一种霍山石斛的鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用于鉴定霍山石斛的方法。
背景技术：
：霍山石斛（Dendrobiumhuoshanense）是安徽省大别山区特有的、国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）。由于霍山石斛同属的近缘植物比较多，导致混淆品较多。目前市场上主要的混淆品为河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛。霍山石斛与同属混淆品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。丁小余等建立了枫斗类石斛的rDNAITS全序列数据库，其中包括霍山石斛一个单倍型的ITS序列，研究发现枫斗类石斛在ITS区的种间差异显著而稳定，并利用该数据库对部分石斛属植物进行了准确鉴别，但没有进行霍山石斛样品的鉴别（丁小余，王峥峥，徐红，徐珞珊，周开亚，枫斗类石斛rDNAITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别，药学学报，2002，37（7）：567）。栗丹等利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定（栗丹，李振坚，毛萍，严雪锋，淳泽，马欣荣，基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析，园艺学报，2012，39（8）：1539），但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。技术实现要素：为了实现霍山石斛快速的现场检测，本发明提供一种霍山石斛的鉴定方法。一种霍山石斛的鉴定操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP2s：5’-TTCGTGGGATGGGGTTC-3’，下游引物CP2a：5’-TGCACATCCGAGCCTGA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有霍山石斛。进一步限定的鉴定操作技术方案如下：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25µL，其中0.5µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10pmol的上游引物CP2s，1.0µL含量为10pmol的下游引物CP2a，2.5µL10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25mM的氯化镁水溶液，0.5µL浓度为10mM的dNTPs，0.5µL浓度为5U/µL的TaqDNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25µL；PCR扩增反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环；72℃10min。步骤（2）的具体操作如下：取5µLPCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；若PCR扩增产物中含有262bp的DNA片段，则所述待测样品为霍山石斛；若PCR扩增产物中未含有262bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。一种用于霍山石斛鉴定的试剂盒，将所述PCR反应体系中的上游引物CP2s和下游引物CP2a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP2s和下游引物外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成一个用于鉴定霍山石斛的检测试剂盒。进一步限定的试剂盒技术方案如下：根据进一步限定的鉴定操作技术方案所述的检测试剂盒，在每次检测时，需要从检测试剂盒中取用不同的物质，各种物质所取的量必须满足进一步限定的鉴定操作技术方案中PCR反应体系中各物质量的要求。本发明的有益技术效果体现在以下方面：1.本发明方法的操作步骤简单，只需要PCR仪、电泳仪和核酸检测仪等设备，即可实现对霍山石斛的准确鉴别。2.本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，携带方便，提高了检测操作的效率。附图说明图1为霍山石斛及混淆品的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100bp）；1：河南石斛；2：金钗石斛；3：铁皮石斛；4：霍山石斛；5：空白对照。图3为特异性PCR引物对CP2（上下游引物分别为CP2s和CP2a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100bp）；1：用特异性PCR引物对CP2扩增1个河南石斛样本的结果；2：用特异性PCR引物对CP2扩增1个金钗石斛的结果；3：用特异性PCR引物对CP2扩增1个铁皮石斛样本的结果；4：用特异性PCR引物对CP2扩增1个霍山石斛样本的结果；5：空白对照。图4为特异性PCR引物对CP2（上下游引物分别为CP2s和CP2a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100bp）；1到4：霍山石斛DNA模板浓度依次为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl和6.25ng/μl；5到8：河南石斛DNA模板浓度依次为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl和6.25ng/μl；9到12：铁皮石斛DNA模板浓度依次为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl和6.25ng/μl；13到16：金钗石斛DNA模板浓度依次为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl和6.25ng/μl。具体实施方式下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。实施例1一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及混淆品的ITS序列，详见下表1。其中，本研究所得单倍型序列详见序列表中序列4至序列11所示。表1霍山石斛及混淆品的ITS序列编号样品名称样品数量单倍型GenBank登录号本研究所得序列编号1铁皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap1KP7435432铁皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap2KF1434393金钗石斛Dendrobiumnobile1Hap3EF6187324金钗石斛Dendrobiumnobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobiumhenanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobiumhenanense6Hap6IHN1C;IHN1E;IHN1F;IHN1G;HNITS01;IHN1D7霍山石斛Dendrobiumhuoshanense3Hap7KF143476IHS1AIHS2D8霍山石斛Dendrobiumhuoshanense1Hap8JN388567分别用贝叶斯法（Bayesianinference,BI）和简约法（maximumparsimony,MP）进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。构建系统树时，用菱唇石斛Dendrobiumleptocladum的2条ITS序列（GenBank登录号分别为AF521612和EU840697）作为外群。其中BI树用MrBayesversion3.1.2软件构建，MP树用PAUP*version4.0beta10软件构建。构建BI树时，用MrModeltestversion2.3软件根据AIC（AkaikeInformationCriterion）检验标准选择数据的最适模型，所选最适模型是（SYM+G）。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC）设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样，总共剩余的样本数为9602，用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设置自举重复次数bootstrapnreps为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树主干一致（图1）。图1中各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率（posteriorprobability,PP）值和MP树的自举支持度（Bootstrap,BS）。结果表明，霍山石斛所有序列的单倍型形成单系（PP=1.00,BS=96）。在确定霍山石斛为单系群的前提下，用软件ClustalX1.81对表1中所有ITS序列进行对位排序和比较，找到差异片段，设计霍山石斛检测特异性PCR引物，如下：上游引物CP2s：5’-TTCGTGGGATGGGGTTC-3’（序列1）；下游引物CP2a：5’-TGCACATCCGAGCCTGA-3’（序列2）。理论PCR产物长度为262bp（序列3）二、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的组装将步骤一设计合成的上游引物CP2s和下游引物CP2a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP2s和下游引物CP2a外的PCR反应体系中的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴定霍山石斛的检测试剂盒。三、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：1、PCR扩增从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用上述上游引物CP2s和下游引物CP2a按照如下进行PCR扩增：PCR反应总体积25µL，包括以下试剂：0.5µL待测样品的DNA，1.0µL上游引物CP2s（10pmol），1.0µL下游引物CP2a（10pmol），2.5µL10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25mM的MgCl2水溶液，0.5µL浓度为10mM的dNTPs，0.5µL浓度5U/µL的TaqDNA聚合酶（5U/µL），无菌双蒸水补足至25µL。PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体反应条件如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环；72℃10min。2、PCR扩增产物检测采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：取5µLPCR扩增产物，采用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有霍山石斛：若获得大小为262bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中含有霍山石斛；若没有获得大小为262bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中不含有霍山石斛。实施例2霍山石斛的特异性分析四个待测样品：霍山石斛（采自于安徽霍山）、河南石斛（采自于安徽霍山）、铁皮石斛（采自于安徽霍山）和金钗石斛（采自于广西桂林）。均符合中国植物志的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。一、提取四个待测样品的基因组DNA分别取约50mg干燥样品（当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取），用CTAB法提取总DNA。具体如下：将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900µL已灭菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100mmol/LTris-HClpH=8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl）、0.02gPVP40000、10µLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900µL氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70%（体积分数）乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。用通用引物TY2s和TY2a检测以上提取的霍山石斛、河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛的基因组DNA质量。TY2s：5’-CGCCATATTGATTGACACG-3’；TY2a：5’-GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。反应总体系为25µL，包括DNA模板0.5µL（5-50ng），上游引物1µL（10pmol），下游引物1µL（10pmol），10×PCRBuffer2.5µL，MgCl2（25mM）1.5µL，dNTPs（10mM）0.5µL，TaqDNA聚合酶（5U/µL）0.5µL，ddH2O补足至25µL。通用引物PCR反应条件为：95℃5min、35个循环（每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min。结果发现所有样品均能扩增出DNA条带，见图2。二、对四个待测样品的DNA进行PCR扩增以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（上游引物CP2s和下游引物CP2a）进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。结果如图3所示，从图3中可以看出：利用本发明的引物对（上游引物CP2s和下游引物CP2a）对霍山石斛、河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛进行检测，霍山石斛能够扩增出片段大小约为262bp的目的条带。而河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛均未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将霍山石斛分别与河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛准确的鉴别出来。将大小约为262bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。实施例3霍山石斛的灵敏度分析四个待测样品：霍山石斛（采自于安徽霍山）、河南石斛（采自于安徽霍山）、铁皮石斛（采自于安徽霍山）和金钗石斛（采自于广西桂林）。通过鉴定，样品实物与名称相符，质量符合标准。一、提取四个待测样品的基因组DNA分别取约50mg干燥样品（当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取），用CTAB法提取总DNA。具体操作参见实施例2步骤一。二、PCR扩增将步骤一从霍山石斛中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA浓度分别为50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl和6.25ng/μl的系列稀释液，以系列稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（上游引物CP2s和下游引物CP2a）进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。结果如图4所示，从图中可以看出：利用本发明的引物对（上游引物CP2s和下游引物CP2a）对霍山石斛进行检测，当模板浓度为25ng/μl时仍能够检测到大小约为262bp的目的条带。将大小约为262bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。当前第1页1 2 3