一株产胞外多糖的戊糖片球菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株产胞外多糖的戊糖片球菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术：

多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，具有多种功能，在食品行业中是一种最常用的食品添加剂；具有良好的生物活性，它能调节机体的免疫功能，是理想的免疫调节剂。目前，多种多糖用于临床试验，主要用于抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等药物的研究。随着人们对多糖的合成、制备、结构、药理学及临床学的深入研究，开发多糖类药物和保健品已成为当下科学家们的研究热点之一。多糖产品也将具有非常广阔的前景。

益生菌(probiotics)是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，是人体肠道重要的生理菌，能够促进肠内微生物菌群的生态平衡，具有多种生理功能，如可改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌的增殖同时抑制有害菌的生长、提高机体免疫力，可防治三高等。所以今年来益生菌在功能食品中的开发应用也逐渐成为一个研究热点，同时消费者也越来越意识到益生菌对人体健康的重要作用。益生乳酸菌是益生菌中最重要的一族，其在食品中的应用很广泛，乳酸菌的很多生理活性被认为与其胞外多糖(extracellular polymeric substances，EPS)直接相关，如对酸奶和奶酪品质的改善作用，降血糖、调节血压、抗肿瘤、免疫调节等作用。

与其它多糖相比，乳酸菌的EPS的研究更具有意义和应用价值：(1)研究表明乳酸菌的EPS具有重要的生理活性和生理功能；(2)乳酸菌的EPS不用单独分离纯化出来，可以直接将乳酸菌应用到发酵食品中去；(3)乳酸菌是公认的具有食品级安全性的微生物，其EPS属于天然物品；4)乳酸菌的EPS可直接在发酵食品中产生，改善食品质构，口感等，不需要其它添加剂，可以降低产品成本。

目前，酸奶产品中的主要问题是乳清易析出、凝块易破碎等问题。生产中常用的解决方式是添加脱脂乳粉、将乳蒸发浓缩或者膜过滤，这些措施都无疑增加了生产成本。另一种方法是添加稳定剂，虽然达到了预期效果，但同时也在一定程度上掩盖了酸奶的真实味道，而且欧盟一些国家明确禁止在酸奶等发酵乳制品中添加增稠剂和稳定剂。随着消费者生活水平的提高，人们对于乳制品的品质提出了更高的要求。乳酸菌EPS的应用，可取代添加剂的使用，EPS可以提高黏稠度和凝乳强度、保持凝胶结构、防止乳清析出，可降低产品成本，从市场角度拉动了对EPS的研究。

乳酸菌EPS等代谢产物的深入研究，对改善发酵乳产品质地和优化工艺设计有重大意义。此外，随着生物技术的发展，乳酸菌EPS在医疗、化妆品、细胞和酶技术等方面都具有潜在的开发价值。

现在国内乳品生产中多数使用的都是国外的专利菌株，具有自主知识产权的益生菌只占很少一部分。另外，目前乳酸菌的胞外多糖的产量普遍不高。所以本研究旨在从传统的发酵食品中筛选具有较好的产粘性多糖，同时又具有一定的生物功能的乳酸菌菌株，为将来开发功能性发酵剂奠定基础。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株产胞外多糖的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus P36，于2015年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11857，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供所述戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus P36在制备抗氧化产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus P36在食品、医药、化工领域的应用。

所述应用包括制备乳制品。

所述应用包括制备发酵饮品。

所述应用包括制备食品添加剂。

所述应用包括制备化妆品、制备医药保健品。

有益效果：戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus P36能够高产胞外多糖，胞外多糖产量为153.60mg/L。该菌株对NaCl，胆盐、胃肠液有很强的耐受能力，对Caco-2细胞具有较强的粘附能力，并具有提高氧化应激状态下HepG2细胞的抗氧化能力，能够作为益生菌用于制备抗氧化产品或用于食品、医药、化妆品等领域。

附图说明

图1为戊糖片球菌P36的菌落形态；

图2为戊糖片球菌P36在显微镜下(放大倍数400倍)的细胞形态；

图3为pH对戊糖片球菌P36菌体生长的影响；

图4为戊糖片球菌P36在模拟胃液中的存活率；

图5为戊糖片球菌P36在模拟肠液(pH 8.0)中的存活率；

图6为NaCl对戊糖片球菌P36菌体生长的影响；

图7为戊糖片球菌P36在显微镜下(放大倍数400倍)对Caco-2细胞的粘附形态。

具体实施方式

实施例1戊糖片球菌的筛选及鉴定

在陕南地区共采泡菜汁样品29份，进行菌株筛选分离。具体步骤如下：

样品预处理：用灭菌的移液枪各取样品5ml分别放入装有45ml 0.1％的无菌水的三角瓶中(含玻璃珠)，摇晃1min后静置20min，备用。

预处理后的样品相当于原样品稀释了10倍，用同样的方法依次将样品逐级稀释，每个稀释度取0.1mL稀释样品，涂布在MRS固体培养基上，在37℃下,恒温培养48h，用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。再在MRS固体培养基上划线分离，得到纯的单菌落，并进行形态学鉴定，包括革兰氏染色、镜检、接触酶实验、凝乳实验。结果显示：革兰氏染色阳性，接触酶实验阴性、能凝乳，初步确定为乳酸菌。

苯酚-硫酸法测多糖含量:将以上分离得到的菌株接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，取10ml乳酸菌发酵液,沸水浴10min，冷却至室温,加入5ml 80％三氯乙酸,4℃静置过夜。10000r/min离心20min脱除蛋白质和其他大分子杂质。离心后的上清液移至14000的透析袋中。用蒸馏水透析3d,每8h换一次水。三天后,多糖呈絮状析出,定容。采用硫酸-苯酚法测定胞外多糖的含量。

共分离得到乳酸菌101株，其中高产多糖的20株。对其中一株多糖产量为153.60mg/L进行形态学分析。该菌株在MRS培养基中，37℃恒温培养48h后即可形成肉眼可见的明显菌落，其菌落形态如图1所示，菌落形态呈圆形，乳白色不透明，表面光滑，有凸起，边缘整齐，不产生色素，挑取能拉丝。挑单菌落涂片后，进行革兰氏染色并在显微镜下观察其形态结构。革兰氏染色结果显示紫色，表明此菌株是革兰氏阳性菌，且菌株形态为球状(图2)。

提取该菌株的基因组，并进行16S rDNA扩增，获得如SEQ IN NO.1所示序列。将SEQ ID NO.1所示序列在Genbank数据库中进行比对，确定乳酸菌P36为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，命名为Pediococcuspentosaceus P36。该菌株已于2015年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11857。

实施例2pH对戊糖片球菌P36菌株生长的影响

以HCl(1mol/L)调节MRS液体培养基pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0，取对数生长期的戊糖片球菌P36，以2％的接种量接种，充分混合均匀，在37℃下培养18h后测定其菌液在600nm波长下的吸光度值OD₆₀₀。戊糖片球菌P36在不同pH中的生长情况见图3，结果表明该菌株在pH2的酸性环境中依然可以生长，说明其有较好的耐酸性。

实施例3戊糖片球菌P36对模拟胃肠液的耐受能力

人工模拟胃肠液需新鲜配制。用PBS(pH 3.0)配置浓度为3g/L的胃蛋白酶，0.22μm滤膜过滤后制备成所需模拟胃液。用PBS(pH 8.0)配置浓度为1g/L的胰蛋白酶，0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。

将戊糖片球菌P36以生理盐水重悬，并将其菌液密度在模拟胃液(pH 3.0)中调节至1×10⁹CFU/mL，充分混匀，在37℃培养1，2和3h后检测活菌数。3h后，取模拟胃液(pH 3.0)中的培养液1ml加入至9ml的模拟肠液(pH 8.0)中，充分混匀，在37℃培养2，4和8h后检测活菌数。用MRS固体培养基37℃培养48h，乳酸菌的存活率用以下公式计算：

存活率(％)＝log cfu N₁/log cfu N₀×100％

N₁＝经过模拟胃肠液处理之后的活菌数，N₀＝未经胃肠液处理前的活菌数

乳酸菌要进入肠道发挥其益生作用，首先应该具有耐受胃液的能力。图4表明，戊糖片球菌P36在人工模拟胃液(pH 3.0)中可存活3h，并且存活率大于85％。图5表明，戊糖片球菌P36在模拟肠液(pH 8.0)中可存活8h，且存活率可达到92％以上。

实施例4戊糖片球菌P36对胆盐的耐受能力

取对数生长期的戊糖片球菌P36，以2％的接种量分别接种于含有或不含0.3％胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2％的巯基乙酸钠)培养中，充分混合均匀，在37℃下培养。记录培养基吸光值到达0.3个单位时各组所需的时间，不加胆盐与添加胆盐两组的时间差即为戊糖片球菌P36在胆盐中生长的延迟时间(LT)。延迟时间的长短，能够反映乳酸菌对胆盐的耐受能力。

表1胆盐对P36生长的作用

评价菌株是否能够在肠道中生存与定殖的一个重要指标就是菌株对于胆盐的耐受能力。表1中所示，戊糖片球菌P36对于胆盐的延迟时间为0.96h，说明此菌株对胆盐具有很好的耐受性。

实施例5戊糖片球菌P36对NaCl的耐受能力

取对数生长期的P36，以2％接种量分别接入到NaCl质量分数为0％、2％、4％、6％、7％、8％、9％的MRS液体培养基中，充分混合均匀，在37℃下培养18h后测定其菌液OD₆₀₀值。

如图6所示，在NaCl浓度为9％时戊糖片球菌P36仍然可以存活，说明戊糖片球菌P36对NaCl具有较强的耐受能力。

实施例6戊糖片球菌P36对Caco-2细胞的粘附能力影响

以含有20％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸和1％双抗的高糖DMEM完全培养基培养Caco-2细胞，37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，隔天换液，待细胞增殖融合率达到80％左右时，胰酶消化后按照1:3进行传代。取对数生长期的细胞进行下步实验。

将Caco-2细胞以4×10⁴cell/孔接种于6孔板中，37℃培养24h。将培养至对数期的戊糖片球菌P36离心后用PBS(pH 7.2)冲洗3次，重悬于高糖DMEM完全培养基中，调整菌液浓度为1×10⁹CFU/mL，加入到已生长好的Caco-2细胞单层中，37℃培养2h。再以PBS冲洗细胞单层3次，后用甲醇固定30min，再进行革兰氏染色。随机找20个视野数100个细胞，以平均每个细胞上粘附的P36菌数来评价其粘附能力。

Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，可以较好的模拟人体肠道中的环境。通过菌株对Caco-2细胞的粘附能力分析，可评价其是否能够成为优良菌株。图7中可看出，戊糖片球菌P36对Caco-2细胞具有一定的粘附能力，依据实验统计结果表明粘附率为15个/cell。由此推测，戊糖片球菌P36在人体肠道中应具有较好的定殖能力。

实施例7戊糖片球菌P36对HepG2细胞培养上清抗氧化功能的影响

用0.25％的胰蛋白酶消化收集生长处于对数生长期的HepG2细胞，以2×10⁵个/mL的细胞密度接种于6孔培养板，每孔2mL培养液，37℃，5％CO2，培养24h。分组处理：空白对照组，加入2mL DMEM培养液；模型组，加入含0.10mmol/L H₂O₂的DMEM培养液；乳酸菌组，同时加入含H₂O₂的DMEM培养液和P36菌液(1×10⁹CFU/mL)，继续培养12h和24h。

12h时，与对照组相比，模型组细胞上清液中的GSH-Px的活力显著增加了74％(P<0.05)，POD活力显著降低24％(P<0.05)，SOD、GSH、CAT和MDA的含量无显著性差异(P>0.05)，表明此时模型组细胞还未进入氧化应激状态。与模型组相比，添加戊糖片球菌P3612h后，细胞上清液中的T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活力都有显著提高，分别提高了59％、23％、28％和126％(P<0.05)，POD的活力显著降低了44％(P<0.05)，MDA含量增加了19％，表明P36可以提高细胞抗氧化能力，但是对细胞也有一定的刺激作用。24h后，与对照组相比，模型组细胞上清液中的T-AOC显著降低了33％(P<0.05)，SOD、GSH-Px和CAT的活力分别显著降低11％、52％和47％(P<0.05)，同时POD活力显著增加32％(P<0.05)，MDA含量显著增加81％(P<0.05)，表明此时细胞已表现为氧化应激状态。与模型组相比，添加P3612h后，细胞上清液中的T-AOC、GSH-Px和CAT活力都有显著提高，分别提高了80％、30％和 124％(P<0.05)，SOD活力有所提高，但并不显著(P>0.05)，POD的活力显著降低了40％(P<0.05)，MDA含量增加了24％，表明干酪乳杆菌可以提高细胞抗氧化能力，但是对细胞也有一定的刺激作用。24h后，细胞上清液中的T-AOC和SOD的活力显著增加了145％和123％(P<0.05)，GSH-Px、CAT和POD的活力显著增加(P<0.05)，GSH和MDA的含量分别显著降低了28％和49％(P<0.05)。有研究显示乳酸菌具有高效清除羟自由基和超氧化阴离子自由基的能力，并可提高人体SOD和GSH-Px活力，降低肠道氧化应激，增强抗氧化能力。本文结果表明P36提高了抗氧化酶的合成和分泌，增强了细胞的抗氧化能力。

表2细胞上清液在12h和24h时的抗氧化活性

注：对照组，未添加H₂O₂；模型组，添加H₂O₂；实验组，添加戊糖片球菌P36

实施例8戊糖片球菌P36对HepG2细胞裂解液抗氧化活性的影响

细胞继续培养12h和24h后吸取培养上清装入离心管，-80℃冻存备用。每孔用PBS洗涤3次，然后每孔加1mL 1％的Triton X-100用吸管充分吹匀，2000r/min离心15min，收集上清即为细胞裂解液，-80℃冻存备用。

表3细胞裂解液在12h和24h时的抗氧化活性

注：对照组，未添加H₂O₂；模型组，添加H₂O₂；实验组，添加戊糖片球菌P36

表3所示，12h后，与对照组相比，模型组细胞裂解液中SOD活力含量有所降低，但差异不显著(P>0.05)，GSH含量显著降低(P<0.05)，POD的活力显著提高了92％(P<0.05)。结果表明此时细胞刚开始受到刺激，胞内POD活力增加以保护细胞免受损伤。添加P3612h后，乳酸菌组的细胞裂解液中SOD活力与对照组和模型组相比分别显著增加了14％和17％(P<0.05)；POD的活力与对照组相比显著增加了102％(P<0.05)，和模型组相比也有所增加；GSH的含量与模型组相比显著增加(P<0.05)。表明此时细胞受到乳酸菌的氧化刺激作用，胞内的氧化酶含量随之升高。24h后，与对照组相比，模型组细胞裂解液中的SOD活力和GSH含量分别显著增加了44％和61％(P<0.05)；POD活力也有所增加。添加P36组的SOD活力比对照组有所增加，但比模型组显著降低了15％(P<0.05)；POD活力比对照组和模型组分别显著增加了114％和94％(P<0.05)；GSH含量比对照组显著增加了72％(P<0.05)，与模型组相比也有所增加。结果表明，此时模型组的细胞已受到强烈的氧化应激，细胞内的抗氧化物开始大量合成，以保护细胞免受损伤。另外，P36通过刺激提高细胞内抗氧化酶的活力，增强了细胞的抗氧化作用，对细胞有一定的保护作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。