防治黄曲条跳甲的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用的制作方法

本发明属于微生物农药制备技术领域。具体涉及防治黄曲条跳甲的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用。

背景技术：

跳甲(fleabeetle)，属于鞘翅目(coleoptera)叶甲科(chrysomelidae)跳甲亚科(alticinae或halticinae)昆虫，其色暗或具金属光泽，后足膨大健壮，善于跳跃，在世界各地都有广泛的分布。跳甲主要危害十字花科蔬菜，以及茄果类瓜类等，其中，黄曲条跳甲的危害尤为严重。

黄曲条跳甲(phllotretastriolata)是一种重要的地下虫害，主要危害农作物的种子、根、茎等。受其危害最为严重的是十字花科(brassicaceae)植物，包括甘蓝、油菜、白菜、萝卜等，是世界性的害虫之一(贺华良，2012)。其幼虫和成虫均能够危害农作物，幼虫取食根皮，咬断须根，致使地上部分的植株叶片变黄萎焉而死；成虫则主要取食叶片，咬食叶肉，造成许多细密的小孔，进而影响植株的正常生长而死亡(伍海森，2005)。更重要的是跳甲成虫和幼虫对植株造成的伤口，很容易被其他病原菌利用继而侵染植株，从而引起其他疾病的发生，如软腐病、根肿病等病害的病原菌从跳甲幼虫咬食后的伤痕侵染植株体内，造成病害的发生。

目前，跳甲的主要防治措施有：(1)农业防治：及时处理农作物残体落叶；播种前深耕晒土；实行轮作的耕作制度。(2)化学农药防治：化学农药防治是跳甲防治的主要手段，常用的农药有90％晶体敌百虫、50％辛硫磷乳油、21％灭杀毙等。(3)黑光灯诱杀：因为跳甲成虫对黑光灯比较敏感，人们利用它的这一特点进行诱导捕杀，对防治有一定的效果。

目前人们防治跳甲的手段和方法主要是应用化学农药。但是化学农药的具有毒性高、降解周期长等缺点，长期使用后对生态环境和食品安全造成严重的问题。在这种背景下，除了继续探索低毒、低残留、低污染的化学农药外，生物农药作为一种“绿色农药”，其对病虫害防治效果高、多种活性成分和药效因子共同发挥作用，使得病虫害难以对其产生药物抗性，而且使用后几乎不会对人类和环境造成农药残留问题等负面问题，逐渐成为继化学农药之后一个新的研究和关注的热门。目前，在黄曲条跳甲的生物防治中，首先利用昆虫病原线虫防治跳甲虫害；其次，利用生物学技术手段对作物进行基因改造，获得具有抗跳甲虫害的新性状也是防治跳甲的一种重要方式；另外，新一代的调控型“农药”植物次生物质作为也被用来防治跳甲。然而，在微生物防治跳甲领域，除了利用抗生素农药(如1.8％阿维菌素乳油等被应用外，还有报道一些虫生真菌能够对跳甲具有一定的防效。但是目前商业化的生物农药的产品种类和数量仍然很少。

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)简称b.t，属于革兰氏阳性菌，在生长后期能够形成内生芽孢的细菌，自然界土壤中广泛的分布。在《伯杰细菌鉴定手册》第九版中，苏云金芽孢杆菌归为第二类、第十八群，属于形成于内生芽孢的杆菌和球菌部，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属的一个种(关雄1997)。

苏云金芽孢杆菌区别于蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌的最显著的特征是，在芽孢形成的同时，会在菌体的一端或两端形成一种杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，icps)，是一种碱性蛋白。这种杀虫晶体蛋白由一个或多个多肽组成，其晶体的形状、大小因菌株的不同而异，形状有菱形、圆形、方形、米粒型或其他一些不规则形状等。杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的毒杀作用，如鞘翅目、鳞翅目、双翅目、膜翅目等昆虫，由于其作用的专一性，只对特异的靶标生物具有生物活性，而不会对人、畜等的健康造成危害，因而苏云金芽孢杆菌制剂被广泛的应用于农业害虫的防治(carlbergetal1995)。

苏云金芽孢杆菌具有非常广的杀虫活性谱，靶标对象有节肢动物门、原生动物门、变形动物们、线形动物门等有害生物。发挥生物活性的物质除了伴胞晶体蛋白外，还有许多次代谢产物，如抗生素、细菌素等活性物质(capalbo1995)。

苏云金杆菌制剂在农业害虫防治中具有许多优点：(1)对人、畜等安全无毒，不会对环境造成污染；(2)对害虫天敌和有益生物无毒杀作用，有利于维持生态平衡；(3)对农作物无毒副作用，不影响农产品的自身品质；(4)制剂中的有效杀虫成分复杂，相互作用，共同发挥杀虫活性，不利于害虫抗药性的产生；(5)苏云金杆菌制剂的制作工艺和生产设备较为简单，原材料来源广泛，生产成本较低；(6)可以在遗传学水平上通过分子生物学技术对野生菌株加以改造，获得能够满足人们需要的更好的工程菌。目前，苏云金芽孢杆菌制剂是世界上应用最为广泛的微生物农药。

技术实现要素：

本发明的目的在于分离得到一株对黄曲条跳甲具有高毒力的苏云金芽孢杆菌，并由该菌制备了一种杀黄曲条跳甲的苏云金杆菌制剂，通过田间试验证明其防治黄曲条跳甲的良好效果，最高防效达到了80％以上。

本发明的技术方案如下所述：

申请人从中国甘肃省兰州市分离筛选得到一株对黄曲条跳甲具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)菌株han055，申请人将该菌株命名为苏云金芽孢杆菌han055，bacillusthuringiensishan055，于2015年10月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccno：m2015608。

苏云金芽孢杆菌han055菌株具有下列明显特征：

(1)该菌株对黄曲条跳甲具有高毒力。

(2)由本发明的菌株苏云金芽孢杆菌han055菌株制备的制剂(命名为wp-han055)在防治黄曲条跳甲病虫害上取得显著效果。

苏云金芽孢杆菌han055菌株的菌学特征如下：

该菌营养体为短杆状，具周生鞭毛或无鞭毛，大小为1.2-1.8μmx3.0-5.4μm，革兰氏染色呈阳性反应，芽孢为椭圆形，大小约为0.8μmx2.0μm，在芽孢成熟后产生菱形伴胞晶体。在lb培养基上28℃培养，镜检观察，菌落呈乳白色，蜡状，近似圆形，边缘不整齐。最适生长温度为28℃，ph6-8均生长良好，最适生长ph为7.0-7.2。

按照常规甘油管保藏方法保藏该菌株。

更详细的技术方案参见实施例部分的描述。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明分离苏云金芽孢杆菌的16srrna基因序列。

图1：是本发明的苏云金芽孢杆菌han055的16srrna基因系统发生树，附图标记说明：图示各节点处为不同的蜡状芽孢杆菌群菌株，包括苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。

图2：是本发明苏云金杆菌han055及杀虫蛋白晶体的显微照片。

图3：是本发明菌株han055的杀虫晶体蛋白的sds-page检测结果。附图标记说明：图中：m为蛋白质maker，p为han055的杀虫晶体蛋白。

具体实施方案

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，没有限制作用。本发明中所涉及的其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加以实施。

实施例1苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定及其杀虫晶体蛋白的活性检测

1、苏云金芽孢杆菌的分离

土样的采集：申请人2010年8月在中国甘肃省兰州市采集距地表面0-15cm的土壤，去掉其中的枯枝、石子等杂物后，室温下晾干，研磨破碎后过40目筛，装入土样瓶常温保存备用。

bt的分离：称取1克土样于含有20mllb+醋酸钠的液体培养基(按1l培养基计：蛋白胨10g；酵母粉5g；氯化钠10g；醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1l，调ph至7.0)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm，培养4小时；将培养物于80℃水中热处理3分钟；取100ul处理后的培养液使用la固体培养基(按1l培养基计：蛋白胨0.5g；酵母粉1.5g；氯化钠10g；琼脂粉15g；补充蒸馏水至1l，调ph至7.0)平板涂布，然后置于30℃培养12-16小时；再从la平板上挑取疑似苏云金芽孢杆菌的菌落于t3培养基(1l：蛋白胨0.5g；酵母粉1.5g；磷酸二氢钠3.9g、磷酸氢二钠8.95g；mncl20.005g；琼脂粉：15g；ph7.0)平板上，置于30℃培养48小时后，挑取菌苔中少量菌制片，碱性复红染色后在普通光学显微镜下镜检观察；能够观察到蛋白晶体产生的菌株即为苏云金芽孢杆菌。

本发明中分离到的苏云金芽孢杆菌菌株han055能够产生菱形晶体。

2、苏云金芽孢杆菌菌种鉴定

(1)苏云金芽孢杆菌han055总dna的抽提

将han055菌株进行纯培养后，在新的lb固体培养基(按1l培养基计：蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；琼脂粉：15g；补充蒸馏水至1l，调ph至7.0)平板上划线，用接种环通过无菌操作接种于5ml的lb液体培养基(按1l培养基计：蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；补充蒸馏水至1l，调ph至ph7.0)中，置于28℃、200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操作将50μl的培养物转移至5ml的lb液体培养基中，同样条件培养3-4小时；然后以12000rpm，0.5min离心收集菌体，用1mlste[配方：0.1mol/lnacl，10mmol/ltris-hcl(ph8.0)，1mmol/ledta(ph8.0)]洗涤一次，加100μl溶液i[配方：1mol/ltris-hcl(ph8.0)，0.5mol/ledta(ph8.0)，50mmol/l葡萄糖]和10μl溶菌酶(浓度：50mg/ml)，在37℃作用30min以上；加入200μl2％的十二烷基磺酸钠(sds)于55℃水浴30min；加入200μl5mol/lnacl混和，再加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比：25:24:1)，离心12000rpm，5min，吸取上清液，重复抽提1－2次；将上层dna溶液转移至1.5ml离心管，加入等体积95％乙醇，室温静置5min后以12000rpm离心5min，沉淀用200μl70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μlte溶液中

(2)pcr扩增苏云金芽孢杆菌han055的16srdna

根据真菌、细菌16srdna保守区通用引物27f和1492r(reysenbachal,wickhamgs,pacenr.phylogeneticanalysisofthehyperthermophilicpinkfilamentcommunityinoctopusspring,yellowstonenationalpark〔j〕.appliedandenvironmentalmicrobiology,1994,60:2113-2119.)进行pcr扩增。

通用引物序列如下：

27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，

1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’；

pcr反应体系为：10×buffer2μl，2mmol/ldntp1.5μl，10μmol/l通用引物各0.4μl，taq酶1u，拮抗细菌总dna1μl，补加灭菌去离子h2o至20μl。

pcr扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸5min。

(4)pcr产物的序列测定及分析

将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，进行琼脂糖凝胶检测后，将pcr产物送至北京奥科生物技术有限责任公司测序。通过两个测序反应获得pcr扩增产物的全长1435bp，测序结果输入ncbi，用blastn程序交送genbank数据库进行比较分析，表明该序列与genbank数据库中的苏云金芽孢杆菌属的不同菌株的16srdna同源性较高，相似性达到100％，鉴定该菌株属于芽孢杆菌科(bacillaceae)芽孢杆菌属(bacillus)，申请人将该菌株命名为苏云金芽孢杆菌han055，bacillusthuringiensishan055，于2015年10月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccno：m2015608。

从genbank数据库中下载与其16srrna基因序列相近的蜡状芽孢杆菌群菌株及苏云金芽孢杆菌标准菌株的16srrna基因序列(包括不完整的16srrna基因序列)，利用clustalx与han055的16srrna序列作多序列比对(multiplesequencealignment)。

根据多序列比对结果绘制成系统发生树(见图1)，图1中线段的长度不同表示同源性的差异。表明不同的菌株的进化途径分成了两个支路。本发明分离鉴定的苏云金芽孢杆菌han055菌株与已报道的苏云金芽孢杆菌标准菌株处于同一进化分支，且与bc群中其他菌株在进化分支上相距较远。因此进一步确证本发明分离的苏云金芽孢杆菌han055菌株为一株苏云金芽孢杆菌。

3、苏云金芽孢杆菌han055菌株中杀虫晶体蛋白图谱与鉴定

(1)han055菌株杀虫晶体蛋白的提取

将苏云金芽孢杆菌han055菌株过夜活化后，转接到40mlicpm(蛋白胨0.6％，葡萄糖0.5％，caco30.1％，mgso4·7h2o0.1％，k2hpo40.05％，用蒸馏水补充至1l，调ph至7.0)培养基中，于28℃摇床培养32～48h，至芽孢基本脱落。12000r/min4℃离心2min后收集菌体，依次用1mol/lnacl-10mmol/ledta溶液及ddh2o分别洗涤沉淀3次，然后向洗涤后的晶胞混合物加入适量的50mmol/lna2co3(ph10.5，含3％β-巯基乙醇)，充分混匀，于37℃处理40min。12000r/min，4℃离心2min收集上清，离心两次，以充分去除芽孢及营养体细胞。用4mol/lnaac-hac溶液(ph4.5)调节溶液ph值至晶体蛋白等电点附近，冰上沉淀4～5h或过夜。12000r/min，4℃离心10min收集沉淀，并用无菌ddh2o洗涤3次，于-80℃保存备用，使用前用碱性heps溶液溶解。

(2)sds-page的制备

选择好15mm的玻璃板、对应的样品梳以及spacer用ddh20洗干净晾干备用；将两块洗净的玻璃板之间加入spacer，然后配制10％分离胶(ddh204ml，1.0mol/ltris-hclph8.82.5ml，30％丙烯酰胺溶液3.3ml，10％sds0.1ml，10％aps0.1ml，temed0.004ml)10.0ml，混匀。然后缓缓倒入玻璃板之间，立即覆一层正丁醇溶液，1h分离胶凝固，倒掉正丁醇后，再用ddh20冲洗几次，然后用滤纸吸干。然后按照相同的步骤配制5％浓缩胶(ddh202.2ml，30％丙烯酰胺溶液0.67ml，0.5mol/ltris-hclph6.81.0ml，10％sds0.04ml，10％aps0.04ml，temed0.004ml)4ml，然后灌制浓缩胶，插入梳子，待凝固后拔掉梳子，加入10x电极缓冲液(按1l量计算：tris30.36g，glycine144.13g，sds5g)。

(3)凝胶电泳

装好电泳系统，将晶体蛋白样品与2x样品缓冲液(0.125mtris-hclph6.8，20％甘油，4％sds，10％巯基乙醇，0.02％溴酚蓝v/v＝1:1)混合，上样1ul，稳压电泳至溴酚蓝带刚跑出分离胶时停止电泳。卸下胶板，剥离浓缩胶后放入考马斯亮蓝染色液中染色，再脱色，照胶。

实施例2苏云金芽孢杆菌制剂wp-han055制备

1、菌种制备：首先，将保存的苏云金芽孢杆菌han055菌株接种至斜面(bp培养基1l：蛋白胨5g；牛肉膏3g；氯化钠5g；ph7.2)，30℃培养3-5天(形成有力的芽孢)；再用5ml无菌水将菌体洗下，在75-80℃水浴上保温15-20分钟；取芽孢悬液接种到含有100mltp液体培养基(按1l量计算：胰蛋白胨20g；右旋糖2g；磷酸氢二钠2.5g；氯化钠5g；用蒸馏水补充至1l；调ph至ph7.0)的500ml三角瓶，摇床培养(30℃，220rpm)6-8小时，即为一级种子；然后以2％体积接种量转接新的tp培养基1000ml，得到二级种子；再用二级种子以0.5％接种量接种种子罐，获得发酵菌种。

2、工业发酵培养基的制备：按1l量计算：黄豆饼粉18g；玉米粉5g；玉米浆36g；淀粉7.5g；鱼粉3g；k2hpo42.16g；mgso4·7h2o0.75g；caco31.5g；(nh4)2so42g，余量是水。

3、发酵培养条件：温度为30±0.5℃；接种时ph6.8-7.2；消泡剂是发酵用有机硅消泡剂(活性成分：聚硅氧烷、分散剂、非离子表面活性剂)，用量为按配料体积的0.15％-0.2％；溶氧控制，在接种至延迟期之间通气量为1:0.6-1.0(v/v，指发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比)，罐压0.3-0.5kg/cm²，进入对数期后通气量增大至1:1.0-1.2或更大。

4、发酵终点：接种后32-36小时，芽孢形成率达到95-98％，此刻下罐。

5、发酵液后处理：离心浓缩(16000转/分)；喷雾干燥(塔顶进口温度40-150℃，塔中层温度保持在60-65℃)；添加高岭土作分散剂，添加量55％(w/w)。

6、粉剂包装成品，苏云金杆菌制剂wp-han055中活芽孢数量为200亿cfu/g。

实施例3苏云金芽孢杆菌制剂wp-han055对黄曲条跳甲的生测实验

1、采集自福建省建瓯市“上海青”小白菜上的健康黄曲条跳甲成虫及新鲜的“上海青”小白菜叶片。

2、用无菌蒸馏水将本发明制备的苏云金杆菌制剂稀释至0.1mg/ml。

3、然后将“上海青”小白菜叶片在苏云金杆菌制剂稀释液中浸泡25分钟，以等量无菌水作对照。苏云金杆菌制剂稀释液和无菌水中都添加0.1％(w/v)的吐温80。

4、分别用苏云金杆菌制剂稀释液和清水处理过的叶片喂食已饥饿24小时的黄曲条跳甲，每个处理分别作3个重复，每个重复中的黄曲条跳甲数量大约为20头，。

5、喂食72小时后观察和统计“上海青”小白菜上黄曲条跳甲的死亡数量，计算黄曲条跳甲死亡率和校正死亡率。

6、试验结果

表1苏云金芽孢杆菌制剂wp-han055对黄曲条跳甲的生测试验

表1的说明：死亡率(％)＝(死亡虫数/总虫数)x100；

校正死亡率(％)＝[(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)]x100

实施例3苏云金芽孢杆菌制剂wp-han055防治黄曲条跳甲的田间药效试验

1、试验地点：广东省珠海市斗门区斗门镇大赤坎村。

2、试验处理设置：苏云金杆菌制剂wp-han055处理，用量2kg/亩，处理面积20亩；以喷施清水为空白对照和10％啶虫脒微乳剂对照，各1亩，各处理之间设有水沟隔离带。种植的作物为“上海青”小白菜。

3、试验步骤：

(1)在“上海青”小白菜育苗时，种苗刚出土时，按照每亩2千克用量，兑水稀释后喷淋植株；

(2)移栽后一周内，按照每亩2千克用量，用水稀释后，淋根。空白对照用等量清水代替，化学农药按照标准方法使用。

(3)移栽后用药前、移栽30天及60天后分别调查单株黄曲条跳甲成虫落虫数。每个处理随机调查30株，计算单株平均落虫数。

(4)15％啶虫脒使用方法按照说明书使用。

4、参照标准：中华人民共和国农业行业标准(gb/t17980.18-2000)，《田间药效试验准则(一)》：杀虫剂防治十字花科黄曲条跳甲。

成虫防治效果(％)＝1-[(ck0xpt1)x100/(ck1xpt0)]

式中：ck0：空白对照区施药前黄曲条跳甲虫数；ck1：空白对照区施药后黄曲条跳甲虫数；pt0：药剂处理区施药前黄曲条跳甲虫数；pt1：药剂处理区施药后黄曲条跳甲虫数。

5、试验结果

表2苏云金芽孢杆菌制剂wp-han055防治黄曲条跳甲的田间药效试验结果

试验结果表明，用药30天和60天后，苏云金杆菌制剂wp-han055对黄曲条跳甲的防治效果分别达到了83.4％和82.2％，防治效果非常明显，远远高于对照即10％啶虫脒的54.4％和44.3％。通过以上试验说明，本发明的苏云金芽孢杆菌han055菌株及其制剂对黄曲条跳甲具有很强的毒力，在杀黄曲条跳甲制剂方面具有很好的应用价值和潜力。

sequencelisting

<110>华中农业大学

<120>防治黄曲条跳甲的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用

<130>

<141>2016-10-29

<160>1

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>1442

<212>dna

<213>苏云金芽孢杆菌

<220>

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<223>

<400>1

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gacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccgg120

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