一种小麦ALS突变型基因及其蛋白和应用的制作方法

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及一种小麦ALS突变型基因及其蛋白和应用；具体而言，本发明涉及小麦的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其小麦抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术：

杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。

乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC 4.1.3.18)抑制剂类除草剂以ALS作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(or oxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。

成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp 537、Trp 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654、Val 669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、小麦、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。

生产上广泛种植的普通小麦是一种异源六倍体，含有A、B和D三个基因组。小麦已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Ala 179、Ser 627(授权专利CN102559646B)。基因序列比对分析发现，该已知的Ala 179、Ser 627突变位于小麦D基因组中的6DL染色体上。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。

目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种小麦ALS突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供上述小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有上述的小麦ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述小麦ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。

本发明人通过长期、艰苦的研究，对徐麦小麦的EMS突变植株(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)进行长期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突变蛋白和新ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如小麦等作物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种小麦ALS突变型基因，其在小麦D基因组的6DL染色体的ALS基因序列的第377位核苷酸由C变成核苷酸T。

上述小麦ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述的小麦ALS突变型基因所编码的小麦ALS蛋白。该突变来源于小麦D基因组的6DL染色体的ALS基因，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型小麦ALS相比，其在小麦D基因组的6DL染色体的ALS基因序列的第377位核苷酸由C变成核苷酸T，导致其相应编码的氨基酸序列的第126位氨基酸由丝氨酸变为苯丙氨酸。目前还没有报道表明，在来自小麦D基因组的6DL染色体的ALS蛋白的Ser126位点突变，会使得小麦具有ALS抑制剂类除草剂抗性。

上述的小麦ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的小麦ALS突变型基因。

本发明内容还包括上述的小麦ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。

上述绿色植物为小麦、烟草、拟南芥等。

本发明内容还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：

1)使绿色植物包含所述的小麦ALS突变型基因；或

2)使绿色植物表达所述的小麦ALS蛋白。

上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：

1)测定所述绿色植物是否包含上述的小麦ALS突变型基因；或，

2)测定所述绿色植物是否表达上述的小麦ALS蛋白。

有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的小麦ALS突变蛋白的小麦1叶1芯幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型小麦幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡。

附图说明

图1百垄通除草剂筛选获得的抗性小麦突变体；

图2 PCR扩增小麦ALS基因全长结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为3kb、2kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为徐麦野生型小麦DNA，第3泳道为抗除草剂突变植株的DNA；目的片段长度2104bp；

图3重组质粒pCAMBIA1301-ALS的BamHI和SacI双酶切验证电泳图；泳道1为为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道2为重组质粒pCAMBIA1301-ALS酶切后的片段。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：小麦抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程(百垄通)

将徐麦种子(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)(此为M0，用清水浸泡2小时)120kg分6次用0.4-0.6％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待小麦(此为M2)幼苗长至1叶1芯期时，喷施为3mL百垄通/L水(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1mL百垄通/1.5～3L水)，3个月后还呈正常绿色、且能正常拔节的植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的小麦突变植株(图1)。共计获得抗除草剂的M2单株141株，这些抗性单株进行常规肥水管理，均可正常结实，种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。

实施例2：抗除草剂小麦突变体突变位点分析

上述实施例1获得的抗除草剂小麦突变植株中，选取79号突变植株的叶片和野生型植株的叶片，提取基因组DNA，送上海翰宇生物科技有限公司进行基因组测序。测序结果发现：与野生型植株相比，上述抗除草剂的79号小麦突变体在其D基因组的6DL染色体的ALS基因序列的第377位核苷酸发生了单碱基突变，由C变成T，导致其相应编码的氨基酸序列的第126氨基酸由丝氨酸变为笨丙氨酸，即79号小麦抗除草剂突变植株的D基因组的6DL染色体的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的79号小麦突变植株其分类命名为普通小麦种子徐麦M1(Triticum aestivum L.Xumai-M1)，该菌株已于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：P201620。

实施例3抗咪唑啉酮类除草剂小麦突变体ALS基因克隆

取上述抗除草剂的79号小麦突变体的叶片，提取基因组DNA。根据测序序列设计扩增ALS基因全长基因的特异引物为：正向引物5’-CCATCACCCCTCCCCAATTCC-3’、反向引物5’-CACTTGTAGGTCTTGTAGGTCG-3’。采用Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase聚合酶(购自Takara公司)扩增ALS基因全长序列，其反应体系如下：

PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68℃。

程序如下：预变性：98℃3min；35个循环；变性98℃10sec；延伸68℃3min；保温：72℃10min。

取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送金斯瑞生物科技有限公司测序，获得突变ALS基因序列。

实施例4抗百垄通除草剂小麦突变体的ALS酶活测定

为了验证小麦突变体的除草剂抗性是否由ALS突变所致，本发明人进行了ALS酶活性测定。测定方法参照Singh等的方法(Singh B.K.,Stidham M.A.,Shaner D.L.Assay of acetohydroxyacid synthase.Analytical Biochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别取野生型和79号小麦突变体的叶片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mM K₂HPO₄，pH 7.5、10mM丙酮酸钠、5mM EDTA、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化镁、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清，将沉淀溶解于0.2mL反应缓冲液(100mM K₂HPO₄,pH 7.0、1mM EDTA、10mM氯化镁、100mM丙酮酸钠、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各植株的ALS提取液。

在获得ALS提取液中分别加入10μL除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/L)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml 3M硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟便于脱羧。然后加0.4mL显色液(0.09g/L 1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5M NaOH溶解)。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(ALS蛋白催化丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验以水为对照，设3次重复。

A530吸光值测定结果发现，当野生型和79号小麦突变体的ALS提取液中没有百垄通时，它们的A530吸光值均在1.2-1.5之间，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异(表1)；而加入百垄通后，野生型植株的A530吸光值仅为0.31，突变体小麦植株的A530吸光值为0.92左右，即野生型植株的ALS酶活性仅为对照的25.6％，而突变体小麦植株的ALS酶活性仍有63.4％(表1)，表明79号小麦突变体的突变ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。

表1

实施例5转基因烟草获得

设计特异引物5’-CGCGGATCCCCATCACCCCTCCCCAATTCC-3’和5’-TCCCCGCGGCACTTGTAGGTCTTGTAGGTCG-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从上述79号小麦突变体的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，用BamHI和SacI分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)，酶切产物用T4-DNA酶(购自TaKaRa公司)连接，连接产物转化大肠杆菌得到重组质粒pCAMBIA1301-ALS。重组质粒pCAMBIA1301-ALS提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证，可以产生大的质粒片段和小的基因片段(图3)，证明已将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)中。将构建好的质粒载体转化农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化本氏烟叶盘，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水(12倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例4所述方法测定ALS酶活性，发现转基因烟草的ALS酶活性显著高于非转基因烟草；30天后发现转基因烟草生长状态良好，而非转基因烟草则全部枯死。

实施例6转基因拟南芥获得

设计特异引物5’-CGCGGATCCCCATCACCCCTCCCCAATTCC-3’和5’-TCCCCGCGGCACTTGTAGGTCTTGTAGGTCG-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从上述79号小麦突变体的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实施例5的方法将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)中，挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105，培养菌体，通过农杆菌介导方法转化拟南芥(Clough S,Bent A.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal,1998,16(6):735-743.)，转化的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽薹的拟南芥幼苗喷施3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因拟南芥枯死，而转基因拟南芥生长状态良好。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。