一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法与流程

本发明属于植物病原菌检测领域，涉及高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法。

背景技术：

高丹草（Sorghum bicolor × Sorghum sudanense）是高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）与苏丹草（Sorghum sudanense (Piper) Stapf.）种间杂交产生的杂种类型，属于高光效C₄植物，是一种以利用茎叶为主的一年生禾本科饲用作物。高丹草表现出了显著的杂种优势，它同时结合了高粱抗寒、抗旱、耐倒伏、产草量高等特性和苏丹草分蘖性和再生性强、营养价值高、适口性好等优良特性。目前，高丹草在我国东北、西北、华北以及长江以南地区都有广泛种植，特别在我国西南农区，高丹草是夏季主要种植的牧草种类之一。

叶斑病是禾本科饲草普遍发展的病害之一，主要危害饲草的叶片和叶鞘，对饲草的产量和品质造成了严重的损坏致使饲草短缺。而目前叶斑病尚无特定的药物进行防治，生产上还不能有效控制发生蔓延。而且目前关于高丹草叶斑病研究报道较少，仅在高粱及苏丹草上有相关的报道，所以关于其病原尚不清楚，一定程度上阻碍了高丹草叶斑病病原生物学特性、药剂筛选、病害防治、抗病育种等深入研究。

在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：

已有的研究表明高梁和苏丹草叶斑病的致病菌较为复杂，多达20多种，在其亲本高粱及苏丹草中已报道的叶斑病主要类型中包括弯孢菌（Curvularia sp.）、蠕孢菌（Bipolaris sp.）、链格孢菌（Alternaria sp.）等。另外，由于叶斑病致病机理较为复杂，不同种植区域的优势病原菌也表现出不同，如在新疆、甘肃等地的苏丹草叶斑病病原菌均不同。即使是在同一地区，苏丹草叶斑病的优势病原菌也可能不同，如对南京地区的苏丹草叶斑病病原菌分离得到有新月弯孢菌和平脐蠕抱菌。所以这些研究都表明了高丹草叶斑病病原菌种类的复杂和多样，为高丹草叶斑病的防治造成干扰。

技术实现要素：

鉴于此，本发明目的在于提供一种高效、准确鉴定高丹草叶斑病病原菌的方法。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

a）病原菌的分离、纯化

采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接部，依次经第一酒精溶液表面消毒、次氯酸钠表面消毒、无菌水冲洗，采用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，恒温恒湿培养；

待病斑组织长出菌丝、菌落扩展，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，恒温恒湿培养；

b）病原菌的接种和再分离

采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用第二酒精溶液表面消毒，机械损伤叶表；将步骤a）分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆，粉碎菌丝，稀释菌丝悬浮液，吸取菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，叶片保湿培养，观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；

c）待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；

d）病原菌的分子鉴定

将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。

根据本发明高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述第一酒精溶液为75%酒精水溶液。

根据本发明高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述第二酒精溶液为70%酒精水溶液。

根据本发明高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述步骤b）中，粉碎菌丝至能用血球计数板计数。

根据本发明高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个具体实施方式，其特征在于，具体步骤如下：

a）病原菌的分离、纯化

采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接处直径约5mm的小块，用75%酒精表面消毒10s，再经5%次氯酸钠表面消毒3m，再用无菌水冲洗三次，无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，每皿4片，25℃恒温恒湿培养；待病斑组织长出菌丝、菌落直径扩展约1cm时，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，25℃恒温恒湿培养；

b）病原菌的接种和再分离

田间采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用70%酒精表面消毒，用灭过菌的剪刀刺伤叶片，将分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆；粉碎菌丝至能用血球计数板计数，稀释菌丝悬浮液至含菌丝段1×10⁶CFU/ml，吸取150μL菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，每叶片接种三点，每个菌接种6片叶片，叶片保湿培养，6天后观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；

c）待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；

d）将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。

根据本发明高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述高速匀浆机匀浆30s-60s。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

a)本发明通过准确鉴定高丹草叶斑病病原菌，技术人员结合不同栽培区域分离到病原菌种类及主要优势病原菌种群，来建立相应的防控方法。

b)本发明采用高速匀浆机匀浆，能够使菌丝均匀断裂，使菌丝在菌悬液中菌丝分布均匀。

c)本发明通过制备均匀菌悬液能够使高丹草叶片发明均匀，保证鉴定结果的准确性。

d)本发明高丹草叶斑病病原菌的鉴定方法简单、快速、准确。

附图说明

图1是本发明实施例分离到部分病原菌菌落形态图。

图2是基于ITS序列的供试病原菌NJ系统发育树。

具体实施方式

下面结合一个具体实施例进行说明。

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

高丹草叶斑病是国内外高丹草种植区最常见的病害，此病自幼苗至成株期均可发生，主要危害叶片和叶鞘；病斑紫红色，呈长方形或梭形；病斑扩展受叶脉限制，病健交界明显；严重时，病斑连成片，使叶片枯死。而且该病潜伏期短，来势快，造成严重危害。本实施例是在叶斑病暴发期，从四川省农业科学院土壤肥料研究所资阳试验地、新都试验地采集高丹草病叶30份，分别进行编号并带回实验室进行分离鉴定。

1、病原菌的分离、纯化

采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接处直径约5mm的小块，用75%酒精表面消毒10s，再经5%次氯酸钠表面消毒3m，再用无菌水冲洗三次，无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，每皿4片，25℃恒温恒湿培养。待病斑组织长出菌丝、菌落直径扩展约1cm时，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，25℃恒温恒湿培养。

2、病原菌的接种和再分离

田间采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用70%酒精表面消毒，用灭过菌的剪刀刺伤叶片，将分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆，粉碎菌丝至能用血球计数板计数，稀释菌丝悬浮液至含菌丝段1×10⁶CFU/ml，吸取150μL菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，每叶片接种三点，每个菌接种6片叶片，叶片保湿培养，6天后观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照。

3、待病害症状稳定后，采集病样，再重复上述步骤分离病原菌，获得分离物与原分离物一致，则说明分离物为该病症致病菌。

4、病原菌的分子鉴定

病原菌的分子鉴定方法参考^[7]进行。将保存的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，扩增产物送上海生工进行测序获得产物序列。将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。

对30张病叶样通过分离、纯化培养，获得3种不同菌落形态的分离物，图1示出了分离到部分病原菌菌落形态，其中培养皿A中病原菌为镰刀菌、培养皿B中病原菌为球孢黑孢霉、培养皿C中病原菌为链格孢、培养皿D中病原菌为球孢黑孢霉、培养皿E中病原菌为链格孢、培养皿F中病原菌为镰刀菌。

分离物1共有24株，在PDA上菌丝呈放射状生长，生长迅速，呈圆形扩散，中间颜色逐渐变深最后成褐色或黑色，分生孢子单生，褐色，棍棒形值椭圆形，有多个纵横膈膜，形态学初步鉴定为链格孢属真菌。

分离物2共有19株，菌丝体白色，气生菌丝发达，分生孢子梗分枝，屈曲，无色至褐色，光滑，分生孢子单孢，椭圆形至球形，单个顶生，初步鉴定为球孢黑孢霉。

分离物3菌丝绒毛状、生长迅速，后期产色素致使底物变为红褐色，菌丝有隔分枝，分生孢子梗分枝，分生孢子镰刀形，有横隔，初步鉴定为镰刀菌属真菌，共分离到1株。

从样品来源上看，采集自资阳的叶片分离出3种病原菌，主要为链格孢菌和球孢黑孢霉菌，仅有1株镰刀菌。而采自新都的叶片分离到只分离到2种病原菌，即链格孢菌和球孢黑孢霉菌。部分病原菌分离来源及鉴定结果见表1。经柯赫氏法验证，球孢黑孢霉（编号1-2）和链格孢属（编号1-1-1）真菌导致了本实施例中高丹草的叶斑病。

采用ITS1/ITS4引物对病原菌的ITS片段进行特异性扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测在500bp左右处均能扩增出特异性较好的DNA片段。对特异扩增的片段进行回收并进行双向测序。将测出的序列与GENEBANK中序列进行了比对。BLAST结果表明所得到了两种病原菌1-1-1、1-2的序列分别与链格孢菌属（Alternaria sp.）和黑孢霉属（Nigrospora sp.）物种具有极高的相似性，这与形态学鉴定的结果相吻合，对病原菌种类的确定得到了进一步的佐证。基于ITS序列构建了病原菌的NJ系统发育关系树（选用stemphylium sp.为外类群），如图2所示，结果表明供试的供试1-1物种与A. tenuissima、A. burnsii、A. alternata等亲缘关系较近；1-2物种与Nigrospora sphaerica的关系较近。

高丹草是高粱和苏丹草的杂交种，其从遗传背景及生理代谢方面都表现相同或相似的特点，所以高粱和苏丹草的叶斑病致病病原菌也很有可能在高丹草中发生。本实施例对来自四川地区的高丹草叶斑病致病病原菌进行分离鉴定，而结果也证实了与以前报道的有所不同，如球孢黑孢霉菌引起的高丹草叶斑病等。这也说明了病害防治过程中，应该结合不同栽培区域分离到病原菌种类及主要优势病原菌种群来建立相应的防控方法。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。