一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法与流程

本发明涉及植物提取领域，尤其是一种从罗汉果中提取及检测罗汉果苷的方法。

背景技术：

罗汉果里的葫芦烷型三萜苷类成分是甜味物质的主要部分，主要为罗汉果苷Ⅳ(mogroside Ⅳ)、罗汉果苷Ⅴ(mogrosideⅤ)，罗汉果苷IV、罗汉果苷V分子结构上相差一个葡萄糖基，理学性质接近，很难分离。公布号为CN104069152 A的发明专利，公开了一种罗汉果苷Ⅳ含量高的提取物制备方法，罗汉果→磨碎→提取→过滤→滤液→膜分离→吸附分离→洗脱1 →乙醇回收1 →树脂脱色→干燥→罗汉果甜苷粗品→水稀释→大孔树脂吸附→洗脱2 →乙醇回收2→减压干燥→罗汉果提取物。刘金磊,李典鹏,黄永林等.HPLC法测定不同生长期罗汉果苷ⅡＥ、Ⅲ、Ⅴ的含量[J].广西植物,2007,27(4):665-668，公开了用HPLC法测定同一产地不同生长期罗汉果中罗汉果苷ⅡE、Ⅲ、V的含量。采用外标法，检测条件为：色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(4.6 mm×150mm，5µrn)；柱温为25℃；流动相为乙腈-水(体积比25:75)；流速为l mL/min；检测波长为203 nm；进样量为20 µL。在上述条件下罗汉果苷ⅡE、罗汉果苷Ⅲ和罗汉果苷V色谱峰与其它组分达到了良好分离。但是没有从55天果龄罗汉果中提取罗汉果苷IV、苷V及同步检测的方法报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种从55天果龄罗汉果中提取及检测罗汉果苷IV、苷V的方法，所得到的罗汉果提取物中，罗汉果苷IV含量大于5.0%，罗汉果苷V含量大于15.0%，检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，出峰时间分开，实现同步提取、检测罗汉果苷IV、罗汉果苷V。

为了解决该技术问题，以质量比计，本发明采取的技术方案是：

1、前处理

取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，称重、捣碎均匀；得罗汉果浆，备用。选取55天果龄的新鲜罗汉果为了确保原料中罗汉果苷IV、罗汉果苷V的含量都足以满足同步提取和检测，便于后面步骤。

2、提取

采用乙醇水溶液加超声波辅助提取。确保罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步充分快速提取。

以质量比例计，优选料液比1:2，将60%乙醇水溶液加入罗汉果浆中，控制温度为50℃，进行提取；用53Hz的超声波辅助提取30min；将料液用离心机在2500r/min离心15min，抽滤；滤渣再用60%乙醇水溶重复提取一次；合并滤液，得到罗汉果初提液。

3、絮凝

用Ca（OH）₂乳浊液进行絮凝。除去罗汉果初提液中的杂质、果胶、蛋白质等，便于层析。

优选加入罗汉果浆质量15%的10%Ca（OH）₂乳浊液，进行搅拌絮凝；

发现罗汉果提取液明显出现大分子物质聚沉的现象，待降至室温后，冷藏后取出，用离心机在2500 r/min的速度离心15min，抽滤，得到澄清溶液。

4、回收乙醇。便于层析时D101大孔树脂对罗汉果苷IV、罗汉果苷V的充分吸附。

将到得澄清溶液浓缩至流浸膏状态，回收除去乙醇；加入纯水溶解流浸膏，得到提取澄清水溶液；

5、层析。采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行吸附、分离、纯化。

先上柱吸附，然后清洗、洗脱。

过柱条件：上样液，将得到提取澄清水溶液调到pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱，流速都使用每小时两倍柱体积过柱，60%乙醇洗脱液总用量为 3倍树脂床体积（BV），收集60%乙醇洗脱液。

6、减压浓缩，干燥。

将收集到的60%乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；将浓缩液进一步干燥，得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物。

在此基础上，用HPLC法对罗汉果提取物中罗汉果甜苷IV和甜苷V同时进行含量测定，检测步骤如下：

1、标准品的制备

用万分之一天平精确地称量8.2mg 98.56%的罗汉果甜苷V标准品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度。在25℃下用超声波药品处理机超声15min，溶解。并用微孔滤膜过滤所得溶液，将过滤后的液体置于进样瓶待检测。

再精确称量3.0mg 98.79%的罗汉果甜苷IV标准品，处理方法和上述方法相同，最后置于进样瓶待检测，做好标记。

2、供试品的制备

精确称量30mg左右的罗汉果提取物样品，置于10ml的容量瓶，分别做好标记，并用甲醇定容至刻度，超声波处理15min后，用针筒吸取样品上清液，并经过微孔滤膜处理，将过滤后的样品液置于进样瓶待检测，做好标记。

3、色谱柱条件

C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的质量比例为21:79；检测波长设为203nm；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。

4、处理流动相

将乙腈和纯水分别通过过滤装置，乙腈采用有机系滤膜，纯水采用水系滤膜；过滤是为了除去液体里的颗粒杂质，防止大颗粒物质进入高效液相色谱仪从而损坏仪器。

将过滤后的液体分装到干净的流动相瓶子，并用保鲜膜封住瓶口，留一个小孔，再超声处理20min，超声处理流动相是为了除去液体里的气泡。

所述的前处理、超声波水-乙醇提取、浓缩、柱层析、干燥、HPLC检测都为已知技术。

本发明具有下列优点和特性：

1、组合技术新颖。

采用取55天果龄的新鲜罗汉果为原料，采用60%乙醇水溶液加超声波辅助提取，控制料液比1:2，温度为50℃，用53Hz的超声波辅助提取30min；离心，用罗汉果浆质量15%的10% Ca（OH）₂乳浊液絮凝、离心、过滤、浓缩回收乙醇；采用D101大孔树脂对罗汉果提取澄清水溶液进行分离、纯化。pH为9.0，使用两倍柱体积每小时的流速过柱；过柱完成后依次用纯水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脱；收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥；得到有高含量的罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物。用HPLC法对提取物进行含量测定，色谱柱条件为C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的质量比例为21:79；检测波长设为203nm；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，出峰时间分开，所得到的罗汉果提取物中，罗汉果苷IV含量大于5.0%，罗汉果苷V含量大于15.0%，实现罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步提取和检测。这些技术特征组合在一起，顺序不能颠倒、密不可分、互相支持，共同作用，才能得到所属的技术效果，组合技术方案不是已知技术，不是简单的叠加，具有突出的实质性特点和显著的进步。

2、提取和检测方法组合在一起，实现罗汉果苷IV、罗汉果苷V同步高含量提取和检测，为研究罗汉果果龄与罗汉果苷IV、罗汉果苷V含量变化打下基础，具有实用性。

附图说明

图1：55天果龄罗汉果提取物HPLC图谱

图2：罗汉果苷Ⅳ和苷V标准品混合进样HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

高含量罗汉果苷IV、罗汉果苷V提取物同步提取方法：

1、取55天果龄的新鲜罗汉果2个，擦净并称重作好记录，捣碎机捣碎，得到罗汉果浆；以固液比1:2加入60%的乙醇水溶液，置于超声波仪器中。超声条件：超声波仪器频率53HZ、功率100W、温度50℃，超声30min后取出，冷却后纱布过滤，取滤液，将滤渣用相同法提取3次，合并3次滤液，待用。

加入罗汉果浆重量的15%的10% Ca（OH）₂悬浊液，并进行搅拌，此时会发现罗汉果提取液明显出现大分子物质聚沉的现象，待温度降至室温后，将装着罗汉果溶液的烧杯放入冰箱，2小时后取出，将溶液分批放入离心管，在离心机以2500 r/min的速度15min，合并上清液，最后抽滤得到澄清溶液。

（1）上柱

将处理过的澄清透明的罗汉果提取液置于大烧杯中，用4%的盐酸调节pH为9.0，避免由pH过高引起的吸附效果不好。

因为提取液过碱，皂苷成分多数会以离子形态存在，而D101树脂只能吸附分子形态物质；利用虹吸现象控制液体滴进柱子的速度，避免大量的液体灌入引起层析柱内树脂表面不平整。

（2）调节流速

利用层析柱底部的阀控制上样速度，速度为2BV/h；速度过慢会导致试验周期过长，影响实验效率，速度太快使树脂吸附皂苷类物质不完全；柱体积为200ml；用10ml的量筒精确测量每分钟流出的液体，推算准确的流出速度。

（3）水洗、20%乙醇洗脱

待罗汉果提取液完全通过树脂后，用蒸馏水进行清洗，清洗掉除了吸附在树脂之外的杂质等大颗粒物质，直到流出液为澄清透明状。

再用20%乙醇来洗脱树脂，除去部分水溶性杂质，速度控制在2BV/h。低浓度乙醇洗脱下来的洗脱液甜苷含量很低，而且还含有一些水溶性杂质，比如多糖类物质。

（4）60%乙醇洗脱

配制60%乙醇进行洗脱，速度控制在2BV/h，收集洗脱液500ml；

（5）浓缩干燥

将收集的500ml洗脱液用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，得到浓缩液；浓缩液用烘箱干燥，得到到含有罗汉果苷IV、罗汉果苷V的罗汉果提取物。经检测计算，新鲜罗汉果提取物的提取率达到1.7%。

用HPLC法检测步骤如下：

1）标准品的制备

用万分之一天平精确地称量8.2mg 98.56%的罗汉果甜苷V标准品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度，在25℃下用超声波药品处理机超声15min，溶解，并用微孔滤膜过滤所得溶液，将过滤后的液体置于进样瓶待检测。再精确称量3.0mg 98.79%的罗汉果甜苷IV标准品，处理方法和上述方法相同，最后置于进样瓶待检测，做好标记。

2）供试品的制备

精确称量30mg左右的样品，置于10mL的容量瓶，分别做好标记，并用甲醇定容至刻度，超声波处理15min后，用针筒吸取样品上清液，并经过微孔滤膜处理，将过滤后的样品液置于进样瓶待检测，做好标记。

3）色谱柱条件

C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的质量比例为21:79；检测波长设为203nm；流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10µL，跑柱30min。

4）处理流动相

将乙腈和纯水分别通过过滤装置，乙腈采用有机系滤膜，纯水采用水系滤膜；过滤是为了除去液体里的颗粒杂质，防止大颗粒物质进入高效液相色谱仪从而损坏仪器。

将过滤后的液体分装到干净的流动相瓶子，并用保鲜膜封住瓶口，留一个小孔，再超声处理20min，超声处理流动相是为了除去液体里的气泡。

5）样品检测

按照上述方法步骤进行检测。图1为55天果龄罗汉果提取物HPLC图谱，图2为罗汉果苷Ⅳ和苷V标准品混合进样HPLC图谱。将55天果龄的罗汉果所得的提取物进行检测，检测时，罗汉果苷IV、罗汉果苷V的吸收峰明显，出峰时间分开，55天果龄所得到的罗汉果提取物中，罗汉果苷IV含量为5.02%，罗汉果苷V含量为15.77%。

按照上述方法步骤将不同果龄的罗汉果分别进行提取，将所得提取物进行检测，得到的检测结果见表1。

由表1结果可见，不同果龄的罗汉果所含有的罗汉果苷IV、罗汉果苷V是不同的，变化规律也不一样。

本方法实现同步提取和检测罗汉果苷IV、罗汉果苷V，对罗汉果苷IV、罗汉果苷V与果龄的关系研究有着指导意义。

表1 不同果龄罗汉果苷IV、罗汉果苷V含量检测结果