一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用与流程

文档序号:18373823发布日期:2019-08-07 01:56阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种酿酒酵母工程菌株,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌株过表达ERG10、ERG13、tHMG1、ERG8、ERG19、ERG20、ERG12、IDI1、ADS、CYP71AV1、AaCPR1、AaCYB5、AaADH1、AaDBR2和AaALDH1基因,敲除了gal80、gal1、gal7和gal10基因;

所述酿酒酵母工程菌株的基因型为:

gal1,7,10Δ::Pgal3-AaCPR1-CYC1t_NATR;

leu2Δ::G418R_Pgal7-AaCYB5-CYC1t_ERG19-Pgal1,10-ERG8;

ade1Δ::tHMG1-Pgal1,10-IDI1_ADE1;

his3Δ::His3_Pgal7-AaALDH1-TDH1t_ERG12-Pgal1,10-ERG10;

ura3Δ::tHMG1-Pgal1,10-ERG13;

trp1Δ::tHMG1-Pgal1,10-ERG20_TPR1;

gal80Δ::URA3_Pgal7-AaADH1-TDH1t;

pRS425_Pgal7-AaDBR2-CYC1t_ADH1t-CYP71AV1-Pgal1,10-ADS-PGK1t。

2.如权利要求1所述酿酒酵母工程菌株的构建方法,其特征在于,包括:

将基因片段tHMG1、Pgal1,10、IDI1连接,获得模块A;

将基因片段tHMG1、Pgal1,10、ERG13连接,获得模块U;

将基因片段tHMG1、Pgal1,10、ERG20连接,获得模块T;

将基因片段pAgTEF1、Kan和AgTEF1t连接,获得G418R;将所述G418R、Pgal7、AaCYB5、CYC1t、ERG19、Pgal1,10、ERG8连接,获得模块L;

将基因片段Gal7up、Pgal3、AaCPR1、CYC1t、NATR、Gal1down连接,获得模块N;

将基因片段pAgTEF1、hphA、AgTEF1t连接,获得HPHR;将所述HPHR、Pgal7、AaALDH1、TDH1t、ERG12、Pgal1,10、ERG10连接,获得模块H;

将基因片段Gal80up、URA3、Pgal7、AaADH1、TDH1t、Gal80down与载体连接,获得模块G;

将基因片段ADH1t、CYP71AV1、Pgal1,10、ADS、PGK1t连接,获得模块1;

将基因片段AaDBR2、CYC1t、Pgal7与所述模块1连接,获得模块2;

将所述模块A、所述模块U、所述模块N、所述模块T、所述模块L、所述模块H、所述模块G和所述模块2导入酿酒酵母基因组中,获得酿酒酵母工程菌株。

3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述构建方法中所用筛选标记为URA3标记、TRP1标记、LEU2标记、HIS3标记、KlURA3标记、G418R标记、Ade1标记或NATR标记。

4.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述NATR由pAgTEF1、nat1、AgTEF1t基因片段通过OE-PCR组装获得。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的构建方法,其特征在于,包括:

将基因片段Ade1up、tHMG1、Pgal1,10、IDI1、ADE1连接,获得模块A;

将基因片段Ura3up、tHMG1、Pgal1,10、ERG13、URA3连接,获得模块U;

将基因片段Trp1up、tHMG1、Pgal1,10、ERG20、TRP1连接,获得模块T;

将基因片段pAgTEF1、Kan和AgTEF1t连接,获得G418R;将Leu2up、所述G418R、Pgal7、AaCYB5、CYC1t、ERG19、Pgal1,10、ERG8、Leu2down连接,获得模块L;

将基因片段Gal7up、Pgal3、AaCPR1、CYC1t、NATR、Gal1down连接,获得模块N;

将基因片段pAgTEF1、hphA、AgTEF1t连接,获得HPHR;将His3up、所述HPHR、Pgal7、AaALDH1、TDH1t、ERG12、Pgal1,10、ERG10、His3down连接,获得模块H;

将基因片段Gal80up、URA3、Pgal7、AaADH1、TDH1t、Gal80down与载体连接,获得模块G;

将基因片段pRS425、ADH1t、CYP71AV1、Pgal1,10、ADS、PGK1t连接,获得模块1;

将基因片段AaDBR2、CYC1t、Pgal7与所述模块1连接,获得模块2;

将所述模块A、所述模块U、所述模块N、所述模块T、所述模块L、所述模块H、所述模块G和所述模块2导入酿酒酵母基因组中,获得酿酒酵母工程菌株。

6.根据权利要求2至4中任一项所述的构建方法,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌株的底盘菌为S.cerevisiae CEN.PK2.1C。

7.一种二氢青蒿酸的制备方法,其特征在于,利用如权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株进行发酵培养,生产二氢青蒿酸。

8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养采用的发酵培养基包括:

20g/L葡萄糖,8g/L KH2PO4,15g/L(NH4)2SO4,9.25g/L MgSO4·7H2O,10mL/L金属离子溶液,12mL/L维生素溶液;

所述金属离子溶液含5.57g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/L CoCl2·6H2O、0.32g/L CuSO4、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA;

所述维生素溶液含0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫胺素、1g/L盐酸吡哆醇、0.2g/L对氨基苯甲酸和2g/L硫酸腺嘌呤。

9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养的条件为:发酵温度为30℃,pH为5.05,通气量为1.5vvm,溶氧为40%,搅拌转速为300~700rpm。

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