本发明属于医药技术领域，具体涉及一种绿色酶法合成头孢丙烯的方法。
背景技术：
头孢丙烯（Cefprozil）化学名称为(6R,7R)-7-［(R)-2-氨基-2-（对羟基-苯基）乙酰氨基］-8-氧代-3-丙烯-5-硫杂-1-氮杂双环［4.2.0］辛-2-烯-2-羧酸-水合物，是美国百时美-施贵宝公司研制的第二代非酯型口服头孢菌素类广谱抗菌药，也是FDA批准的第一个可用于治疗儿童中耳炎和鼻窦炎的口服头孢菌素类抗生素。其抗菌作用机理与其他头孢类抗生素相似，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌的抗菌活性强，其中对革兰氏阳性细菌的抗菌活性突出。头孢丙烯在临床上可用于敏感菌所致的轻、中度感染，包括上下呼吸道感染，以及皮肤和皮肤软组织感染。2010年该药品的世界销售额为10亿美元，在世界前200个畅销药中列第120位。
目前，已报道的合成头孢丙烯的方法主要是采用化学合成法，按起始原料划分，主要有为GCLE和7-ACA两条路线，如美国专利US4694079、中国专利CN200810056349.1、头孢丙烯的合成（中国医药工业杂志，2004,35（7）：388等。以GCLE为起始原料合成头孢丙烯存在合成步骤长、操作复杂以及三废排放多、对环境污染大等缺点，并且收率只有65%左右。以7-ACA为起始原料的合成路线，工艺路线较GCLE路线相对简单，环境污染也小一些。但目前市场上7-ACA的价格持续上涨，导致以7-ACA为起始原料的合成路线渐渐失去了价格优势。另外这两条合成路线，均要用到超低温的冷冻机组或者液氮来满足低温反应要求，从而造成工艺路线的能耗极大，同时，上述方法的反应条件苛刻，对溶剂和起始物料的水分要求极高，导致工业化大生产繁琐，生产风险较大。
为此，药学工作者努力寻找绿色环保、低碳的合成技术。孙百虎（天津大学硕士论文，2012）和CN104928340等报道了一种酶法合成头孢丙烯的方法，但是这些方法仍存在反应时间长，收率低等问题，不能达到工业化生产的要求。因此，仍需寻求一种绿色酶法合成头孢丙烯的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种绿色酶法合成头孢丙烯的方法，本发明提供的方法得到的产品收率和纯度较高，对底物的选择性更强。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的头孢丙烯。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种绿色酶法合成头孢丙烯的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将母核7-APRA或其盐酸盐加入缓冲液中，于pH为5～8条件下加入D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物和/或D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
S2：向步骤S1中加入头孢丙烯合成酶，于温度为15～30℃、pH为6.5～7.8条件下反应1～3小时，反应结束后分离出反应液和固定化头孢丙烯合成酶得头孢丙烯粗品；
S3：将步骤S2所得粗品经过酸解溶清、过滤、重结晶后即得头孢丙烯；
其中，步骤S2中所述头孢丙烯合成酶为固定化青霉素G酰化酶II、青霉素酰化酶IPA-IIP、青霉素酰化酶SIPA-III、青霉素酰化酶SIPA-IV或青霉素酰化酶SIPA-V中的一种或几种。
在本发明中，D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物包括但不限于D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸乙酯、D-对羟基苯甘氨酸异丙酯、D-对羟基苯甘氨酸乙二醇酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐、D-对羟基苯甘氨酸乙酯盐酸盐，或其中任意两种或两种以上的混合物。
现有技术中在合成头孢丙烯时，均选用将母核7-APRA溶解在水中，而这使得体系的pH过高，导致部分7-APRA会分解，同时反应过程中需不断加入酸液或碱液来调节体系的pH，而这必将会对头孢丙烯的合成有影响，进而影响到产物的收率和纯度；发明人发现，当将母核7-APRA或其盐酸盐加入缓冲液中后，体系的pH较为稳定，波动范围很小，从而确保了头孢丙烯稳定的合成。
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～8.0；更为优选地，所述缓冲液的pH为7.5。
优选地，所述头孢丙烯合成酶为固定化青霉素G酰化酶II，与普通的头孢丙烯合成酶相比，该酶的用量更少，催化效率更高，能循环使用250～300批次，比普通酶的循环次数高出50～100批次。
优选地，所述步骤S2中，固定化头孢丙烯合成酶在反应体系中的浓度为8～50U/mL。
优选地，所述步骤S2中，反应直至7-APRA或其盐酸盐的残留浓度为0～0.8mg/mL时反应结束。
优选地，步骤S2中的反应时间为1.5～2.5小时。优选地，步骤S3中，所述酸解溶清的pH为0.5～1.5，酸解溶清所用的酸为0.5～6mol/L的盐酸、硫酸、甲酸、乙酸或三氟乙酸；更为优选地，所述酸解溶清的pH为1.0～1.1。
优选地，所述重结晶的反应温度为0～20℃、反应pH为5.5～5.6；更为优选地，所述重结晶的反应温度为10～15℃、反应pH为5.6。
在本发明中，所述析晶用的碱液为三甲胺、三乙胺、氨水、环己氨、二环己氨、苯胺、苯甲胺、吡啶、哌啶、二异丙基乙基胺、三丁胺、N,N-二甲基苯胺、正丁胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、磷酸钾或氟化铯溶液。
优选地，所述碱液的浓度为0.5～6mol/L，更为优选地，所述碱液的浓度为3 mol/L。
在本发明中，调混合液pH值所用的酸为无机酸或有机酸包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或者两种及以上的混合物；调混合液pH值所用的碱为无机碱或有机碱，包括但不限于三甲胺、三乙胺、氨水、环己氨、二环己氨、苯胺、苯甲胺、吡啶、哌啶、二异丙基乙基胺、三丁胺、N,N-二甲基苯胺、正丁胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、磷酸钾或氟化铯溶液中的一种或者两个及其以上的混合物。
优选地，所述步骤S1中，母核7-APRA或其盐酸盐与D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物和/或D-对羟基苯甘氨酸酰胺的摩尔比为1:1.0～1:1.15。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的酶催化合成头孢丙烯的方法对底物的选择性更强，将底物由D-对羟基苯甘氨酸衍生物扩充到了D-对羟基苯甘氨酸酰胺，并且所得产品收率和纯度较高，所得头孢丙烯含量（HPLC）不低于99.5%，重量收率不低于130％，另外本发明提供的方法不需要经过活性炭脱色就能生产出合格的产品。
本发明提供的方法采用绿色酶法合成头孢丙烯，该方法不仅具有绿色环保的优点，同时反应条件温和、技术先进、经济效果显著，能克服现有的化学合成法成本高、大量使用有毒试剂、生产周期长的不足，能完全满足工业化生产的要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
实施例1
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260 mLpH为7.5的磷酸盐缓冲液，20g 7-APRA，在pH为5条件下加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g青霉素酰化酶SIPA-III，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始后，每30min取样一次送检，当APRA浓度小于0.3%(w/w)时停止反应，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20%硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品26.1g，重量收率为130.5%，纯度99.52%。
实施例2
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260 mLpH为7.5的磷酸盐缓冲液，20g7-APRA盐酸盐，在pH为7条件下加入18.3gD-对羟基苯甘氨酸甲酯；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g固定化青霉素G酰化酶II，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为15℃。反应开始后，每30min取样一次送检，当APRA浓度小于0.3%(w/w)时停止反应，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20% 硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用 3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品26.6g，重量收率为133.2%，纯度99.57%。
实施例3
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260LpH为7.5的磷酸盐缓冲液，60kg7-APRA，在pH为7.5条件下加入54.9kgD-对羟基苯甘氨酸甲酯；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入45kg青霉素酰化酶IPA-IIP，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始，每30min取样一次送检，当APRA浓度小于0.3%(w/w)时停止反应，用筛网分离酶跟反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20% 硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用 3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品79.2kg，重量收率为132.0%，纯度99.51%。
对照例1
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全。向酶反应器中加入260 mLpH为7.5的磷酸盐缓冲液，20g 7-APRA，在pH为5条件下加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g固定化青霉素酰化酶IPA-750，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应3小时后，生成头孢丙烯的含量约5%（使用面积归一法进行计算）。由此可见，固定化青霉素酰化酶IPA-750对D-对羟基苯甘氨酸酰胺不合适。
对照例2
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全。向酶反应器中加入260 mlpH为7.5的磷酸盐缓冲液，20g 7-APRA，在pH为5条件下加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g固定化青霉素酰化酶PGA-450，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始后，每30min取样一次送检，反应结束后停止反应，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20%硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品17.9g，重量收率为89.5%，纯度98.1%。
对照例3
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260 mL蒸馏水，20g 7-APRA，在pH为5条件下加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g青霉素酰化酶SIPA-III，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始后，每30min取样一次送检，当反应结束后，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20%硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品21.1g，重量收率为105%，纯度97.7%。
对照例4
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260 mLpH为7.5的磷酸盐缓冲液，20g 7-APRA，用6mol/L氨水溶液溶清后，搅拌5分钟，再加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g青霉素酰化酶SIPA-III，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始后，每30min取样一次送检，当反应结束后，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20%硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品17.82g，重量收率为89.1%，纯度96.2%。
对比例5
（1）检查仪器装置、物料是否准备齐全，向酶反应器中加入260 mLpH为9的磷酸盐缓冲液，20g 7-APRA，在pH为9条件下加入14.5g D-对羟基苯甘氨酸酰胺；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入15g青霉素酰化酶SIPA-III，反应过程中用6N盐酸维持反应pH在6.8～7.0，反应温度为18℃。反应开始后，每30min取样一次送检，当反应结束后，用筛网分离酶与反应液。
（3）所得混合液用质量分数为20%硫酸调pH至1.0～1.1，抽滤、所得滤液用3 mol/L氢氧化钠溶液在15℃调pH值至5.5～5.6。5℃下养晶30分钟后，抽滤、洗涤、干燥得头孢丙烯成品20.24g，重量收率为101.2%，纯度97.7%。