一种罗伊氏乳杆菌及应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种罗伊氏乳杆菌及其在制备治疗胃肠道疾病的药物中的应用。

背景技术：

溃疡性结肠炎(UC)、隐窝炎和罗恩氏病是炎性肠病(IBD)的主要类型，所述炎性肠病的特征在于肠中的慢性炎症。临床症状是腹泻、腹痛、偶然性直肠出血、体重减轻、疲倦和有时发热。尽管会发生在任何年龄，IBD最常见于青少年和年轻的成年人中，所以这些人可能遭受延迟的发育和矮化的生长。资料显示，每年美国UC患病率为200/10万人，治疗UC的花费在1至1.5亿美元左右，截止到2012年，UC患者总数是2000年的2.5倍，且复发率达72％；近年来我国UC的患病人数呈明显上升趋势。

在医学上，通过减少炎症并从而控制胃肠道征状来治疗IBD。但是，目前尚不能在医学上治愈IBD。IBD的临床进程有很大差异，具有轻度至中度征状的患者无需住院治疗，但是，10-15％的患者会发生该疾病的严重进程，其在许多情况下继之以外科手术，结肠切除术可以消除UC，但是会降低生活质量和增加并发症的风险。

用于治疗IBS的药物已经获得普及，尽管它们在临床试验中的效力是不大的，并且它们的临床实用性受到不利副作用的限制，可利用的药物包括：使用5-对氨水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇和免疫调节药物。通常使用5-ASA进行轻度至中度IBD征状的长期治疗，而皮质类固醇和免疫调节药物被用于治疗严重的征状；腹泻或腹痛作为5-ASA的副作用而出现，而皮质类固醇的长期使用经常显示出严重的副作用，包括骨质减轻、感染、糖尿病、肌肉消瘦和精神病学障碍；免疫调节药物会抑制免疫系统，这会控制IBD征状。但是，产生的免疫受损的状态会使患者易感许多疾病。血清素能性药剂已经表现出对IBS的总体征状的效力，但是，最近关于安全性的忧虑已经严重地限制了它们的应用。

益生菌被定义为“活的微生物，其在以特定数目摄入以后，会发挥超出固有的基础营养以外的健康益处”(Araya M.等人,2002；Guarner F.等人,1998)。来自双歧杆菌属的几种乳酸细菌和种是益生菌，这暗示，已经证实它们会促进特定健康效应。益生细菌必须满足与没有毒性、生存力、附着和有益效果有关的几个要求。然而，现有益生菌对治疗肠炎效果不佳。

技术实现要素：

发明目的：本发明的第一目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌。

本发明的第二目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌在制备治疗胃肠道疾病的药物中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠炎的药物中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种罗伊氏乳杆菌，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02，在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：CCTCC No.M 2016546，保藏日期为2016年10月10日。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02的生理活性特征如下：

所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02在MRS培养基平板上菌落较小，乳白色，直径1-2mm，表面平滑，边缘较规则。

所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02菌体为杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽孢，产生乳酸，兼性厌氧。

罗伊氏乳杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02是在制备抗菌药物中的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02是在制备治疗胃肠道疾病的药物中的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02是在制备治疗肠炎的药物中的应用。

具体应用为：将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02接种于发酵培养基中，在35-39℃下发酵培养8-16小时，得到的发酵液作为应用菌剂。

本发明中所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，pH5.5-6.5。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明提供的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02对多种病原菌具有抑制作用；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点。

(2)本发明提供的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02培养条件简单、发酵时间短、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落图。

图2为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落放大图。

图3为菌种第一批次功能性评价生长曲线。

图4为菌种第二批次功能性评价生长曲线。

图5为菌株耐酸实验结果图。

图6为乳酸菌数量与肠炎小鼠的体重关系曲线。

图7为乳酸菌数量与肠炎小鼠的结肠长度关系曲线。

图8为治疗前后肠炎小鼠切片图。

图9为罗伊氏乳杆菌TR02与白念珠菌培养液培养抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合实验例详细阐述本发明罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)TR02的应用。

本发明实施例中，以下缩写所代表的意义分别为：

MRS：乳酸细菌培养基

DSS：葡聚糖硫酸钠

Sulfasalazine水杨酸偶氮磺胺吡啶

Microcapsule微囊

实施例1菌株的分离

1、菌种和培养基和培养条件

(1)菌源

来自中国某军区健康士兵粪便。

(2)培养基

平板培养基：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，pH5.5-6.5。

2、菌株的分离和鉴定

(1)菌株的分离

预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；

以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。

次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合罗伊氏乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。

(2)菌株的鉴定

革兰氏染色形态学鉴定：

a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。

b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。

d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。

16S rRNA序列的测定：

16S rRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16S rRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。

BLAST分析表明TR02菌十分接近罗伊氏乳杆菌(99％亲缘性)。

实施例2

(一)菌种功能性评价

A.生长曲线及各监测点pH值的测定

1.标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、2、4、6、8、24h。

2.接种

分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL TR02过夜培养液(培养8-16h)转入盛有50mL MRS+0.05％半胱氨酸培养液的三角瓶内，混合均匀后分别取5mL混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3.培养

将已接种的试管置37℃培养箱中静置培养，分别培养0、2、4、6、8、24h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4.比浊测定

用未接种的MRS+0.05％半胱氨酸培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定，从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用MRS+0.05％半胱氨酸液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值再0.1～0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

5.pH值的测定

剩余培养液测定pH值。

B.显微镜直接计数

1.菌悬液制备

以无菌生理盐水将培养液制成浓度适当的菌悬液。

2.镜检技术室

在加样前，先对计数板的技术室进行镜检，若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3.加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的培养液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入技术室，一般技术室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时技术室不可有气泡产生。

4.显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到技术室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意不要偏向一边，否则视野中不易看清楚技术室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数，一般样品稀释度要求每小格内约有5～10个菌体为宜。每个技术室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。计数一个样品要从两个技术室中计得的平均值来计算样品的含菌量。

5.清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物刷洗，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

两批次菌种功能性评价结果平行性较好(见表1、表2、图3和图4)，生长曲线结果表明TR02菌在0～4h内处于适应期，4～8h内处于对数生长期，8～12h处于平台期，12h后即进入衰退期；pH曲线与生长曲线呈既截然相反的态势，培养终点pH为4.44。

终点培养液经显微计数结果为3.54×10⁸cfu/ml。

表1批次一菌种功能性评价

表2批次二菌种功能性评价

(二)菌株耐酸实验

将供试菌株接种于MRS+0.05％半胱氨酸盐酸盐液体培养基中，活化培养24h，以5％的接种量加入到两份用盐酸调pH为2.5和6.2的MRS培养基中(pH为6.2的培养基为空白对照)。第一份用灭菌生理盐水梯度稀释，取稀释液100μL接种到MRS平板涂板，置于37℃，培养48h，进行菌落计数。第二份37℃处理3h后，再用灭菌生理盐水梯度稀释，取稀释液100μL接种到MRS平板涂板，置于37℃培养48h，进行菌落计数，即3h的活菌数，并计算出乳酸菌的存活率：存活率(％)＝(3h的活菌数/0h的活菌数)×100。

由表3和图5可见，TR02在pH6.5及pH4.5环境下培养3h未见显著影响，而在pH3.0条件下生长受到影响，表明pH4.5环境下TR02可以耐受。

表3菌株耐酸试验结果

实施例3体内实验

1.结肠炎的诱导与治疗

用含2.5％DSS(分子量36-50KDa)的溶液饲喂C57BL/6型小鼠(1-7天)，以诱导结肠炎模型小鼠；对照组则饲喂水。在随后的10天内，分别口服水、乳酸菌(包埋0.9*10⁹、1.2*10⁹、2.4*10⁹，未包埋2.4*10⁹)和柳氮黄胺吡啶(0.5g/kg)。

每天称量体重，观察小鼠粪便粘稠度及粪便中和肛门处是否有血。计算疾病活动指数(DAI)。简言之，通过以下参数进行计算：

a)腹泻(0分＝正常，2分＝轻便粪便，4分＝水性腹泻)；

b)血胆量(0分＝没有出血，2，轻微出血，4分，大出血)。

在诱导结肠炎后第10天，处死动物，取出结肠，并制备结肠组织片用于离体分析。为了进行组织学分析，将结肠的一部分在10％的福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。根据标准方案用H&E对切片染色。

H&E染色的结肠切片的组织学评价如下分级：0，无炎症迹象；1.低白细胞浸润；2.中度白细胞浸润；3.高白细胞浸润，中度纤维化，高血管密度，结肠壁增厚，中度杯状细胞损失和隐窝的病灶损失和4.透壁浸润，杯状细胞的大量损失，广泛的纤维化和隐窝的弥漫性损失。组织学评分由病理学家进行。

由图6、7、8可见，随着乳酸菌数量的增加对肠炎小鼠的体重有明显的改善作用，对肠炎小鼠的结肠长度有明显的改善作用，肠炎小鼠与正常小鼠的切片比较，杯状细胞逐渐减少，炎性细胞逐渐增加。

2.抑菌功效

将罗伊氏乳杆菌TR02与罗伊氏乳杆菌TR02与白念珠菌培养液混合培养，分别测定0、6、9、12、24h的OD值与pH值，如图9所示，罗伊氏乳杆菌TR02对白念珠菌有明显的抑菌效果，且能明显降低环境的pH值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天益健康科学研究院（镇江）有限公司

<120> 一种罗伊氏乳杆菌及其应用

<130> SC20161008001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri

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<221> misc_feature

<222> (1)..(1490)

<400> 1

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