记。59bp处表现为t纯合的为雌性个体，表现为t/c杂合的雄性个体；71bp处表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的为雄性个体。

在125bp处，虽然在10株已知性别后代中也表现为雌雄之间的明显差异，但在随后的已知性别植株验证中发现，在125bp处并不能完全区分雌雄，而59bp和71bp处可以区分所有已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代的性别。

由于SNP标记是DNA水平的分子标记，不会随时间、空间及生理的变化而发生变化，可作为选择标记对‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别进行早期鉴定。

表8‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代SNP标记位点

Table 8The SNP marker loci of open pollination offsprings of‘Hort 16A’