检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W（C100T)序列突变的方法和引物与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的引物、方法和试剂盒。

背景技术：

先天性角化不良症(dskeratosis eongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。NOP10位于15q14-q15位点负责编码端粒酶相关蛋白复合体组分蛋白的基因。NOP10蛋白是端粒酶相关蛋白复合体的核心蛋白之一，与dyskerin、NHP2、GAR1蛋白共同参与了真核生物核糖体的合成，前体mRNA剪接和端粒的维持。Walne等在先天性角化不良症患者中发现NOP10存在突变，该突变缩短了端粒酶的长度，并降低了TERC的表达量水平。

近年来，通过全基因组测序，发现NOP10基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。文献报道NOP10基因突变存在p.R34W(C100T)突变热点，该突变位点位于NOP10基因的第2外显子，并且能引起该基因第34密码子精氨酸到色氨酸的改变。该位点的变异能引起端粒酶RNA水平减低及端粒长度明显缩短，并降低了TERC的表达量水平。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行R34W突变进行筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。

本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第2号外显子全外显子序列，包括待检测的所有突变位点。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的引物，其特征在于，包括：扩增NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的正、反向引物；其碱基序列为：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC。

进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：NOP10-F:NOP10-R＝1:1。

进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：M13-F:M13-R＝1:1。

进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。

本发明的目的还在于提供一种检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)利用一对扩增引物NOP10-F和NOP10-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用一对测序引物M13-F和M13-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与NOP10基因野生型参考序列NOP10-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，步骤(2)中的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。

本发明的目的还在于提供一种检测NOP10基因第2号外显子突变位点

R34W(C100T)序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物NOP10-F和NOP10-R，测序体系反应液包括一对测序引物NOP10-F和NOP10-R，其特征在于：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，所述试剂盒包括NOP10基因野生型参考序列NOP10-ref。

进一步地，所述测序纯化液包括由虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I组成的测序纯化液。

本发明的有益效果：本发明设计了扩增NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列的正，反向引物，构建了稳定的Touch-down PCR扩增体系，对整个第2号外显子全外显子序列进行扩增，包含待检测的所有突变位点，同时在扩增时，富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对PCR扩增产物进行测序反应扩增、纯化后变性、直接测序检测NOP10基因第2号外显子突变位点R34W(C100T)序列中各突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。

附图说明

图1 NOP10基因PCR扩增电泳结果图。M为TAKARA DL2000。

图2样本1NOP10基因R34W检测结果图。

图3样本2NOP10基因R34W检测结果图。

图4样本3NOP10基因R34W检测结果图。

图5样本4NOP10基因R34W检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测NOP10基因第2号外显子全外显子序列的引物，包括：扩增NOP10基因第2号外显子全外显子序列的正、反向引物；其碱基序列为：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC。

优选地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

在检测中，先利用上述正、反向引物对NOP10基因第2号外显子全外显子序列进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述一对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。

检测NOP10基因第2号外显子全外显子序列的试剂盒，包括：样本DNA抽提试剂(例如使用天根生物的试剂盒来抽提样本DNA)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中

检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；扩增NOP10基因第2号外显子全外显子序列的正、反向引物NOP10-F(10μm)、NOP10-R(10μm)。

测序体系反应液包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：NOP10-F(3.2μm)、NOP10-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液试剂配制如下：

其中，NOP10-F和NOP10-R的碱基序列为：

阳性对照品：含有NOP10序列的溶液。

阴性对照品：无NOP10序列的溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

优选地，该试剂盒还包括NOP10基因野生型参考序列NOP10-ref，其碱基序列如下所示：

TTGACCATTGCATCTTCTATTTTCATGTTTGCCCTTTTTCGCGCTGGCCCCACCCCATTTCATCACTCCTGTACTGACATACATTCTGTGTTCCTGGAGCAGAAATTTGACCCGATGGGACAACAGACCTGCTCAGCCCATCCTGCTCGGTTCTCCCCAGATGACAAATACTCTCGACACCGAATCACCATCAAGAAACGCTTCAAGGTGCTCATGACCCAGCAACCGCGCCCTGTCCTCTGAGGGTCCCTTAAACTGATGTCTTTTCTGCCACCTGTTACCCCTCGGAGACTCCGTAACCAAACTCTTCGGACTGTGAGCCCTGATGCCTTTTTGCCAGCCATACTCTTTGGCATCCAGTCTCTCGTGGCGATTGATTATGCTTGTGTGAGGCAATCATGGTGGCATCACCCATAAAGGGA。

实施例2

检测流程：

(1)利用血液DNA抽提试剂盒(天根生物)提取血液样本中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：X＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测样本数。

(3)加样：将2ul步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2ul阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。

(4)Touch-down PCR扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得PCR扩增产物，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

(5)Sanger测序：

取9μl PCR扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：

将1μl纯化产物分别与测序引物M13-F(3.2μm)和M13-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序，获得PCR扩增产物的基因序列。

(6)结果判断：将(5)中获得的基因序列与NOP10基因野生型参考序列NOP10-ref进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

采用本发明核酸检测试剂盒检测临床样本。

取送检先天性角化不良患者抗凝血样本20例，按实施例2所述检测流程提取样本中的基因组DNA，配制试剂并检测。

将2ul按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。

电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物NOP10-F、NOP10-R对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样品1的NOP10基因R34W正向测序结果如图2所示，为野生型，未检测出R34W突变。

样品2的NOP10基因R34W正向测序结果如图3所示，为野生型，未检测出R34W突变。

样品3的NOP10基因R34W正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出R34W突变。

样品4的NOP10基因R34W正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出R34W突变。

检测结果如表1：

表1

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把NOP10基因第2号外显子全外显子序列序列包括在内了，并且测序结果完全准确。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出NOP10基因突变。