本发明涉及一种有效提高米曲霉L-苹果酸生产强度的方法，属于遗传工程领域。
背景技术：
：苹果酸作为一种重要的四碳二羧酸主要用作食品、饮料中的酸味剂，金属物的清洗剂，以及农业、化妆品和医药等领域。2004年，美国能源部将苹果酸和富马酸、琥珀酸这三种四碳二羧酸均作为可通过微生物利用可再生原料发酵大规模生产的12种平台化合物之一。米曲霉作为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全菌株，早在1000多年前已被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，是理想的真核表达载体。黄曲霉是最初的苹果酸生产菌株，但由于其产生黄曲霉毒素而不能用于大规模生产，尤其是不能应用于食品行业。米曲霉与黄曲霉的基因组有较高的同源性，且不产霉菌毒素，故可作为潜在的苹果酸的生产菌株。米曲霉内有四条苹果酸的合成途径，分别为位于细胞质内的还原TCA途径和位于线粒体内的TCA途径、乙醛酸环形途径和非环形乙醛酸循环途径。其中还原TCA途径的转化率最高，理论转化率为2mol苹果酸/mol葡萄糖。众所周知，生产强度是大规模发酵的一个重要参数，提高单位时间的产物合成速率有利于降低生产成本和设备能源等的损耗。目前已有报道的微生物发酵法生产苹果酸生产强度可达0.74±0.06g/L·h。另外，也有研究者通过代谢改造Aspergillusoryzae将苹果酸生产强度提高至0.94g/L·h。此外，基因工程大肠杆菌发酵产苹果酸的生产强度达0.47g/L·h。米曲霉作为高产苹果酸的潜在菌株，有望通过进一步的代谢调控，加快产物的合成速度，缩短发酵周期，成为L-苹果酸工业发酵的优势菌株。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明通过表达米曲霉的四碳二羧酸转运蛋白C4T318和粟酒裂植酵母的苹果酸转运蛋白MAEI，有效提高了L-苹果酸的产量和生产强度。在前期工作中，发明人首先过表达了丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶，苹果酸的摇瓶产量为50.5±1.06g/L。再在此基础上，表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，苹果酸的产量提高至63.2±1.32g/L。由于米曲霉的发酵pH偏中性，故苹果酸的胞内积累极不利于产酸。苹果酸的胞外运输依赖于转运蛋白的作用，提高转运蛋白的表达量可能可以减少胞内苹果酸的积累，解除或缓解代谢产物的反馈抑制。故本发明通过进一步过表达这两个转运蛋白基因，L-苹果酸的产量提高至93.17±2.10g/L，提高了47.4％；琥珀酸的浓度为5.17±0.49g/L，降低了41.8％；苹果酸相对于葡萄糖的转化率为0.85g/g，提高了49.1％。同时其发酵周期由90h缩短至80h，生产强度达到1.16g/L·h，是目前报道的微生物发酵法生产苹果酸的最高值。本发明的第一个目的是提供一种能够提高米曲霉L-苹果酸的生产强度和/或产量和/或转化率和/或发酵周期的方法。在本发明的一种实施方式中，所述方法是在出发米曲霉菌株的基础上，过表达来源于米曲霉的四碳二羧酸转运蛋白C4T318和/或来源于粟酒裂植酵母的苹果酸转运蛋白maeI基因。在本发明的一种实施方式中，所述四碳二羧酸转运蛋白C4T318的基因序列如NCBI-GeneID:5992883所示，苹果酸转运蛋白maeI的基因序列如NCBI-GeneID:2543334所示。在本发明的一种实施方式中，所述出发米曲霉菌株是在AspergillusoryzaeNRRL3488上过表达了米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc，并同时表达了来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的菌株Aspergillusoryzaepp25。在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶mdh的基因序列如NCBI上GeneID:5994966所示，丙酮酸羧化酶pyc的基因序列如NCBI上GeneID:5993308所示。在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编码基因如NCBI上GeneID:945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上GeneID:948457所示。在本发明的一种实施方式中，所述过表达目标基因mdh和pyc时使用的载体，为自行构建的带有氨苄和苯菌灵抗性的pBg32质粒。该质粒是在pMD19-TVector的基础上，通过添加米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)和构巢曲霉的苯菌灵抗性基因(benA)构建而成。在本发明的一种实施方式中，所述表达目标基因pck和ppc时使用的载体，为自行构建的带有氨苄和潮霉素抗性的pHg11质粒。该质粒是在pMD19-TVector的基础上，通过添加米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)和潮霉素抗性基因(hyg)构建而成。在本发明的一种实施方式中，所述表达目标基因C4T318时使用的载体，为自行构建的带有氨苄和乙酰胺酶标记的pAg12质粒，该质粒是在pMD19-TVector的基础上，通过添加米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)和来源于构巢曲霉的乙酰胺酶基因(amds)构建而成。在本发明的一种实施方式中，所述表达目标基因maeI时使用的载体，为上述所描述的质粒pHg11。在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是整合到米曲霉基因组上进行表达。在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是将目标基因连接到载体上得到含有目标基因的重组质粒，从重组质粒中得到含有目的基因的线性DNA片段，然后经原生质体转化法将目标基因重组进米曲霉。在本发明的一种实施方式中，所述原生质体转化法，其中原生质体制备方法参见文献Brown,S.H.,Bashkirova,L.,Berka,R.,Chandler,T.,Doty,T.,McCall,K.,McCulloch,M.,McFarland,S.,Thompson,S.,Yaver,D.,Berry,A.,2013.MetabolicengineeringofAspergillusoryzaeNRRL3488forincreasedproductionofL-malicacid.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.97,8903-12；原生质体转化方法参见文献Blumhoff,M.,Steiger,M.G.,Marx,H.,Mattanovich,D.,Sauer,M.,2013.SixnovelconstitutivepromotersformetabolicengineeringofAspergillusniger.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.97,259-67。本发明的第二个目的是提供一种米曲霉重组菌，所述重组菌以出发米曲霉为宿主，过表达来源于米曲霉的四碳二羧酸转运蛋白C4T318和/或来源于粟酒裂植酵母的苹果酸转运蛋白maeI基因。在本发明的一种实施方式中，所述四碳二羧酸转运蛋白C4T318的基因序列如NCBI-GeneID:5992883所示，苹果酸转运蛋白maeI的基因序列如NCBI-GeneID:2543334所示。在本发明的一种实施方式中，所述出发米曲霉菌株是在AspergillusoryzaeNRRL3488上过表达了米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc，并同时表达了来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的菌株Aspergillusoryzaepp25。在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶mdh的基因序列如NCBI上GeneID:5994966所示，丙酮酸羧化酶pyc的基因序列如NCBI上GeneID:5993308所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编码基因如NCBI上GeneID:945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上GeneID:948457所示。在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是整合到米曲霉基因组上进行表达。在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是将目标基因连接到载体上得到含有目标基因的重组质粒，从重组质粒中得到含有目的基因的线性DNA片段，然后经原生质体转化法将目标基因重组进米曲霉。本发明的第三个目的是提供一种生产L-苹果酸的方法，所述方法是以本发明的米曲霉重组菌为生产菌株进行发酵生产。在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产，是制备米曲霉重组菌孢子浓度为1×106个/mL至9×106个/mL的孢子悬浮液，然后28～32℃振荡培养12～16h，然后转接至发酵培养基，于28～32℃振荡培养发酵80～90h。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖110，胰蛋白胨12，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4.7H200.1，CaCl2.H200.1，1mL微营养液(5gNaCl、5gFeSO4.7H20、1g柠檬酸)，CaCO390。本发明还要求保护所述米曲霉重组菌在食品、农业、化妆品或者医药等领域的应用。本发明的有益效果：本发明提供的重组米曲霉较大程度的提高了苹果酸的产量和葡萄糖的消耗速率，80h苹果酸的浓度达到93.17±2.10g/L，生产强度达到1.16g/L·h，是目前报道的微生物发酵法生产苹果酸的最高值。同时，苹果酸相对于葡萄糖的转化率为0.85g/g，发酵周期也由90h缩短至80h。此外，主要副产物琥珀酸的产量降低了41.8％，为进一步发酵优化和代谢改造米曲霉生产苹果酸奠定了良好的基础。本发明提供的减少胞内产物积累及基因操作的方法简单有效，便于广泛应用。具体实施方式米曲霉种子培养及发酵：种子培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨3，KH2PO40.75，K2HPO40.75，NaH2PO40.56，K2HPO40.56，MgSO4.7H200.075，CaCl2.H200.075，0.75mL微营养液(5gNaCl、5gFeSO4.7H20、1g柠檬酸)。发酵培养基(g/L)：葡萄糖110，胰蛋白胨12，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4.7H200.1，CaCl2.H200.1，1mL微营养液(5gNaCl、5gFeSO4.7H20、1g柠檬酸)，CaCO390。培养条件：米曲霉固体培养为34℃恒温培养3-7天，孔板发酵为30℃、600rpm3天。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5×106个/mL，30℃、200rpm培养14h，以10％的接种量转接发酵培养基，30℃、200rpm发酵90h。苹果酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：10％甲醇和0.75mmol稀磷酸。流速0.7mL/min，柱温20℃，波长210nm，进样体积为10μL。样品制备：向已知体积的发酵液中加入相同体积的2MHCl以溶解生成的苹果酸钙沉淀和残留的CaCO3。离心后再稀释5倍，经0.22μm滤膜过滤后，滤液用于液相检测。实施例1米曲霉原生质体转化和转化子的筛选米曲霉原生质体制备和转化方法如下：原生质体制备方法参见文献Brown,S.H.,Bashkirova,L.,Berka,R.,Chandler,T.,Doty,T.,McCall,K.,McCulloch,M.,McFarland,S.,Thompson,S.,Yaver,D.,Berry,A.,2013.MetabolicengineeringofAspergillusoryzaeNRRL3488forincreasedproductionofL-malicacid.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.97,8903-12。原生质体转化方法参见文献Blumhoff,M.,Steiger,M.G.,Marx,H.,Mattanovich,D.,Sauer,M.,2013.SixnovelconstitutivepromotersformetabolicengineeringofAspergillusniger.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.97,259-67。筛选到的阳性转化子通过抗性平板数次传代得到纯合的米曲霉重组菌株。实施例2米曲霉Aspergillusoryzaepp25的构建根据NCBI上公布的米曲霉mdh和pyc基因的上下游序列，设计引物，构建苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc表达载体。同时，也根据NCBI上公布的大肠杆菌pck和ppc上下游序列，设计引物构建pck和ppc基因异源表达载体。表1扩增mdh和pyc基因的引物名称序列(5’-3’)序列编号mdh3-1CCAATGCATGCCACCATGGTCAAAGCTGGTGAGTTAGSEQIDNO:1mdh3-2GCTCTAGATTACTTTGGTGGTGGGTTCTSEQIDNO:2pyc-1CCAATGCATGCCACCATGGCGGCTCCGTTTCGTCASEQIDNO:3pyc-2GCTCTAGATTACGCTTTGACGATCTTGCAGSEQIDNO:4ppc-1CCTTAATTAAATGAACGAACAATATTCCGCATTGCSEQIDNO:5ppc-2GGGGTACCTTAGCCGGTATTACGCATACCTGCCSEQIDNO:6pck-1TGCATGCATATGCGCGTTAACAATGGTTTGACCCSEQIDNO:7pck-2GGGGTACCTTACAGTTTCGGACCAGCCGCTACCSEQIDNO:8其中，以米曲霉基因组为模板，通过PCR扩增相关基因。米曲霉的基因组的提取方法为天根植物基因组提取试剂盒法。扩增所得目的基因和上述载体质粒pBg32均使用快切酶NsiI和KpnI双酶切，目的基因与载体连接所得mdh基因的表达质粒pMBg33和pyc基因的表达质粒pPBg28。再使用快切酶AscI、NotI双酶切得到目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。采用实施例1的方法，将含有mdh基因的DNA片段、含有pyc基因的DNA片段，分别转到到米曲霉AspergillusoryzaeNRRL3488中，转化子选择培养基为含有1.2μg/ml苯菌灵的PDA固体培养基。得到过表达mdh基因和pyc基因的重组菌Aspergillusoryzaep16。然后，以大肠杆菌BL21的基因组为模板，使用SEQIDNO:5～SEQIDNO:8的引物PCR扩增相关基因ppc和pck。使用快切酶pacI和KpnI分别双酶切目的基因和上述载体pHg11，目的基因与载体连接得到ppc基因的表达质粒pPHg2和pyc基因的表达质粒pPCg32。再使用快切酶AscI、HindIII双酶切得到目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。采用实施例1的方法，将含有pck基因的DNA片段转到重组菌Aspergillusoryzaep16中，得到了表达大肠杆菌来源的pck基因的重组菌株，然后再将含有ppc基因的DNA片段转入，筛选正确的转化子，即为Aspergillusoryzaepp25。用于转化子筛选的培养基为含有2g/L潮霉素B和1mM氯丙嗪的PDA固体培养基。实施例3过表达四碳二羧酸转运蛋白基因C4T318根据NCBI上公布的米曲霉C4T318基因上下游序列，设计引物。表2扩增米曲霉C4T318基因的引物名称序列(5’-3’)序列编号C4T318-1CCAATGCATGCCACCATGTTCAATAACGAACACCASEQIDNO:9C4T318-2GCTCTAGACTAATCAGATACATCCTCATSEQIDNO:10以米曲霉的基因组为模板，通过PCR扩增相关基因。曲霉的基因组提取方法为天根植物基因组提取试剂盒法。扩增所得目的基因和上述载体质粒pAg12均使用快切酶NsiI和KpnI双酶切，目的基因与载体连接所得C4T318基因的表达质粒pCAg22。再使用快切酶AscI、NotI双酶切得到目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。用于转化子筛选的培养基成分为：1.0M蔗糖、10mM乙酰胺、15mM氯化铯。采用实施例1的方法，将目的DNA转化到Aspergillusoryzaepp25中，筛选正确的转化子，得到Aspergillusoryzaec19。实施例4异源表达苹果酸转运蛋白SpMAEI构建苹果酸转运蛋白maeI的表达载体，转化实施实例3中的高产菌株A.oryzaec19。根据NCBI上公布的粟酒劣质酵母maeI基因的上下游序列，设计引物。以粟酒劣质酵母的基因组为模板，通过PCR扩增相关基因。酵母的基因组提取方法为天根酵母基因组提取试剂盒法。使用快切酶xbaI和KpnI分别双酶切目的基因和上述载体pHg11，目的基因与载体连接得到maeI基因的表达质粒pMEg95。再使用快切酶AscI、HindIII双酶切得到目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。表3扩增maeI基因的引物名称序列(5’-3’)序列编号mae-1GCTCTAGAATGGGTGAACTCAAGGAAATCTTGAAACSEQIDNO:11mae-2GGGGTACCTTAAACGCTTTCATGTTCACTACTAGGAGGSEQIDNO:12采用实施例1的方法，将目的DNA转化到Aspergillusoryzaec19中，筛选正确的转化子，得到Aspergillusoryzaema37。实施例6米曲霉发酵生产L-苹果酸将34℃培养3-7天的米曲霉的孢子用0.05％的吐温80洗脱，使用尼龙布过滤除去菌丝体。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5×106个/mL，30℃、200rpm培养14h，以10％的接种量转接发酵培养基，30℃、200rpm发酵80～90h。在Aspergillusoryzaepp25上过表达四碳二羧酸转运蛋白基因C4T318后的转化子Aspergillusoryzaec19，摇瓶发酵苹果酸浓度最高可达84.26±1.40g/L。在Aspergillusoryzaec19菌株的基础上再次转化maeI基因，苹果酸的摇瓶发酵浓度达到93.17±2.10g/L，命名为Aspergillusoryzaema37。相比Aspergillusoryzaepp25，过表达两个转运蛋白后，L-苹果酸的摇瓶产量提高了47.4％；琥珀酸的浓度为5.17±0.49g/L，降低了41.8％；苹果酸相对于葡萄糖的转化率为0.85g/g，提高了49.1％。同时其发酵周期由90h缩短至80h，生产强度达到1.16g/L·h，提高了65.7％。本发明中的代谢调控方法，实现了食品安全级菌株米曲霉生产性能的较大提高，为其工业化应用奠定了基础，并为相似菌株和产品的代谢调控提供了借鉴意义。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 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