一株红曲霉菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一株红曲霉菌株及其应用。

背景技术：

红曲也称丹曲，在我国应用广泛且历史悠久，主要用于酿造、食品发酵、食品着色、中药、化妆品等，而红曲霉是制造红曲的主要微生物。传统红曲的做法是以大米为原料，接种红曲霉后固体发酵而成。近几年研究表明，红曲及红曲霉发酵产物具有抗高血压、调节血脂、抗肥胖、抗糖尿病等功效。而其中的活性物质主要有洛伐他听、红曲色素、γ-氨基丁酸等。

葛根淀粉是葛块根的主要成分，新鲜块根中淀粉含量约在20%～25%左右，葛根淀粉富含钙、磷、钾、铁、锌等多种人体所必需的矿质元素，并吸附有黄酮类物质，具有良好的保健功能，使之成为开发新型保健食品的较好原料。

本发明利用红曲霉对葛根淀粉进行发酵，生产功能性红曲，不仅增加了红曲品种，也增加了葛根淀粉的附加值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株红曲霉菌株及其应用，利用红曲霉菌株以期获得高色价低桔霉素的红曲霉液态发酵曲的生产方法。液态发酵是工业化生产的前提，相比于固态发酵具有可操控性强、周期短、杂质少等优点。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

所述红曲霉菌株为紫红曲霉（Monascus purpureus）FZU-MP1501，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12516，保藏日期为2016年06月24日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述液态发酵生产葛根红曲生产方法包含以下的步骤

（1）菌株活化

取权利要求1中的保藏红曲霉菌株于无菌条件下转接到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面，培养得到斜面菌种，得到的斜面红曲霉菌株在无菌条件下于PDA平板画线进行扩培。

（2）孢子悬浮液的制备

将培养好的平板上的红曲霉菌株用孢子洗脱液洗下孢子，震荡、过滤后，制成均一的孢子悬浮液。

（3）种子液的制备

将孢子悬浮液接种到种子培养基中，在一定条件下培养制成种子液，其中种子培养基成分包括籼米粉。

（4）发酵

将制备好的种子液接种到发酵培养基中，培养制得液态发酵曲，其中发酵培养基成分包括葛根淀粉。

（5）发酵液指标的测定

发酵完毕，测定发酵液的色价、桔霉素含量、菌体生物量等。

所述的PDA培养基的配方如下：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸至玻璃棒能戳破，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀并分装后蒸馏水定容至1000mL，pH自然，分装后于121℃灭菌20min。

所述斜面和平板培养条件为：28～34℃下培养4～8天。

所述孢子洗脱液为生理盐水，且震荡时间为30min以内。

所述孢子悬浮液的孢子浓度为10⁵～10⁹个/mL。

所述种子液的接种量为5～10%，培养条件为28～34℃、150～250rpm条件下培养4～10天。

所述种子培养基组成为：籼米粉25～40g/L，葡萄糖10～15g/L，黄豆粉10～15g/L，NaNO₃0.8～1.2g/L，KH₂PO₄ 0.8～1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2~0.7g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量25~50mL分装，121℃灭菌20min。

所述发酵培养基的接种量为5～10%，培养条件为28～34℃、150～250rpm条件下培养4～10天。

所述发酵培养基组成为：味精15～25g/L，硫酸铵7~12g/L，葛根淀粉20~40g/L，麦芽糖25~35g/L，七水硫酸亚铁0.4~1g/L，磷酸二氢钾3~9g/L，一水硫酸锰0.03~0.07g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量25~50mL进行分装，于121℃灭菌20min。

所述葛根淀粉的大小为20～80目。

本发明中红曲霉液态发酵物色价的测定

取5mL发酵液于4500r/min条件下离心10min，得到的菌体沉淀加入70%乙醇溶液，超声20min后，于60℃条件下提取2h后在4500r/min转速下离心5min，得到的上清液经70%乙醇溶液稀释至适当倍数，用分光光度计测定410nm、465nm、510nm处吸光值；黄色价=OD410nm×稀释倍数，橙色价= OD465nm×稀释倍数，红色价= OD510nm×稀释倍数，水溶性总色价= 水溶性黄色价+水溶性橙色价+水溶性红色价，醇溶性总色价= 醇溶性黄色价+醇溶性橙色价+醇溶性红色价。

本发明中红曲霉液态发酵物桔霉素含量的测定

采用高效液相色谱法测定发酵液中的桔霉素含量，具体方法参考国家标准《红曲产品中桔青霉素的测定》GB/T 5009.222-2008。

本发明中红曲霉液态发酵物菌体生物量的测定

取一定量的发酵液， 4500r/min转速下离心10min，收集沉淀，并用蒸馏水洗涤数次后，放于60℃烘箱中，烘至恒重，用分析天平称重。菌体量（g/L）=菌体干重/发酵液体积。

本发明的显著优点在于生产得到的液态葛根淀粉红曲的醇溶性总色价为2500～3500U/g，发酵周期为5～7d，菌体干重为20～30g/L，同时菌体桔霉素含量为0.01~0.05mg/g。

附图说明

图1该红曲霉菌株在实施例1中四种培养基上的菌落形态。

图2 该红曲霉菌株在实施例1中显微镜下的观察结果。

图3 为该红曲霉菌株在实施例2的发酵结果。

图4 为该红曲霉菌株在实施例3的发酵结果。

图5 为该红曲霉菌株在实施例4的发酵结果。

具体实施方式

实施例1

红曲霉菌株FZU-MP1501是由本研究所从福建红曲中分离纯化得到，经鉴定属于红曲霉属，目前该菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12516，保藏日期为2016年06月24日。

将该菌株在四种不同的鉴定培养基（CYA、MEA、PDA、G25N）上进行单点培养，其菌落形态如表1和图1所示。

表1 该株红曲霉在不同培养基上的菌落形态

分类学特征，能在G25N上生长，菌落在MEA上着色且不呈现褐色至橄榄色的只有红色红曲霉或紫色红曲霉，因此，初步判定平湖红曲霉菌株可能是红色红曲霉（Monasces ruber）或紫色红曲霉（Monascus purpureus）。

该菌株显微镜特征：观察该菌株的菌丝形态、分生孢子、闭囊壳以及子囊孢子形态可知。菌丝具有不规则的分枝，多隔，无色透明或者含有深浅不同的色素，有些含油滴；分生孢子排列呈链状，着生于菌丝顶端；单个孢子呈梨形至球形；闭囊壳近球形。典型结构显微照片见图2。

通过ITS序列和18S rDNA序列对该株红曲霉进行分子鉴定，并将该株红曲霉扩增得到的PCR产物进行测序。其鉴定结果表明，该株红曲霉为紫色红曲霉（Monascus purpureus）。这与CGMCC给出的鉴定结果一致。

实施例2

PDA培养基的配方如下：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸至玻璃棒能戳破，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀并分装后蒸馏水定容至1000mL，pH自然，分装后于121℃灭菌20min。

种子培养基的配方如下：籼米粉35.00g/L，葡萄糖12.00g/L，黄豆粉12.00g/L，NaNO₃1.00g/L，KH₂PO₄ 1.00g/L，MgSO₄·7H₂O 0.50g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量50mL分装，121℃灭菌20min。

发酵培养基的配方如下：味精15.00g/L，硫酸铵7.00g/L，葛根淀粉20.00g/L，麦芽糖25.00g/L，七水硫酸亚铁0.40g/L，磷酸二氢钾3.00g/L，一水硫酸锰0.03g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量25mL进行分装，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取该红曲霉菌株保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种转接于PDA斜面培养基中，30℃条件下培养5d后划线于PDA平板，30℃条件下培养7d，用孢子洗脱液洗下孢子，震荡25min、过滤并调整孢子浓度至10⁸个/mL，按照体积比算，接种量为10%接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养2d，得到种子液；将种子液按照接种量为5%接种至发酵培养基中，30℃、200rpm条件下培养6d，所得发酵液分别测定发酵产物的色价、桔霉素含量、菌体生物量。

本发明中所涉及的红曲霉菌株在上述方法下生产的液态葛根淀粉发酵曲醇溶性总色价可达3166.89U/g，菌体生物量为21.57g/L，桔霉素含量仅为10.32μg/g。

实施例3

PDA培养基的配方如下：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸至玻璃棒能戳破，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀并分装后蒸馏水定容至1000mL，pH自然，分装后于121℃灭菌20min。

种子培养基的配方如下：籼米粉35.00g/L，葡萄糖12.00g/L，黄豆粉12.00g/L，NaNO₃1.00g/L，KH₂PO₄ 1.00g/L，MgSO₄·7H₂O 0.50g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量50mL分装，121℃灭菌20min。

发酵培养基的配方如下：味精20.00g/L，硫酸铵9.00g/L，葛根淀粉30.00g/L，麦芽糖30.00g/L，七水硫酸亚铁0.65g/L，磷酸二氢钾6.00g/L，一水硫酸锰0.05g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量35mL进行分装，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取该红曲霉菌株保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种转接于PDA斜面培养基中，30℃条件下培养5d后划线于PDA平板，30℃条件下培养7d，用孢子洗脱液洗下孢子，震荡25min、过滤并调整孢子浓度至10⁷个/mL，按照体积比算，接种量为10%接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养2d，得到种子液；将种子液按照接种量为5%接种至发酵培养基中，30℃、200rpm条件下培养6d，所得发酵液分别测定发酵产物的色价、桔霉素含量、菌体生物量。

本发明中所涉及的红曲霉菌株在上述方法下生产的液态葛根淀粉发酵曲醇溶性总色价达2500.69U/g，菌体生物量为25.64g/L，桔霉素含量仅为8.25μg/g。

实施例4

PDA培养基的配方如下：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸至玻璃棒能戳破，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀并分装后蒸馏水定容至1000mL，pH自然，分装后于121℃灭菌20min。

本发明的种子培养基的配方如下：籼米粉35.00g/L，葡萄糖12.00g/L，黄豆粉12.00g/L，NaNO₃1.00g/L，KH₂PO₄ 1.00g/L，MgSO₄·7H₂O 0.50g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量50mL分装，121℃灭菌20min。

发酵培养基的配方如下：味精25.00g/L，硫酸铵12.00g/L，葛根淀粉40.00g/L，麦芽糖35.00g/L，七水硫酸亚铁1.00g/L，磷酸二氢钾9.00g/L，一水硫酸锰0.07g/L，其余为去离子水，pH自然，按照250mL三角瓶装液量50mL进行分装，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取该红曲霉菌株保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种转接于PDA斜面培养基中，30℃条件下培养5d后划线于PDA平板，30℃条件下培养7d，用孢子洗脱液洗下孢子，震荡25min、过滤并调整孢子浓度至10⁷个/mL，按照体积比算，接种量为10%接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养2d，得到种子液；将种子液按照接种量为5%接种至发酵培养基中，30℃、200rpm条件下培养6d，所得发酵液分别测定发酵产物的色价、桔霉素含量、菌体生物量。

本发明中所涉及的红曲霉菌株在上述方法下生产的液态葛根淀粉发酵曲醇溶性色价达1785.21U/g，菌体生物量为29.64g/L，桔霉素含量为21.9μg/g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。