一种用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂、其制备方法及应用与流程

本发明属于微生态制剂技术领域，具体涉及一种用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂、其制备方法及应用。

背景技术：

据报道，全国畜禽粪便年产生量约为19亿吨，是工业固体废弃物的2.4倍，再加上污水的排放量，我国每年养殖业排出的废物高达60多亿吨；畜禽废弃物污染已成为污染的主要原因之一。畜禽饲养量不断增长的同时，农村建设用地使有效承载畜禽废弃物的农田面积减少，跟着集约化养殖模式不断增加，畜禽废弃物的产出量超出当地农田可承载的负荷，对环境造成严重的污染。

2003年国家正式实施《畜禽养殖业污染物排放标准》；2013年10月8日国务院第26次常务会议通过，于2013年11月公布了《畜禽规模养殖污染防治条例》。要求各级政府从政策、资金、技术和项目建设上给予养殖业大力扶持，走“生态型、福利型”环保之路，依照“种养结合、生态环保、循环经济”新模式，奉行创新型养殖新技术，促进养殖业与种植业的有序发展。

畜禽废弃物无害化处理的方法主要有三种，分别是生物、化学与物理处理法。化学方法是利用化学试剂对粪便进行处理的一种方法，其原理是粪便中的有机物质与化学物质发生反应，例如H₂S可以氧化成硫化氢还可以氧化成硫或二氧化硫，由于效果不稳定，使得该技术应用效果不好。物理方法主要包括热喷处理、高温干燥、膨化处理以及自然干燥等，但是，物理处理方法还存在一定的缺陷，比如，自然干燥虽然成本低，但处理过程中存在耗时长、有氨气等臭气产生等缺点，高温干燥法存在生产设备投资大、耗能高、排出的气体易造成二次污染等缺点。生物方法是指在特定的环境下，利用微生物来处理畜禽粪便，生物方法具有肥效高、成本低等特点；另外，生物处理方法还具有灭菌与除臭的功效，是一种较为合理的生态处理方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂、其制备方法及应用，利用该复合微生态制剂发酵畜禽排泄物，可降低其中的pH和大肠杆菌数量（P>0.05），并使吲哚的含量降低58%（P<0.05），对于消除粪便的臭味具有重要意义。

本发明采用如下技术方案：

一种用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂，以100g畜禽排泄物计，需要加入的复合微生态制剂由以下体积的菌液混合而成：干酪乳杆菌 0.03~0.10 mL、粪肠球菌 0.03~0.10 mL、产朊假丝酵母菌0.05~0.50 mL、枯草芽孢杆菌 0.03~0.10 mL，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的有效活菌数均为1.0×10⁹ cfu/mL。

上述的用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂，以100g畜禽排泄物计，需要加入的复合微生态制剂由以下体积的菌液混合而成：干酪乳杆菌 0.06 mL、粪肠球菌 0.07 mL、产朊假丝酵母菌0.15 mL、枯草芽孢杆菌 0.07 mL，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的有效活菌数均为1.0×10⁹ cfu/mL。

一种用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌株分别接种到MRS液体培养基、MRS液体培养基、YPD液体培养基和LB液体培养基，培养得到各自的菌液；

（2）然后将所得干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液按体积配比混合即得。

上述的用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂的制备方法，以100g畜禽排泄物计，步骤（2）中混合时，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的体积配比为：干酪乳杆菌 0.03~0.10 mL、粪肠球菌 0.03~0.10 mL、产朊假丝酵母菌0.05~0.50 mL、枯草芽孢杆菌 0.03~0.10 mL，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的有效活菌数均为1.0×10⁹ cfu/mL。

上述的用于畜禽排泄物处理的复合微生态制剂的制备方法，以100g畜禽排泄物计，步骤（2）中混合时，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的体积配比为：干酪乳杆菌 0.06 mL、粪肠球菌 0.07 mL、产朊假丝酵母菌0.15 mL、枯草芽孢杆菌 0.07 mL，所述干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液的有效活菌数均为1.0×10⁹ cfu/mL。

上述的复合微生态制剂在畜禽排泄物处理时的应用，取畜禽排泄物作为发酵培养基，将所述复合微生态制剂接种至所述发酵培养基中，35℃~42℃发酵培养100h~140h。

上述的复合微生态制剂在畜禽排泄物处理时的应用，取畜禽排泄物作为发酵培养基，将所述复合微生态制剂接种至所述发酵培养基中，37℃~42℃发酵培养120h。

本发明的有益效果如下：

本发明利用复合微生态制剂来处理畜禽排泄物，本发明中畜禽排泄物指畜禽粪便，无需化学物质的添加，也无需过多设备的使用，不会产生污染环境的有害气体，有效地降低了畜禽排泄物的处理成本，减少能耗，处理时间快。而且利用本发明所述复合微生态制剂来处理畜禽排泄物，兼具灭菌与除臭的功效，可降低其中的pH和大肠杆菌数量（P>0.05），并使吲哚的含量降低58%（P<0.05），对于消除粪便的臭味具有重要意义，处理后的畜禽排泄物可以作为肥料使用，是一种较为合理的生态处理方法。

附图说明

图1为吲哚含量标准曲线；

图2干酪乳杆菌和粪肠球菌对吲哚含量的影响；

图3干酪乳杆菌和产朊假丝酵母菌对吲哚含量的影响；

图4干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌对吲哚含量的影响；

图5粪肠球菌和产朊假丝酵母菌对吲哚含量的影响；

图6枯草芽孢杆菌和粪肠球菌对吲哚含量的影响；

图7枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌对吲哚含量的影响。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1 试验材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种选择

选用干酪乳杆菌（CGMCC1.62）Lactobacillus casei、产朊假丝酵母菌（CGMCC2.1004）Candida utilis、粪肠球菌（CGMCC1.101） Enterococcus faecalis、枯草芽孢杆菌（CGMCC1.504）Bacillus subtilis，且上述菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2仪器设备

电热恒温隔水培养箱（上海跃进医疗机械厂）；

立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；

BCM-1000型生物净化工作台（苏州净化设备有限公司）；

双层汽浴震荡器（江苏金坛杰瑞尔电器有限公司）；

PHS-2C酸度计（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂）；

79-1磁力搅拌器（金坛市中大仪器厂）；

高速冷冻离心机；

紫外分光光度计；

电子分析天平；

三角瓶；

培养皿。

1.1.3 菌种培养

培养枯草芽孢杆菌的LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。

枯草芽孢杆菌经过LB固体培养基培养筛选纯化之后，接种至LB液体培养基进行扩培，培养条件为37℃、200 r/min，培养时间为24 h，得到枯草芽孢杆菌的菌液；所得枯草芽孢杆菌的菌液的有效活菌数调整为1.0×10⁹ cfu/mL。

培养干酪乳杆菌和粪肠球菌的MRS液体培养基：胰蛋白胨15 g，酵母浸份10 g，葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠2 g、柠檬酸铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。

干酪乳杆菌和粪肠球菌分别经过MRS固体培养基培养筛选纯化之后，分别接种至MRS液体培养基进行扩培，培养条件为37℃、静置培养24 h，分别得到干酪乳杆菌和粪肠球菌的菌液；所得干酪乳杆菌和粪肠球菌的菌液的有效活菌数调整为1.0×10⁹ cfu/mL。

培养产朊假丝酵母菌的YPD液体培养基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用；固体培养基加入1.5%的琼脂。

产朊假丝酵母菌经过YPD固体培养基培养筛选纯化之后，接种至YPD液体培养基进行扩培，培养条件为28℃、200 r/min，培养时间为24 h，得到产朊假丝酵母菌的菌液；所得产朊假丝酵母菌的菌液的有效活菌数调整为1.0×10⁹ cfu/mL。

培养大肠杆菌的伊红美蓝培养基：（EMB，北京奥博星）：称取EMB 42.5 g，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用。培养条件为37℃、静置培养48 h。

下述单因素试验和响应面设计试验在使用干酪乳杆菌、产朊假丝酵母菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌时，均为使用上述所得各菌液。

1.2试验方法

1.2.1 单因素试验

将1.1.3所得干酪乳杆菌、产朊假丝酵母菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的菌液分别用于发酵畜禽排泄物，进行单因素试验。

以干酪乳杆菌为例进行说明单因素试验过程，其他菌种的单因素试验过程与此相同：

（1）首先测定畜禽排泄物中含水量为69.69%，取五只250 mL锥形瓶，每只锥形瓶中均加入200 g畜禽排泄物作为发酵培养基；

（2）上述五只锥形瓶分别作为一个对照组和四个试验组，且依次按0、0.05%、0.1%、0.5%和1 %的不同梯度的体积重量比接种1.1.3 菌种培养中所得干酪乳杆菌的菌液（例如0.05%的体积重量比是指100g的畜禽排泄物加入0.05mL的菌液），各不同梯度体积重量比的菌液均用对应培养基稀释至同等体积；所以分别取0mL、0.1mL、0.2mL、1.0mL和2mL干酪乳杆菌的菌液且均用LB液体培养基稀释至2mL，然后依次加入到对照组和试验组；

（3）对照组和试验组均在37℃培养箱中发酵培养120 h后，取样测含水量、干物质、总活菌数、大肠杆菌数、pH值、氮和吲哚含量等指标。

1）含水量的测定：采用国标GB/T6435-1986；

2）总活菌数：LB琼脂平板涂布法；

3）大肠杆菌数：伊红美蓝平板涂布法；

4）pH值：pH S-2C酸度计（天津赛得利斯实验分析仪器）；

5）N含量：GB/T6432-94；

6）吲哚乙酸（简称IAA）含量测定方法如下：

a． IAA标准曲线的绘制

IAA标准溶液的配制：精确称取IAA（A.R.）10 g，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至100 mL(其浓度为100 mg/mL)作为贮备液；然后用贮备液配成0 mg/mL（空白）、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL、15.0 mg/mL、20.0 mg/mL、25.0 mg/mL的系列浓度标准溶液，现用现配。

试剂A：由0.5 mol/L FeCl₃溶液15 mL、浓H₂SO₄（比重1.84）300 mL、蒸馏水500 mL配制而成，于使用前混合均匀，避光保存。

试剂B：由0.5 mol/L FeCl₃溶液10mL、35%高氯酸500 mL配制而成，于使用前混合摇匀，避光保存。

1 mL试液需加试剂A 4 mL或试剂B 2 mL，试剂A与试剂B可任选一种（试剂B比试剂A灵敏）

取试管8支（标记为0-7号），依次加入IAA系列浓度标准溶液2 mL，并分别加入试剂B 4 mL（或试剂A 8 mL）于40℃保温箱中暗保温30 min(加速显色反应)；于530 nm下比色，以OD值为纵坐标，以IAA浓度（mg/mL）为横坐标，绘制出一条标准曲线，如图1所示。

a． 样品IAA含量的测定

称取畜禽排泄物发酵培养后的样品10 g装入烧杯，加入0.1 mol/L的 NaOH溶液40 mL，于100℃水浴中煮沸15 min(上面加盖防止水分蒸干)，取出烧杯后再向其中加入0.1 mol/L 的NaOH溶液25 mL，充分摇匀后，用甲醇定容至100 mL，静置30 min，离心30 min取上清液，上清液即为样品的IAA提取液。

取试管两支，两支试管中均加入上述样品的IAA提取液2 mL和试剂A 8 mL，于40℃保温箱中显色30 min，在530 nm下比色（以双蒸水调零），记录OD值。根据下面的公式（1）计算得出样品中吲哚含量：

样品吲哚含量（mg/g）=(A×V1)/(W×V2) （1）

式中：A—标准曲线上查得的IAA浓度（mg/mL）；

V1—样品的IAA提取液体积（mL）；

W—称取的样品重量（g）；

V2—样品反应液总体积（mL），样品反应液总体积是指样品的IAA提取液和试剂A的总体积。

1.2.2 单因素试验结果

根据1.2.1中单因素试验中所述方法，分别进行干酪乳杆菌、产朊假丝酵母菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的菌液对畜禽排泄物的发酵培养试验，并设置对照组，对照组的处理过程与各试验组相同，区别仅在于不加入菌种，即菌种的加入量为0%，处理结束后进行各指标的检测。

1）数据统计和分析

试验所得数据采用SPSS软件进行ANOVA方差分析，结果用“平均数±标准差”表示，以P<0.05表示差异显著，所得数据如表1至表4所示。

表1 干酪乳杆菌发酵畜禽排泄物的单因素试验

注：同行大写字母相同表示差异不显著（P > 0.05），不同表示差异显著（P < 0.05）。

从表1可以看出，与对照组相比，在畜禽排泄物发酵过程中添加干酪乳杆菌，可不同程度地提高发酵温度，显著地降低氮含量、总活菌数、大肠杆菌数、干物质损失率和吲哚含量（P<0.05）；以乳酸菌添加量为0.5%时温度值最高、干物质损失率和吲哚含量最低。由于干酪乳杆菌0.05%与0.5%在提高发酵温度和降低吲哚含量方面无显著性差异(P>0.05)，因而在下一步的响应面设计试验中干酪乳杆菌的使用中心剂量为0.05%。

表2 产朊假丝酵母菌发酵畜禽排泄物的单因素试验

注：同行大写字母相同表示差异不显著（P > 0.05），不同表示差异显著（P < 0.05）。

从表2看出，产朊假丝酵母菌单因素试验中温度值、氮含量、pH值、总活菌数、大肠杆菌数、干物质损失率和吲哚含量对照组和各试验组差异显著（P<0.05）；产朊假丝酵母菌添加量为0.1%时温度值最高、吲哚含量最低（P<0.05），0.5%时大肠杆菌数和干物质损失率最低（P<0.05）。重点考虑吲哚含量因素，将0.1%产朊假丝酵母作为下一步响应面设计试验的中心剂量。

表3 粪肠球菌发酵畜禽排泄物的单因素试验

注：同行大写字母相同表示差异不显著（P > 0.05），不同表示差异显著（P < 0.05）

从表3可以看出，粪肠球菌单因素试验中温度值、pH值、总活菌数、大肠杆菌数、干物质损失率和吲哚含量对照组和各试验组差异显著（P<0.05）；粪肠球菌添加量在0.05%温度值最高、干物质损失率最低，1%时氮含量相对较高、吲哚含量最小，0.5%时大肠杆菌数最低。综合考虑，0.05%粪肠球菌作为下一步响应面设计试验的中心剂量。

表4 枯草芽孢杆菌发酵畜禽排泄物的单因素试验

注：同行大写字母相同表示差异不显著（P > 0.05），不同表示差异显著（P < 0.05）

从表4可以看出，枯草芽孢杆菌单因素试验中温度值、氮含量、总活菌数、干物质损失率和吲哚含量对照组和各试验组差异显著（P<0.05）；枯草芽孢杆菌添加量在0.05%时干物质损失率最低，在0.5%时温度值最高，在1%时吲哚含量最小。综合考虑，0.05%枯草芽孢杆菌作为下一步响应面设计试验的中心剂量。

实施例2

2.1 复合微生态制剂

根据实施例1中单因素试验结果，干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌的菌液对畜禽排泄物进行发酵培养，均能不同程度地降低其中的大肠杆菌数和吲哚含量，消除畜禽排泄物的臭味，对畜禽排泄物的无害化处理发挥着重要作用。

本实施例中，以100g畜禽排泄物计，将以下体积范围的菌液：干酪乳杆菌 0.03~0.10 mL、粪肠球菌 0.03~0.10 mL、产朊假丝酵母菌0.05~0.50 mL、枯草芽孢杆菌 0.03~0.10 mL，取不同的体积数值进行组合（见下表5），混匀后得多种组合的复合微生态制剂，并将该复合微生态制剂分别做畜禽排泄物的发酵培养试验，发酵培养的试验方法同1.2.1中的方法，即采用250 mL锥形瓶，畜禽排泄物取样量为200 g作为发酵培养基，按配比接种所得复合微生态制剂，置于37℃培养箱，120 h后取样，检测相关指标（见下表6）。

2.2 最优复合微生态制剂的响应面回归设计

2.2.1 试验设计

根据单因素试验的结果，将加入量为以下体积重量比的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）：0.05%、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）：0.05%、产朊假丝酵母菌（Candida utilis）：0.10%、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：0.05% 作为四因素进行响应面回归设计，表5为试验因素水平编码；将吲哚含量作为响应值R1，表6为试验设计与结果。试验设计和分析采用Design-expert软件。

试验所得到的回归方程为：R1=0.12 + 0.007275A + 0.013B + 0.010C - 0.011D + 0.027AB - 0.00285AC - 0.007625AD - 0.011BC + 0.0041BD + 0.008025CD + 0.009164A² + 0.022B² - 0.004736C² + 0.016D²。

表5因素水平编码

注：表5中所列各菌液的用量是以100g畜禽排泄物为基准。

表6试验设计与结果

如表6所示为试验设计与结果，并结合如下图2至图7所示的响应面分析结果：

从图2可知，干酪乳杆菌和粪肠球菌交互作用对降低畜禽粪中吲哚的含量有显著影响，粪肠球菌在0.07%及乳酸菌在0.06%左右时，吲哚含量最小。

从图3可知，产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌交互作用对降低畜禽粪中吲哚含量有一定的作用。产朊假丝酵母菌在0.1%及干酪乳杆菌在0.06%左右时吲哚含量最低。

从图4可知，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌交互作用可显著地降低畜禽粪中吲哚的含量。

从图5可知，粪肠球菌和产朊假丝酵母菌交互作用对降低畜禽粪中吲哚的含量有明显影响，粪肠球菌在0.07%及产朊假丝酵母菌在0.15%时吲哚含量较低。

从图6可知，粪肠球菌和枯草芽孢杆菌交互作用可显著地降低畜禽粪中吲哚的含量，两者在0.07%左右时吲哚含量最低。

从图7可知，产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌交互作用对降低畜禽粪中吲哚的含量较显著，枯草孢杆菌在0.07%及产朊假丝酵母菌在0.15时吲哚含量较低。

因此，复合微生态制剂与畜禽排泄物的体积重量比为以下数值时，处理效果最佳：干酪乳杆菌0.06%、粪肠球菌0.07%、产朊假丝酵母菌0.15%、枯草芽孢杆菌0.07%；即复合微生态制剂所包括各菌液的最佳配比为：以100g畜禽排泄物计，干酪乳杆菌0.06 mL、粪肠球菌0.07 mL、产朊假丝酵母菌0.15 mL、枯草芽孢杆菌0.07 mL。

2.2.2 响应面回归设计方差分析

从表7响应面回归方程系数的方差分析结果可知，模型Prob>F值小于0.01，表明该模型可信度高，因此得到的复合微生态制剂的最佳配比可信度高。

表7响应面回归方程系数的方差分析

注：Prob>F的小于0.05说明模型或考察因素有显著影响，Prob>F的小于0.01说明影响极其显著。

实施例3：复合微生态制剂对畜禽排泄物大肠杆菌和臭气的影响

将实施例2中所得最佳配比的复合微生态制剂进行畜禽排泄物的发酵培养试验，以100g畜禽排泄物计，将以下体积的菌液：干酪乳杆菌0.06 mL、粪肠球菌0.07 mL、产朊假丝酵母菌0.15 mL、枯草芽孢杆菌0.07 mL，混匀后得复合微生态制剂，并将该复合微生态制剂做畜禽排泄物的发酵培养试验，发酵培养的试验方法同2.1中的方法，即采用250 mL锥形瓶，取样量为200 g，按配比接种所得复合微生态制剂，置于37℃培养箱，120 h后取样，检测相关指标。

表8 复合微生物制剂发酵畜禽排泄物中pH值、吲哚含量和大肠杆菌数量的变化(n=6)

从表8可知，利用最佳配比的复合微生态制剂发酵畜禽排泄物，可降低其中的pH和大肠杆菌数量（P>0.05），并使吲哚的含量降低58%（P<0.05），对于消除粪便的臭味具有重要意义。

最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。