快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法与流程

本发明涉及分子标记技术，具体地指一种快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法。

背景技术：

黄颡鱼在分类上隶属于鲶形目，鲿科，黄颡鱼属，该属中主要有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼(江黄颡鱼)、岔尾黄颡鱼和光泽黄颡鱼等4种。黄颡鱼是我国淡水养殖中非常重要的一种经济鱼类，对生态环境适应性较强，广泛分布于我国淡水水体中，2014年养殖产量高达34万吨。因其具有肉质细嫩，营养丰富，含肉率高，除脊刺外没有肌间刺等优点，颇受广大消费者欢迎。

瓦氏黄颡鱼，是该属中个体最大、生长最快的种类，2龄鱼体重最高可达600g左右。瓦氏黄颡鱼的仔稚鱼和幼鱼的生长和成活率显著高于黄颡鱼(甘炼,2008)，以黄颡鱼为母本，以瓦氏黄颡鱼为父本杂交获得的子一代杂交黄颡鱼，从形态特征上比较接近黄颡鱼，但其在受精率和生长速度上比普通黄颡鱼有明显的优势(王卫民,2002；王明宝，2012)。因此，杂交黄颡鱼作为近年来崭露头角的一种养殖新品种，市场前景非常看好，在黄颡鱼养殖中占有相当大的比例。但是杂交黄颡鱼后代一般是不可育的，不能用于后期的苗种制备。

目前，从形态学上很难区分杂交黄颡鱼和普通黄颡鱼的苗种和成鱼。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法。该方法利用DNA标记进行种间鉴定成为可能。我们在黄颡鱼中克隆得到一个新基因Inad-like，并在瓦氏黄颡鱼中得到其基因组序列。通过Inad-like基因在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中的序列差异，我们筛选得到了一对可以将黄颡鱼、瓦式黄颡鱼以及其杂交种准确鉴定出来的标记，为黄颡鱼下一步的育种研究奠定了基础。

为实现上述目的，本发明提供的一种黄颡鱼inad-like蛋白的氨基酸序列为：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在90-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

编码上述蛋白的黄颡鱼inad-like基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了一种鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物对，其引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示所示。

利用上述引物对鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的方法，包括以下步骤：

1)提取黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA

选取1龄的黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种鱼各10条，剪取尾鳍，保存在100％的酒精中，使用醋酸铵提取法提取基因组DNA。

2)分子标记的选择

通过对黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼Inad-like基因序列进行比对分析，并设计上述引物对，并以黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA为模板分别进行PCR扩增；得到三个不同PCR产物；

3)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鱼的鉴定

以上述三个不同PCR产物PCR扩增的凝胶电泳结果来判断其种类，只扩增出一条1908bp条带的为黄颡鱼；只扩增出一条1178bp条带的为瓦氏黄颡鱼；同时扩增出1178bp、1908bp两条条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。

本发明的有益效果在于：

1)本发明首次在黄颡鱼中克隆一个新的基因，命名为inad-like。

2)本发明首次在黄颡鱼属，开发可以鉴定区分黄颡鱼、瓦式黄颡鱼以及杂交种的DNA分子标记。

3)本发明可以应用到实践中，区分市场上的三种类型的黄颡鱼，规范黄颡鱼市场，为黄颡鱼分子育种提供优良基础。

附图说明

图1为DNAMAN对两种鱼该基因的序列进行比对图；

图2为PCR扩增产物的凝胶电泳结果图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的方法

1)取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼各10尾，取样于武汉市江夏区上涉湖养殖基地。

2)黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA提取

取0.2g鳍条组织到1.5ml离心管中，加入600μl细胞裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mm/L，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM)和15μl蛋白酶K(10mg/ml)，将鳍条于离心管中剪碎，放置离心管于水浴锅中62℃水浴2-4h，每隔半小时轻摇离心管，直至充分裂解。取出离心管冷却至室温后，加入200μl 7.5M醋酸铵，上下摇匀，冰上放置5min，之后1,2000rpm 4℃离心10min，取上清液于新管中，1,2000rpm 4℃离心10min，取上清液500μl于新管中。加入600μl异丙醇，轻摇，析出沉淀，室温下静置1-2min，1,2000rpm 4℃离心5min，弃上清液。加入1ml 70％乙醇，轻摇混匀，1,2000rpm4℃离心10min，弃上清液，加入1ml无水乙醇，轻摇混匀，1,2000rpm4℃离心5min，弃上清液。

室温下干燥10-20min，加入100μl ddH₂O，静置20-30min完全溶解，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL。

3)inad-like基因的克隆

采用特异引物设计合成和染色体步移技术，得到黄颡鱼inad-like基因的全长。

4)序列比对分析

根据黄颡鱼Inad-like基因的外显子序列设计引物进行PCR扩增，并进行切胶回收以及TA克隆，经测序得到瓦氏黄颡鱼该基因序列，用DNAMAN对两种鱼该基因的序列进行比对，可发现在第六段及第七段外显子之间序列黄颡鱼较瓦氏黄颡鱼多出730bp(图1)。

5)分子标记的开发

根据上述片段大小差异，设计一对引物(表1)，

上游引物位于第6段外显子序列，下游引物位于第7段外显子序列，使用该对引物分别在三种黄颡鱼基因组DNA上进行PCR扩增。PCR反应体系为10μl：5.0μl MasterMix，上下游引物各0.5μl(10μm/L)，0.5μl DNA模版，加ddH₂O至10μl。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min50s，反应进行34个循环；最后再延伸7min。

表1.用于鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的引物序列信息

其中：F：上游引物R：下游引物

6)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鱼的鉴定结果

PCR扩增产物的凝胶电泳结果见图2，第一组为黄颡鱼，扩增条带大小为1908bp；第二组为瓦氏黄颡鱼，扩增条带大小为1178bp；第三组为黄颡鱼于瓦氏黄颡鱼杂交种黄颡鱼，扩增出两条条带，条带大小分别为1908bp、1178bp。鉴定成功率为100％，可以准确鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。