一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于青枯病技术领域，具体设及一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应 用。
【背景技术】
[0002] 桑树青枯病是一种毁灭性±传病害，其发病速度快，蔓延迅速，发病范围广，严重 时发病面积达90%W上，使得桑叶产量急剧下降直至绝收，给蚕农造成了严重的经济损失。 桑树青枯病一旦爆发，防治非常困难。但在早期检测出病害的发生，可W通过病株拔除、农 药灌根、±壤消毒等方法有效预防青枯病的大面积爆发。
[0003] 目前，对青枯病鉴定的方法主要有表型鉴定和培养基病原菌分离鉴定。表型鉴定 即通过观测桑叶和桑根的发病表型特征来判定青枯病的发生。由于植株病症表型在发病中 后期才能观测到，而青枯病中后期防治比较困难，因此运种方法对青枯病的防治意义不大。 培养基病原菌分离鉴定即利用TTC培养基分离病根木质部中的病原菌，通过观察病原菌形 态鉴定青枯病的发生。运种方法能在较早期检测青枯病的发生，但培养中易出现肠杆菌等 杂菌污染，影响鉴定的准确度。因此发明一种早期快速的桑树青枯病鉴定方法，为桑树青枯 病早期诊断和防治提供理论基础，对保障蚕桑产业稳产持续发展具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种桑树青枯病鉴定的特异性引物，该引物特异性 强，快速、灵敏。 阳〇化]本发明的第二个目的在于提供一种早期快速鉴定桑树青枯病的方法，该方法在发 病早期能快速鉴定桑树青枯病，为防治桑树青枯病的发生提供可靠的依据。
[0006] 本发明的最后一个目的在于提供上述桑树青枯病鉴定的特异性引物在制备具有 鉴定桑树青枯病功能的药物中的应用。
[0007] 本发明的第一个目的是通过W下技术方案来实现的：一种桑树青枯病鉴定的特异 性引物，由上游引物RS-16S-F和下游引物RS-16S-R组成，所述上游引物RS-16S-F的核巧 酸序列如SEQIDNO: 1中所示，所述下游引物RS-16S-R的核巧酸序列如SEQIDNO:2中所 /J、-O
[0008] 根据NCBI数据库中桑树青枯菌的ieSrRNA(GenBankID:JXl12350)序列特征，利 用PrimerPremier5.0和01igo6.0设计和筛选了上述桑树青枯菌巧光PCR特异性引物 (RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT如沈QIDNO:1 中所示/RS-16S-R:TCGAGCACCTAA TGCATCTCTGCTTC，如SEQIDN0:2中所示）。该引物对理论扩增片段大小为IWbp，该引物 可由华大基因等公司合成。
[0009] 本发明的第二个目的是通过W下技术方案来实现的：一种早期快速鉴定桑树青枯 病的方法，包括W下步骤：
[0010] (1)取疑似青枯病桑树的根部，提取该桑树根部的DNA;
[00川 似W该桑树根部的DM为模板，利用上述桑树青枯病鉴定的特异性引物 RS-16S-F/RS-16S-R进行巧光定量qPCR; 阳01引 做记录该桑树根部的DNA的qPCR反应体系的Ct值，当Ct值《36时，表明有桑 树青枯菌的存在，该桑树为发病植株；当Ct值> 36时，表明没有桑树青枯病的存在，该桑树 为健康植株。
[0013] 步骤（1)中优选采用DNAiso reagent kit试剂盒提取桑树根部的DNA。
[0014] 步骤似中巧光定量qPCR优选采用Roche Li曲t切Cler480实时巧光PCR仪和 SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行。 阳01引步骤似中巧光定量qPCR的反应体系优选包括：SYBRPremixEx TaqII(2X) 10. 0化、浓度为10yM的上游引物RS-16S-F0. 8化、浓度为10yM的下游引 物RS-16S-R0. 8yL模板 2. 0yL双蒸水 6. 4yL。
[0016] 步骤（2)中巧光定量qPCR的扩增程序优选为：第一步95°C预变性30s，第二步 95°C变性5s，60°C退火30s，72°C延伸15s，45个循环。
[0017] 步骤做中Ct值的确定方式优选为：选取桑树青枯病菌，配制一组具有浓度梯度 的桑树青枯病菌溶液，W该组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液为模板，利用权利要求1 中的桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行巧光定量qPCR，记录该组具有 浓度梯度的桑树青枯病菌溶液的Ct值，建立Ct值与桑树青枯病菌溶液各浓度log值之间 的线性关系，将最低浓度的桑树青枯病菌溶液的Ct值作为评判该桑树是否具有桑树青枯 病的临界值。 阳01引其中最低浓度的桑树青枯菌溶液的浓度为0. 95XIO2~1. 05X10 2CFU/mL。
[0019] 本发明的第=个目的是通过W下技术方案来实现的：上述桑树青枯病鉴定的特异 性引物在制备具有鉴定桑树青枯病功能的药物（如试剂盒等）中的应用。
[0020] 本发明具有如下优点：本发明中的桑树青枯病鉴定的特异性引物，灵敏、高效、特 异性好，本发明通过设计桑树青枯菌ISSrRNA的特异引物，结合巧光定量PCR的方法，在发 病早期快速鉴定桑树青枯病，为防治桑树青枯病的发生提供可靠的依据。
【附图说明】
[0021]图1是实施例1中青枯菌巧光PCR引物特异性检测。泳道1、2模板为桑青枯菌 DNA;泳道3、4模板为桑肠杆菌DNA;泳道5、6模板为桑假单胞菌DNA;泳道7、8模板为桑欧 文氏菌DNA;泳道9、10模板为桑黄单胞菌DNA;M为2000bpDNALadder;
[0022] 图2是实施例I中待测菌株与已知青枯菌ieSrRNA序列比对； 阳02引图3是实施例2中细菌含量Log值和qPCRCt值的标准曲线；
[0024]图4是实施例3中青枯菌侵染前和侵染后桑根样本的Ct值。
【具体实施方式】 阳〇2引 实施例1
[00%] 桑树青枯菌特异引物的设计与验证
[0027] 1. 1根据NCBI数据库中桑树青枯菌的ieSrRNA(GenBankID:JXl12350)序列特征， 利用PrimerPremier5. 0和01igo6. 0设计和筛选了一对桑树青枯菌巧光PCR特异性引物 (RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT/RS-16S-R:TCGAGCACCTAATGCATCTCTGCTTC)。该引 物对理论扩增片段大小为IWbp，该引物由华大基因公司合成。引物稀释前先在4°C条件 下，W1XIO4巧m离屯、2min，然后加入去离子水配成10yM的胆存液保存于-20°C待用。
[0028] 1. 2桑树肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌为对照，所有实验菌株均接种于 LB液体培养基中，在恒溫气浴摇床中W20化pm的转速，在30°C条件下过夜培养，待ODe。。为 1时即可取样。采用DNAisoreagentkit(Takara,Otsu,Japan)提取各菌株的DNA，保存 于-20°C条件下待用。
[0029] 1. 3W各菌株DNA为模板，利用青枯菌巧光PCR特异性引物RS-16S-F和RS-16S-R 进行常规PCR扩增，PCR反应体系如下：25iiL的反应体系中包含12.5iiLTaqPCR Mix(2X)，8. 5化双蒸水，2化模板，1化上游引物RS-16S-F，1化下游引物RS-16S-R。 扩增反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，30个循环； 72°C延伸5min，4°C保存。PCR完成后，产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0030] 1. 4同时将电泳条带切胶回收，连接到T-easy载体上，并转化至E.CO1i中，获得阳 性菌落并送至公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对，确定其菌属类型。 阳03U 1.5结果
[0032] 1. 5. 1W桑树肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌为对照，利用青枯菌特异性 引物RS-16S-F和RS-16S-R进行常规PCR，电泳分析结果表明：仅青枯菌能扩增出条带，而 对照菌株肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌均未扩增出条带，详情见图1。
[0033] 1.5. 2将电泳条带回收转化并测序后，将测序结果在NCBI上已知的青枯菌 ieSrRNA序列化T748524)进行比对，比对结果表明，该序列为青枯菌的ieSrRNA特征序列， 详情见图2。
[0034] 综上所述，该青枯菌引物的特异性好，可用于后续青枯菌的巧光定量分析实验。 阳0对实施例2
[0036] 早期快速鉴定桑树青枯病的方法
[0037] 2. 1Ct值的确定 阳03引2.1.1将1 X IO8CFlVmL的青枯菌悬液按梯度进行稀释，使其终浓度分别为1 X108、5 X1〇7、1 X1〇\5 X1〇6、1 X1〇6、1 X1〇5、1 X1〇4、1 X1〇3、1 Xl〇2c即/mL。
[0039] 2. 1. 2取2yL各梯度稀释的菌悬液为模板，利用引物对RS-16S-F/RS-16S-R进行 巧光定量qPCR实验。qPCR采用Roche Li曲t切Cler 480实时巧光PCR仪和SYBR Premix Ex !"aq?灯akar,Otsu,Japan)试剂盒进行。20JiLqPCR反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq II(2 X)10.0祉，上游引物RS-16S-F (10yM) 0. 8yL下游引物RS-16S-R(10yM) 0. 8yL模 板2.双蒸水6.4yL。扩增程序如下：第一步95°C预变性30s，第二步95°C变性5s， 60°C退火30s，72°C延伸15s，45个循环，PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特 异性。每个qPCR反应重复3次。
[0040] 2. 1. 3记录qPCR反应体系的Ct值，并分析其与青枯菌悬液浓度的相关性。
[0041] 结果表明，利用qPCR技术对各梯度稀释的青枯菌悬液进行检测，记录Ct值， 并分析菌液浓度的Log值和对应的循环阔值（Ct)的相关性。如图3所示，菌液浓度在 IO2~10