水稻种子快速萌发QTLqGS11的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于种子科学与技术应用领域，涉及水稻种子快速萌发QTL qGS11的分子标记及其应用。

背景技术：

农业生产中，播种后常会遇到低温和洪涝等非生物胁迫，低活力种子萌发缓慢、出苗率低且抗性差，造成田间幼苗腐烂、坏死及杂草丛生等现象，最终导致严重减产。同时，随着劳动力日益短缺，直播稻推广越来越广。因此，提高种子萌发速度，选育高活力水稻品种具有重要意义。通过挖掘、定位克隆水稻种子快速萌发相关的基因/QTL，利用分子标记辅助选择(MAS)选育高活力水稻品种，是一个非常有效地方法。

利用构建不同的水稻遗传群体，已有不少学者定位了多个控制种子萌发相关的QTLs，但仅有一个控制水稻种子低温萌发的主效QTL qLTG3-1被成功克隆。前期，利用籼稻品种IR28和粳稻品种大关稻构建的重组自交系(RILs)群体检测到了多个种子萌发相关QTLs。在此基础上，对位于水稻11号染色体上控制种子萌发速度QTL qGS11进行精细定位，为利用分子标记辅助选择方法(MAS)培育高活力水稻品种鉴定了基础。

技术实现要素：

本发明目的是提供水稻种子快速萌发筛选的分子标记方法。通过检测与水稻种子快速萌发基因位点连锁的分子标记，可以快速筛选出快速萌发的水稻品种，提高水稻种子活力筛选的可靠性、有效性；可以确定有无控制种子快速萌发基因导入到育种品系中，提高水稻高活力性状的选择效率、加快育种进程。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻种子快速萌发QTL qGS11的分子标记，所述的分子标记选自YB20、YB21、RM26614中的任意一种；所述的分子标记YB20上游引物为YB20L：SEQ ID NO.1，下游引物为YB20R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为133bp；所述的分子标记YB21上游引物为YB21L：SEQ ID NO.3，下游引物为YB21R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为194bp；所述的分子标记RM26614上游引物为RM26614L：SEQ ID NO.5，下游引物为RM26614R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为183bp。

本发明所述的水稻种子快速萌发QTL qGS11的分子标记引物，所述的分子标记YB20上游引物为YB20L：SEQ ID NO.1，下游引物为YB21R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为133bp；所述的分子标记YB21上游引物为YB21L：SEQ ID NO.3，下游引物为YB21R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为194bp；所述的分子标记RM26614上游引物为RM26614L：SEQ ID NO.5，下游引物为RM26614R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为183bp。

本发明所述的分子标记在筛选快速萌发的水稻品种中的应用。

本发明所述的分子标记引物在筛选快速萌发的水稻品种中的应用。

水稻种子快速萌发分子筛选方法，步骤如下：

(1)取水稻叶片，提取基因组DNA。

(2)利用表1中的任意1对或1对以上分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qGS11增效等位基因存在。

表1

其中，所述的PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mMMgCl₂1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

用SSR分子标记YB20的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者IR28与粳稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出133bp的扩增片段，则标志着qGS11的籼稻IR28增效等位基因存在，否则扩增出128bp，则表明增效等位基因没有导入。在5125个BC₅F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与种子快速萌发基因qGS11共分离，单标记选择效率达99.9％。

用SSR分子标记YB21的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者IR28与粳稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出194bp的扩增片段，则标志着qGS11的籼稻IR28增效等位基因存在，否则扩增出178bp，则表明增效等位基因没有导入。在5125个BC₅F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与种子快速萌发基因qGS11共分离，单标记选择效率达100％。

用SSR分子标记RM26614的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者IR28与粳稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出183bp的扩增片段，则标志着qGS11的籼稻IR28增效等位基因存在，否则扩增出200bp，则表明增效等位基因没有导入。在5125个BC₅F₂分离群体中，用交换配子数计算，此标记与种子快速萌发基因qGS11共分离的，单标记选择效率达99.8％。

上述3个分子标记对qGS11的选择效率在99％以上，其中SSR标记YB21与qGS11共分离，选择准确率高，达100％。上述3个标记可以择一使用，也可以任意选择2对或2个以上标记联合使用。3个标记中任意2个分子标记组合选择，选择效率也达到100％。

有益效果

本发明所提供的水稻种子快速萌发筛选的分子标记方法，具有以下优点：

(1)通过本发明开发的分子标记首次从籼稻品种IR28中在水稻11号染色体长臂上定位到控制种子萌发速度QTL qGS11，并获得了共分离或高度紧密连锁的SSR标记YB20、YB21和RM26614。

(2)通过本发明分子标记定位的水稻种子快速萌发QTL qGS11，鉴定方法快速简便，选择效率高。只需要检测这些标记的扩增条带特征，就可以判断种子萌发速度基因qGS11是否存在，从而预测水稻种子萌发快慢水平，可以快速、有目的性的筛选高活力水稻品种或品系，用于改良水稻种子活力。这些标记与快速萌发基因qGS11共分离或高度紧密连锁，单标记选择效率达99％-100％，任意双标记选择率达100％。

(3)分子标记辅助选择育种目标明确，节约成本，不受环境影响。在传统育种方法中，首先要收集种子快速萌发亲本与骨干亲本进行一系列杂交，回交，而且要等到收获种子破休眠后，对后代进行萌发表型鉴定从而选择单株。传统育种方法受环境影响大，可靠性低。通过本发明的与种子快速萌发基因qGS11共分离和紧密连锁的分子标记方法，可预测水稻种子萌发快慢，可以在种子萌发期就鉴定出快速萌发的单株，淘汰其它植株，可以有效控制育种规模，提高育种效率，能快速筛选出高活力水稻品种。同时，在水稻育种群体构建时，可以快速鉴定出具有种子快速萌发基因qGS11的单株，大大提高选择效率，缩短育种年限，为水稻高活力品种改良和育种服务。

附图说明

图1：两亲本大关稻和IR28第4d萌发表型图

图2：qGS11在11号染色体上初定位图

图3：qGS11在11号染色体上精细定位图

图4：新开发的与qGS11紧密连锁的分子标记多态性电泳条带

具体实施方式

实施例1

(一)材料与方法：

1.材料：亲本高活力水稻品种IR28和低活力品种大关稻，及以IR28为轮回亲本构建BC₁F₂和BC₅F₂群体。

2.用SDS法提取个体DNA。

3.分子标记开发：以日本晴和9311为参考序列设计新引物，以亲本IR28与大关稻为模板，进行PCR扩增，筛选多态性标记。

4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离。

5.种子快速萌发QTL初位点：亲本及BC₁F₂分离群体全部种植于南京农业大学江浦试验站，取样并收获成熟的种子，去杂，50℃烘干破除种子休眠，再保存于-20℃冰箱，以备长期使用；每个单株取30粒种子，3次重复，于25℃下进行种子萌发速度鉴定，完成水稻种子萌发速度QTL初步定位。

6.软件运算：所用软件为QTL IciMapping 4.1，最小LOD值设为2.5，步伐为1，获取连锁图谱，进行QTL定位分析(图2)。

7.连锁标记验证与区间确定：对含有qGS11位点背景与IR28相似的家系进行回交、自交获得BC₅F₂分离群体每个单株的后代，进行正常条件下种子萌发速度性状鉴定，并结合其基因型构建水稻遗传图谱，验证连锁的分子标记，从而有效确定缩小定位区间。

(二)结果与分析

结合BC₁F₂分离群体在正常条件下种子萌发表型，以第4d种子成苗率和发芽指标为指标，利用软件分析发现位于11号染色体上控制种子萌发速度的QTL真实存在，位于标记RM3428与RM26614之间。

对BC₅F₂分离群体5125株分离个体表型鉴定与标记分析，在分子标记YB20和RM26614间获得11个交换株。标记YB21与qGS11共分离，没有交换株，说明单标记对qGS11的选择效率达100％；标记YB21和RM13443与qGS11交换率在1％以下，单标记对qGS11的选择效率达99％以上(图3)。

通过检测与水稻种子萌发速度基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻种子活力水平，可以确定有无控制水稻种子萌发速度基因导入育种品系中，提高水稻育种选择效率，加快育种进度。利用与qGS11共分离或紧密连锁的YB20、YB21和RM26614进行单标记选择，选择效率可达到99％-100％，任何双标记组合选择效率均达到100％，可用于分子标记辅助选择育种。

实施例2

(一)材料与方法：

1.材料：水稻品种IR28与大关稻

2.用SDS法提取个体DNA。

3.标记：YB20、YB21及RM26614。

4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离。

(二)结果与分析

用SSR分子标记YB20的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者大关稻的基因组DNA，水稻品种IR28能够扩增出133bp的扩增片段，标志着水稻品种IR28中存在qGS11增效等位基因，大关稻扩增出128bp，表明大关稻中不存在qGS11增效等位基因。用SSR分子标记YB21的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者大关稻的基因组DNA，水稻品种IR28能够扩增出194bp的扩增片段，标志着水稻品种IR28中存在qGS11增效等位基因，大关稻扩增出178bp，表明大关稻中不存在qGS11增效等位基因。用SSR分子标记RM26614的上下游引物扩增籼稻品种IR28或者大关稻的基因组DNA，水稻品种IR28能够扩增出183bp的扩增片段，标志着水稻品种IR28中存在qGS11增效等位基因大关稻扩增出200bp，表明大关稻中不存在qGS11增效等位基因(图4，图中每种分子标记引物对应两条泳道，左边的泳道对应大关稻，左边的泳道对应水稻品种IR28)。