一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原及其合成方法和用途与流程

本发明属于四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原技术领域，尤其涉及一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，指一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE两个苯环中间的支链改造(两个苯环中间的支链进行衍生化)，使之具备耦合用羧基的合成方法，具体为一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原及其合成方法和用途。

背景技术：

四溴双酚A(TBBPA)及其衍生物是一类在全球广泛使用的溴代阻燃剂，研究表明，TBBPA具有强甲状腺激素干扰活性以及弱雌激素活性，会通过干扰甲状腺动态平衡而对机体产生危害。TBBPA-DHEE即为其中一种，是一种重要的添加型阻燃剂。目前，TBBPA及其衍生物在生产过程中的使用、泄露等使其进入环境，可在多介质环境中残留、积累，并造成潜在危害。

因此，开展四溴双酚A及其衍生物的分析测定具有重要的现实意义。目前，检测四溴双酚A及其衍生物的方法均基于仪器分析方法，具有准确性好、灵敏度高的优点，但是由于所用仪器极其昂贵，而且存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析环境中TBBPA及其衍生物的含量，因此，建立一种快速简便的四溴双酚A检测方法是具有重要意义的。

和其他传统检测方法相比，生物分析方法是基于抗体(或其它具有识别功能的生物大分子)特异性反应的一种分析方法，已广泛应用于食品与环境中小分子污染物的分析检测。该方法具有灵敏度高、方便快捷、高通量、低成本等优势。而建立此方法的前提是相应抗体的研制。

由于TBBPA-DHEE是小分子物质，小分子化合物因其分子量小，缺乏免疫原性，在免疫动物时，很难诱导产生特异性细胞及体液免疫反应。为此，需要将小分子物质与大分子载体蛋白偶联，使其成为完全抗原。小分子化合物的抗体，是通过半抗原作为抗原决定簇免疫动物而获得，所以设计并合成合理的半抗原是制备亲和性好、灵敏度高的抗体的关键。其原则是设计合成与待测物结构类似的半抗原，并尽量保持与待测物共有的结构作为母核。

对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有-NH2，-COOH，-OH，-SH等功能基团，可直接活化后联入载体蛋白，便可合成人工完全抗原。但大部分待测物分子并不含有功能基团，或功能基团对待测物的特异性和极性影响较大，因此，需要对小分子化合物进行结构改造，使其具有能共价结合到载体蛋白上的一种功能基团(如氨基、羧基、羟基和巯基等)。

本发明基于以上原则，设计了四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，以苯酚为原料，通过5步反应得到四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，为后续建立四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的生物分析方法提供了有利条件，该抗原目前尚无文献报道。

技术实现要素：

本发明目的是克服现有技术的不足之处，提供了一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法。

本发明的技术方案：

一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原，其结构式为：

所述四溴双酚A衍生物衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，以苯酚为原料，通过5步反应得到半抗原。反应过程如下所示：

一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，包括如下步骤：

步骤1、称取苯酚、5-乙酰基戊酸置于二颈瓶中，加入水，搅拌溶解，得混合液A，冰浴、搅拌下滴加浓硫酸，室温下搅拌反应；反应完毕后，向反应液中加入水，得混合液B，用乙醚萃取；有机相用饱和碳酸氢钠溶液萃取，保留水相，萃取完成后，调节水相pH为4～5，用乙醚萃取，有机相用旋转蒸发仪旋干，得产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸；

步骤2、将产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸置于反应瓶中，加入甲醇作溶剂，回流反应；将反应液旋干过柱，得产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯；

步骤3、将产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯置于二颈瓶中，搅拌下滴加溶有Br2的冰醋酸，持续搅拌；反应完成后，冰浴、搅拌下加入Na2S2O3除去未反应的Br2，用二氯甲烷萃取，保留有机相；旋干有机相，过柱得产物6,6-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)庚酸甲酯；

步骤4、称取6,6-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)庚酸甲酯置于二颈瓶中，加入K2CO3，加入二甲基甲酰胺使其溶解，室温下搅拌；然后缓慢滴加溴乙醇，室温搅拌过夜，旋干后过柱纯化得到6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯；

步骤5、将6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯与氢氧化钠体积比为1：1的甲醇/水混合溶剂中，在65℃下反应，加盐酸调pH至酸性，用二氯甲烷提取反应液，浓缩，过柱得化合物6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸。

步骤1中，制备混合液A时，所使用的苯酚、5-乙酰基戊酸和水的用量比为9.4g：7.2g：4mL；制备混合液B时，所加入的水与混合液A中的水的体积比为25：2；向混合液A中加入的浓硫酸与混合液A中的水的体积比为5：2；所述的室温下搅拌反应的时间为15h。

步骤2中，所使用的6,6-双(4-羟基苯基)庚酸与甲醇的用量比为9.4g：20mL；所述回流反应的温度为60℃，回流反应的时间为2h。

步骤3中，所使用的6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯与冰醋酸的用量比为7.8g：15mL，所述Br2与冰醋酸的用量比为7.5g：15mL；所述继续搅拌的时间为1h。

步骤4中，所使用的6,6-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)庚酸甲酯、K2CO3、二甲基甲酰胺的用量比为10.7g：2.5g：20mL；所使用的溴乙醇与二甲基甲酰胺的体积比为1：3；所述室温下搅拌的时间为10min。

步骤5中，所述6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯、氢氧化钠、甲醇/水混合溶剂的用量比为11.6g：3.5g：40mL；在65℃下反应的时间为4h；所使用的盐酸的浓度为1mol/L，pH为4～5。

所述的四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯用于制备四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯-BSA。

本发明的有益效果：本发明经过反复试验成功的设计并合成了一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，是一种新型的四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，该方法不仅简单、安全、可行，而且所得半抗原能与载体蛋白成功结合得到四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的人工抗原，使用该免疫原免疫动物，获得了能特异性识别四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的单克隆和多克隆抗体，抗体效价高，特异性强，可广泛用于四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的免疫分析研究。

附图说明

图1为本发明实施例提供的半抗原6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸的核磁共振氢谱图(图A)和质谱图(图B)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

(1)以苯酚为原料与5-乙酰基戊酸发生缩合反应生成6,6-双(4-羟基苯基)庚酸(a)，合成步骤如下：

称取苯酚9.4g(10mmol)，5-乙酰基戊酸7.2g(50mmol)，置于50ml二颈瓶中，加入4ml水，搅拌使其溶解，冰浴、搅拌下滴加浓硫酸10ml，室温下搅拌反应15h；反应液加入50ml水，用乙醚萃取；有机相用饱和碳酸氢钠萃取，保留水相，萃取完成后，调节水相pH4-5，用乙醚萃取，有机相用旋转蒸发仪旋干，得产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸9.43g。

(2)化合物a与甲醇发生酯化反应生成6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯(b)，步骤如下：

将产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸9.4g置于反应瓶中，加入20mL甲醇作溶剂，60℃回流反应2h；将反应液旋干过柱，得产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯7.8g。

(3)化合物b通过与液溴发生取代反应生成6,6-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)庚酸甲酯(c)，合成步骤如下：

将7.8g产物6,6-双(4-羟基苯基)庚酸甲酯置于二颈瓶中，搅拌下滴加15ml溶有Br2 7.5g的冰乙酸，持续搅拌1h；反应完成后，冰浴、搅拌下加入Na2S2O3除去未反应的Br2，用二氯甲烷萃取，保留有机相；旋干有机相，过柱得产物6,6-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)庚酸甲酯10.7g。

(4)化合物c通过与溴乙醇取代生成6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯(d)，合成步骤如下：

称取化合物c 10.7g置于100mL二颈瓶中，加入2.5g K2CO3，20mL二甲基甲酰胺使其溶解，室温搅拌10分钟。缓慢滴加5mL溴乙醇，室温搅拌过夜，冷却至室温，旋干后过柱纯化得到6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯。

(5)化合物d与氢氧化钠发生皂化反应，加入盐酸酸化，使其支链分子末端羧基化，从而得到半抗原6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸(D7)，合成步骤如下：

将11.6g 6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸甲酯与3.5g氢氧化钠加入甲醇和水(1:1，40mL)混合溶剂中，在65℃下反应4h结束反应，加1mol/L盐酸调pH至4～5，用二氯甲烷提取反应液三次，浓缩，过柱得化合物6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸8.78g。产率73％。

所制备的6,6-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)庚酸的表征见图1，其中核磁共振氢谱如下：¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.26(s,4H),4.22(t,J＝4.0Hz,4H),3.99(t,J＝4.0Hz,4H),2.35(t,J＝7.2Hz,2H),1.98(t,J＝8.0Hz,2H),1.64t,J＝7.6Hz,2H),1.54(s,3H),1.11(brs,2H)；质谱结果如下：calculated for C23H26Br4O6:718.06；found:708.8488([M+H⁺])。

(6)利用碳化二亚胺法将合成的四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原D7与载体蛋白BSA相偶联，制备四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原：

称取400mg EDC·HCl和15mg BSA溶于2mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，于磁力搅拌器上搅拌30min。称取45mg半抗原D7溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，逐滴滴加到上述混合溶液中，室温下搅拌1h，4℃放置过夜。将反应终液置于0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中4℃透析，每4-12小时换透析一次液，共透析3天。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液，即为四溴双酚A人工抗原D7-BSA分成若干等份分装于1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。