一株土壤放线菌及其防治蚜虫应用的制作方法

本发明涉及一株土壤放线菌lf-1及其应用，属于农业植物保护技术领域，具体地说，本发明所述的土壤放线菌lf-1是一种人工分离的放线菌，为浅天青色链霉菌（streptomycescoelescens）lf-1，该微生物对多种蚜虫，特别是烟叶蚜虫，油菜蚜虫，蔷薇蚜虫等有明显的防治作用。

背景技术：

蚜虫是粮食和经济作物的主要害虫，种类繁多，中国大概有1100种。其繁殖能力极强，每年可繁殖20-30代，且每代繁殖数量惊人，每年都对我国的粮食和经济作物造成了严重的危害。

目前蚜虫的防治主要采用化学防治，如吡虫啉、杀灭菊酯、抗蚜威等。由于化学杀虫剂使用操作方便并且能迅速有效地控制害虫种群数量，因而在目前乃至今后相当长的时期内，化学农药仍然是控制媒介昆虫及农业害虫的有利武器。但大量使用化学农药既破坏生态平衡，又会造成农产品中的农药高残留，对人畜和环境也会造成二次危害，不仅损害了人和动物的健康，而且引起土壤微生物种群多样性和丰度减少，土壤肥力下降，另一方面引发病原菌及害虫产生耐药性，使防治工作难度和成本加大。现在已经出现了长期使用化学药剂的不良后果，蚜虫已经产生了明现的抗药性，并带来严重的“3r”问题。

大量的研究已经表明生物防治是一种有效防治害虫的环保措施，其中微生物防治害虫作为一种对环境友好、无残留的生物防治方法，得到越来越多的研究和应用。目前实际生产中应用微生物菌剂防治蚜虫不多，主要是虫生真菌发酵产物及其活性物质，如利用一些虫生真菌白僵菌、绿僵菌、拟青霉等防治害虫，微生物防治害虫最成功的应该是利用苏云菌杆菌防治棉铃虫了，在全世界大概是推广应用最好的微生物菌剂。

放线菌在自然界中分布广泛,是一类具有巨大实用价值的微生物种群，有望成为新型生物农药的主要来源之一。目前放线菌活性产物研究较多，利用菌剂防治虫害研究较少，罗兰等人初步研究了2株放线菌防治萝卜蚜，效果较好。在烟草烟蚜虫防治上的应用放线菌剂更少见报道，仅见廖文程等人利用菌株发酵的活性产物防治烟叶蚜虫。鲜见利用放线菌株的菌剂防治烟叶蚜的报道，未见利用浅天青色链霉菌菌株制备菌剂防治蚜虫。

随着国家大力倡导“无公害”绿色农业理念，迫切需要使用更多的对人及自然生态无危害的生物防治方法来减少化学农药的使用量。本发明的浅天青色链霉菌（streptomycescoelescens）lf-1防治蚜虫，具有高效安全，防效时间长等优点，菌剂应用于生产将更具有应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对目前蚜虫对农药产生抗药性以及使用农药对环境的二次污染，提供一株适用于防治蚜虫的土壤放线菌新菌株lf-1，利用该菌株能够防治蚜虫，提高农作物的产量和经济效益，并减少农药对人畜和环境的二次污染危害。

本发明的放线菌菌株分类命名为浅天青色链霉菌（streptomycescoelescens）

lf-1，已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年10月20日，保藏编号为cctccno：m2014500。

本发明所述浅天青色放线菌（streptomycescoelescens）lf-1应用于多种蚜虫防治，特别是在防治烟叶蚜虫、油菜蚜虫及蔷薇蚜虫等多种蚜虫效果显著。

本发明所述菌株lf-1经pcr技术，dna测序仪分析，该菌株的16srdna基因序列由1434个碱基组成。本发明的菌株lf-1，用常规方法分离自云南楚雄烟田土壤，经形态、生理生化特征鉴定及16srdna基因序列分析，鉴定为浅天青色放线菌（streptomycescoelescens）lf-1。

本发明的优点在于菌株lf-1产基淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶及几丁质酶，具有实际应用防治蚜虫效果好，持效时间较长，而且对人畜安全和环境友好的特点。

附图说明

图1为本发明所述的浅天青色放线菌lf-1在固体培养基上培养特征（正面）。

图2为本发明所述的浅天青色放线菌lf-1菌丝体特征（光学显微镜40倍）。

图3为本发明所述的浅天青色放线菌lf-1菌株的系统发育进化树。

图3中，分支节点上的数字表示经过1000次bootstrap分析所支持的结果。线段标尺0.001表示0.1%的序列差异的分支长度。

具体实施方式

以下所述实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。

1.分离培养基：

改良高氏ⅰ号培养基：

硝酸钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸镁0.05%，nacl0.05%，硫酸亚铁0.001%，可溶性淀粉2.0%，琼脂1.5%，重铬酸钾0.025%，苜蓿根土壤浸提液150ml，蒸馏水850ml，ph7.0-7.5，121℃下灭菌30min。

2.检测鉴定培养基：

1）淀粉酶检测：酵母粉0.15%，可溶性淀粉1.5%，硝酸钠0.15%,磷酸氢二钾0.1%，mgso4·7h2o0.05%,feso4.7h2o(0.001%),氯化钾0.05%,琼脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

2）脂肪酶检测：油脂中性红培养基，氯化钠0.5%，蛋白胨1.0%，橄榄油10ml，牛肉膏0.5%，琼脂1.4%，中性红1.6%中性红水溶液1ml，加水定容至1000ml。

3）蛋白酶检测：

蛋白胨0.5%，酵母粉0.25%，可溶性淀粉1%，磷酸二氢钾0.03%，mgso4·7h2o0.05%，牛奶100ml，氯化钠0.1%，琼脂1.4%，加水至1000ml。

4）几丁质酶检测：

硝酸钠0.15%，mgso4·7h2o0.05%，磷酸二氢钾0.03%，feso4·7h2o0.015%，10g/l胶态几丁质200ml，琼脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

5）纤维素酶检测：氯化钠0.6%,mgso4.7h2o0.01%，磷酸二氢钾0.05%,氯化钙0.01%,磷酸氢二钾0.2%，cmc-na1.5%，硫酸铵0.2%,酵母粉0.1%，琼脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

3.液体培养基：

硝酸钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.05%，硫酸亚铁0.001%，可溶性淀粉2.0%，重铬酸钾0.025%，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.5，121℃下灭菌30min。

实例1:

1.菌株分离

本发明菌株的获得方法为常规方法，具体如下：将采自楚雄烟田的土壤样品风干，称取新土样10g放入100℃烘箱处理15min，取出再放在装有90rnl无菌水250ml三角瓶中，加入小玻璃珠充分振30min，吸取1ml悬浮液，按10倍梯度稀释法，制成稀释液备用。取50ul~100ul涂布在装有改良高氏1号培养基平皿上，将培养皿倒置于28℃恒温箱中培养5～7d，及时记录其菌落形态和培养特性，同时转接纯化后编号保存备用。

2.鉴定

2.1形态鉴定

培养基菌落形态观察：lf-1菌株划线培养于改良高氏一号培养基上菌落形态，菌落凸起，干燥，边缘花环状，不光滑，菌落先变红后变灰白，培养基逐渐变蓝，培养基变蓝所需时间较短，培养2-3天可看到培养基呈深蓝色(见图1)。

菌株lf-1气生菌丝分支较少，产孢菌丝具有分支，单枝孢子丝为螺旋状，孢子丝较短，该菌株产孢菌丝形态（见图2）。

2.2分子生物学特征

lf-1菌株的16srdna基因序列的pcr扩增到的片段大小约1500bp，送上海生工测序后在genbank中进行blast分析，lf-1菌株与streptomycescoelescensaf503496相似性为100%。以同源性比较高(>97％)的链霉菌16srdna序列作为参比对象，构建系统进化树。使用clustalx2.0软件进行多序列比对，然后采用邻位相接法(neighbour-joining)利用mega5．1(beta)绘制系统进化树，自展数(bootstrap)为1000。结果菌株lf-1与streptomycescoelescensaf503496都聚在一个分枝上（见图3）。

2.3菌株发酵液的制备

lf-1菌株先接种在改良高氏一号平皿培养基上活化培养3～5d，再分别接种在装有50ml液体培养液的250ml锥形瓶中，每瓶接种2～3环。28℃，120r/min发酵3d。以15%接种量扩大发酵，培养5d后单层纱布过滤得到菌液发酵液，4℃保存备用。

3.酶活检测：

先将菌株lf-1从斜面上接种在改良高氏一号培养基上，活化培养3d天，再将活化好的菌体分别点植在酶活检测培养基淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶及几丁质酶培养基上，每种酶重复3次，倒置培养7天，观察测定其酶比活。

表1lf-1菌株5种酶活性检测

结果表明（表1），菌株lf-1具有产淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶及几丁质酶的活性，水解圈最大的是淀粉酶，淀粉酶水解圈直径22mm，酶比活3.1；其次是纤维素酶，水解圈直径为12mm，酶比活为4.0；几丁质酶水解圈直径11mm，酶比活为2.2。蛋白酶和脂肪酶的酶活较弱。菌株lf-1具有这5种酶活，进一步说明菌株lf-1具有产杀蚜虫或者抑制蚜虫的活性物的潜力。

实例2：

发酵液对温室烟叶蚜虫防治：

选择温室内长势良好且长相一致的烤烟，按随机区组设计，每个处理5株，3次重复，在每株烤烟植株上接种约200头左右蚜虫，记录成活蚜虫数。菌株发酵液分别稀释10倍，吡虫啉处理为10%吡虫啉wp，稀释1000倍（青岛产），以清水为对照ck1，分别喷施烟株，重复三次。在喷施后的第1天﹑第3天﹑第5天﹑第7天及第10天统计蚜虫数量，计算蚜虫减退率和防效。

计算公式如下：

虫口减退率（%）=（防治前的活虫数-防治后的活虫数）／防治前的活虫数×100

防治效果（%）=[1-(处理区防治后的活虫数×对照区防治前的活虫数)／(处理区防治前的活虫数×对照区防治后的活虫数)]×100

表2.不同处理的虫口减退率及防效分析

。

温室进行的菌剂防治烟叶蚜虫研究（表2），结果表明处理后第1天喷施吡虫啉后的虫口减退率和防效分别为89.1%和69.2%，喷施菌剂lf-1虫口减退率和防效分别为52.1%和69.2%，喷施清水的对照减退率和防效分别为-11.6%和28.3%，菌剂处理的效果较吡虫啉处理的效果低，但效果明显比清水对照好；处理后第5天吡虫啉虫口减退率和防效分别为95.1%和98.2%，喷施菌剂lf-1虫口减退率和防效分别为59.4%和86.9%，喷施清水的对照减退率和防效分别为-104.1%和34.4%。吡虫啉处理的效果好于菌剂处理的效果，菌剂防效比第3天增长明显，并明显好于清水对照。喷施后第7天，喷施菌剂和喷施吡虫啉蚜虫防效分别是92%和95.1%，两者防治效果几乎没有差异，防效都明显好于对照清水；到第10天两者的防效没有差异。表明前5天喷施菌剂lf-1的防效没有喷施吡虫啉效果好，但每天的防效都逐步提高，到第7天后两者防效几乎没有差异。也说明菌剂lf-1防治蚜虫较化学农药起作用进程慢一些，但防治蚜虫效果和化学农药吡虫啉几乎一样。

实例3：

菌株发酵液对大田烟叶蚜虫防治：

选取大田长势一致的烟株，将事先培养好的蚜虫（若虫）按200头/株放在烟株上，用细沙网罩将烟株罩好。菌株发酵液分别稀释5倍，以清水为对照，分别喷施烟株，每个处理5株，3次重复，做好隔离，在喷施后的第1天﹑第3天﹑第5天﹑第7天﹑第10天统计蚜虫数量，计算蚜虫死亡率并进行统计分析。

表3.不同处理的防效显著性分析（显著性水平a=0.05）

菌剂lf-1在防治大田烟叶蚜虫的效果较好（见表3），从喷施菌剂后第1天到第10天，5次的观察记录进行显著性分析，结果表明从喷施菌剂后的第1天，喷施菌剂lf-1防治蚜虫的效果都显著高于喷洒水（对照）的处理效果。

实例4：

菌株发酵液对烟叶蚜虫，蔷薇蚜虫，油菜蚜虫的防治：

菌株发酵液分别稀释5倍，以清水为对照。先在温室培养3种蚜虫（烟叶蚜虫，蔷薇蚜虫，油菜蚜虫），选取长势一致的烟苗，蔷薇嫩枝，以及油菜嫩枝，做好隔离，喷洒发酵菌剂。分别选取虫龄一致的蚜虫100头/枝放入到烟苗，蔷薇和油菜上，以清水为对照，重复3次。第2天即处理后第1天开始观察统计蚜虫情况。

计算公式:

死亡率(%)=蚜虫死亡数/蚜虫总头数

校正死亡率(%)=（蚜虫总死亡数-对照死亡数）/（1-对照死亡率）

表3.3种蚜虫死亡数量分析

。

喷洒菌剂后第1天蚜虫开始死亡，第2天烟苗、蔷薇及油菜上蚜虫的校正死亡率分别为30.1%，31.3%及45.7%。第4天的时候蚜虫死亡较多，有的开始变成黑色，3种蚜虫的校正死亡率分别为53.4%，79.2%及78.5%。到第7天的时候大部分死亡，蚜虫的校正死亡率分别为64.4%，91.9%及83.6%，喷施菌剂的3种蚜虫死亡率处理均显著高于对照ck（见表3）。

研究证明，本发明的浅天青色放线菌菌株lf-1产淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶及几丁质酶，对多种蚜虫防治效果明显，生防效果较好，可应用于防治多种作物蚜虫危害，有利于人畜安全和保护环境，是重要的防治蚜虫的潜在应用微生物菌株。

浅天青色链霉菌（streptomycescoelescens）lf-1核苷酸碱基序列：

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<110>云南大学

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