一株产紫杉烷类化合物巴卡亭Ⅲ的黑曲霉及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种从巴山榧树中分离出的内生菌，命名为黑曲霉bp12±3，该菌株具有高产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的特性，还涉及黑曲霉bp12±3在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用。
背景技术：
：紫杉醇(taxol)，国际通用名paclitaxel，是上世纪六十年代美国科学家从植物太平洋红豆杉中分离提取的一种二萜类化合物，通过ⅱ-ⅲ临床验证，证明具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等有特效，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效，是近年来在抗癌领域的重大发现，已于1992年被美国食品和药物管理局(fda)批准为治疗转移性卵巢癌的新药，并已上市。紫杉醇为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。分子式为c47h5lnol4，相对分子量为853.92，溶点为213～216℃(wanimc,taylorhl,wallme,etal.plantantitumoragents.vi.theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromtaxusbrevifolia[j].jamchemsoc,1971,93:2325～2327.)。经研究表明，目前发现的抗肿瘤活性物质主要是紫杉烷二萜类化合物，多达7大类，100多种骨架。这为扩大抗肿瘤范围、半合成新药，以避免抗药性提供了更大的开发领域。紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明，紫杉醇只能结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白发生二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。因此，紫杉醇能抑制肿瘤细胞的生长。经测定表明，紫杉醇在红豆杉属植物树皮中的含量约为0.003％-0.069％，每提取1kg紫杉醇，要砍伐大约2000棵树，即便将全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，且造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失。因此，紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的关键因素。紫杉醇内生真菌的分离，是近年来发展起来的一种有效解决紫杉醇资源问题的新途径。内生菌(endophyte)一词由debary(debarya,1866,morphologeandphysiologiederpilze,flechtenandmyxomyceten.engelman,leipzig,1-316.)首先提出，是指生活在植物组织内存在的微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌(epiphyte)。petrini(petrinio,fungalendophytesoftreeleaves.in:andrewsjhhiranoandsseds.microbialecologyofleaves.newyorkspringer-verlag.1991,179-197.)将内生菌定义为在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的菌，这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(latentpathogens)和菌根菌。1993年，strobel等从短叶红豆杉(t.brevifoia)中分离筛选出了一株内生真菌(taxomycesandreanae)，发现它竟然能够在离体培养的时候合成紫杉醇，产率达到24-50μg/l。同时strobel认为，内生真菌之所以要合成紫杉醇，可能与抵抗由根部侵入的真菌作用有关，同时更好的模拟寄主的化学环境，在种间竞争中获得优势(stierlea,stierled,strobelg，eta1.,1994,endophytixfungiofpacificyew(taxus—brevifo1ia)asasourceoftaxol,taxanes,andotherpharmacophoresacssymposiumseries.557:64—77.)。这是一个全新的发现，无疑富有开创性。此后，各国科学家们相继分离得到了多种能够合成紫杉醇的内生真菌，它们的产率高低不等。紫杉醇产生菌的宿主多见于裸子植物红豆杉科(taxaceae)的红豆杉属(taxus)和澳洲红豆杉属(austrotaxus)中。前者广泛分布于欧亚大陆和北美，如中国的东北三省、中原地区、云南、贵州、四川、西藏以及美国和加拿大等地区；在寒带、温带及亚热带地区也有分布，极少成林，且生长缓慢。后者仅见于南半球，数量极少。如此可见，任何与红豆杉属植物存在物质、能量交换的生物都有可能出现紫杉醇类次生代谢产物的遗传基因传递，尤其是附生菌类最有可能。有研究表明，红豆杉中的紫杉醇含量与其种属无明显的相关性，而与红豆杉的产地生态环境密切相关。所以人们有待于从和红豆杉有相同环境要求的其他植物中分离出更多的紫杉醇产生菌，而且红豆杉树的主干和侧枝、枝条的树皮、韧皮部以及皮下部分、根、成熟茎、果实及叶子中的内生真菌的研究已有报道。野生型真菌产紫杉醇或类似物的含量普遍偏低，其产量均未达到工业化生产的要求。迄今为止，产紫杉醇内生真菌菌株主要从濒危物种红豆杉属的植物中分离到的，却忽略了红豆杉科中其它属植物。因为有研究表明，红豆杉科榧属植物中也发现有紫杉烷类化合物，但含量极低，紫杉醇含量低于0.003％，认为药用开发价值不大(易官美，邱迎春.榧树的研究现状与发展[j].资源与环境，2013，29(8)：844-848)。刘艳等从海南粗榧(cephalotaxushainanensisli)中分离到的产次生代谢产物的菌种，主要产生的可能抗肿瘤物质是三尖杉酯碱类化合物(刘艳等.海南粗榧内生真菌ch1307鉴定及其抗肿瘤活性研究[d].海南大学,2012.蒋春洁.海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[d].海南大学,2014.)本发明从神农架国家地质森林公园巴山榧树(红豆杉科，榧属；torreyafargesii)组织中分离出一株内生真菌；通过高效液相色谱分析和抗肿瘤活性分析，筛选出产生紫杉醇或类似物次生代谢产物的菌种；并通过用液质联用仪(hplc-ms)进行定性检测，判断该菌株产生的紫杉烷类化合物为巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。通过微生物发酵的方法大量生产紫杉醇，有望改善目前紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。即使其产量与植物中紫杉醇含量相当或略低，但由于真菌发酵周期短(10～15天)，发酵规模可以人为控制，其生产能力大大优于植物材料的生产能力。技术实现要素：本发明的目的是在于提供了一种从巴山榧树中分离出的内生菌黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，该菌株具有高产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的特性。本发明的另一个目的是在于提供了一种黑曲霉bp12±3的培养方法，通过在培养基中添加前体物质l-苯丙氨酸，巴卡亭ⅲ的产量可增长129.84％。本发明的再一个目的是在于提供了一种黑曲霉bp12±3在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用，经试验证明，黑曲霉bp12±3发酵液提取物对hela肿瘤细胞有明显的抑制作用，且随着紫杉醇的浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用增强。为了达到上述的目的，本发明通过下述技术方案实现：黑曲霉bp12±3的分离筛选，其步骤是：1、将巴山榧树的根、茎、叶、树皮分别用无菌水冲洗后，无菌吸水纸吸干，依次经75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用无菌水冲洗，用无菌刀将采集到的根、茎和树皮切成小段，取各部位的材料置于pda固体培养基平皿中，于28℃培养，待上述平皿中接种物切面边缘长出细小菌丝，挑取菌丝转接入新的pda固体平板上纯化直至为纯培养物；2、用菌丝尖端接种法将纯化的真菌接种至pda平板上，28℃培养。记录菌落大小、颜色、菌丝致密程度、菌落边缘是否整齐、菌落生长速度以及产色素等菌落形态；3、用琼脂块法测定内生真菌的抑菌活性：将待测供试细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)用lb培养基活化后，分别涂布于lb固体培养基表面，每个平皿中接种带有琼脂培养基的内生菌，37℃培养1-2天，观察琼脂块周围的抑菌圈，如此获得了一株同时具有抗金黄色葡萄球菌(g+)和大肠杆菌(g-)活性的菌株，记为bp12±3；4、经过平皿培养特性观察该菌株菌落颜色呈暗黑色，菌落反面颜色黄至黄褐色，菌落质地为丝绒状，有放射性沟纹，显微镜下观察，其分生孢子头呈疏松放射状，顶囊球形，直径50-80μm，小梗双层，梗基(4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直径3-4.5μm，鉴定为黑曲霉(aspergillusniger)，记为bp12±3；5、将菌株黑曲霉bp12±3在pda液体培养基中，180rpm、28℃活化3天，作为种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量，接入pda液体培养基中，180rpm，28℃培养7-9天收获发酵液；6、发酵结束后，收集滤液，滤液中加入1/3体积的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上层有机相，于旋转蒸发仪中除去有机溶剂，获得脂溶性提取物，其含量约为120mg/l；7、高效液相色谱(hplc)发现脂溶性提取物中含有与紫杉醇标准品保留时间基本一致的成分，测得保留时间为12.08min，与紫杉醇标准品保留时间相近，表明其含有紫杉醇或类似物，其相对百分含量为10.5％；8、液质联用(hplc-ms)测定代谢抽提物中紫杉醇类似物的结构，表明其母离子da为609.200，子离子da分别为549.200、367.000和427.100，源电压均为146，碰撞能分别为34、40和40，与紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ标准品完全一致，故判断黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3产生的紫杉醇类似物为巴卡亭ⅲ。所述的巴山榧树的组织中分离出来的黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2016年6月8日，保藏编号cctccno.m2016319，其特征是具有高产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的特性，发酵液中巴卡亭ⅲ的含量达到12.6mg/l，抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。黑曲霉bp12±3高产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的培养方法：在pda培养基中添加前体物质l-苯丙氨酸可增加巴卡亭ⅲ的产量，实验表明添加3.0mg/l的l-苯丙氨酸，可将黑曲霉bp12±3的巴卡亭ⅲ产量增长129.84％。黑曲霉bp12±3在治疗抗肿瘤细胞中的应用：通过cck-8法测定黑曲霉bp12±3的发酵液提取物对hela细胞的抑制作用，结果表明随着发酵液提取物浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用增强，当发酵液提取物的浓度为11.55μg/ml时，抑制率达到62.91％。与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：1、迄今为止，产紫杉醇内生真菌菌株主要从濒危物种红豆杉属的植物中分离，本发明是从巴山榧树(红豆杉科，榧属)组织中分离的内生真菌，这是又一例从红豆杉属以外的植物中分离到具有产生紫杉醇或类似物能力的植物内生真菌，这大大扩大了获取产生紫杉醇或类似物菌种的资源范围，有利于更广泛地利用微生物资源。2、有研究报道，某些植物内生菌产生紫杉醇的能力并不稳定，往往需要有前体物质的存在，而本发明的植物内生菌黑曲霉bp12±3可以非常稳定地产生紫杉醇类似物，发酵液中紫杉醇类似物的粗提取物含量可达120mg/l，其中紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的相对百分含量为10.5％，巴卡亭ⅲ的产量约为12.6mg/l，高于现有技术已公开的产量；以l-苯丙氨酸为前体，巴卡亭ⅲ的产量可增长129.84％。3、采用cck-8试剂法检验黑曲霉bp12±3对hela肿瘤细胞的抑制作用，表明所黑曲霉bp12±3发酵液的紫杉醇类似物对肿瘤细胞有明显的抑制作用，且随着紫杉醇的浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用增强，当药物浓度为0.1155μg/ml时，抑制率为29.82％，浓度增加到1.155μg/ml时，抑制率达到40.27％，当浓度增加到11.55μg/ml时，抑制率达到62.91％。4、液质联用仪进行定性检测，判断该菌株产生的紫杉烷类化合物为巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。这为扩大抗肿瘤范围、半合成新药，以避免抗药性等提供了更大的开发领域。5、利用本发明的植物内生菌发酵生产紫杉醇或类似物，可以不受资源、环境、条件、设备等的各种限制，短时间、大规模进行生产。附图说明图1为黑曲霉bp12±3的菌苔，菌株bp12±3的菌落颜色呈暗黑色，菌落反面颜色黄至黄褐色，菌落质地为丝绒状，有放射性沟纹。图2为黑曲霉bp12±3的显微镜照片图，分生孢子头呈疏松放射状，顶囊球形，直径50-80μm，小梗双层，梗基(4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直径3-4.5μm。图3为紫杉醇标准品的色谱图，箭头所示峰为紫杉醇标准品。图4为黑曲霉bp12±3的代谢抽提物中紫杉醇类似物的色谱图，箭头所示峰为紫杉醇类似物。具体实施方式实施例1：巴山榧树植物内生菌的分离1、巴山榧树材料的预处理于湖北省神农架国家地质森林公园采集巴山榧树的根、茎、叶、树皮，用无菌水冲洗后，用吸水纸吸干；分别经75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用无菌水冲洗；将采集到的根、茎和树皮切成大致约2-3cm的小段，叶片从中间切出剖面。2、巴山榧树植物内生菌的分离取预处理的各部位的材料置于pda固体培养基平皿，28℃培养，pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，水1000ml，ph自然，加琼脂(15g/l)为pda固体培养基。3、巴山榧树植物内生菌的纯化当平皿中接种物切面边缘长出细小菌丝时，挑取菌丝接入新配制pda固体平板上，在pda斜面培养基上纯化几次，直至得到纯培养物。实施例2：内生菌bp12±3抑菌活性检测1、将待测供试细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)用lb液体培养基活化后，分别涂布于lb固体培养基表面；2、切下实施例1获得的纯化植物内生菌琼脂培养基块，分别放置接种于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌平皿中，37℃培养1-2天，观察琼脂块周围的抑菌圈，通过上述方法，筛选获得一株同时具有抗金黄色葡萄球菌(g+)和大肠杆菌(g-)活性的菌株，记为bp12±3。实施例3：内生真菌bp12±3的鉴定经过平皿培养特性观察(图1)，该菌株菌落颜色呈暗黑色，菌落反面颜色黄至黄褐色，菌落质地为丝绒状，有放射性沟纹；显微镜下观察(图2)，其分生孢子头呈疏松放射状，顶囊球形，直径50-80μm，小梗双层，梗基(4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直径3-4.5μm。根据《中国真菌志第五卷曲霉属及其相关有性型》(齐祖同主编，中国真菌志(第五卷)曲霉属及其相关有性型[m].北京：科学出版社，1997，5～10.)可初步鉴定为黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3。实施例4：黑曲霉bp12±3发酵液中脂溶性物质提取1、将实施例2获得的植物内生菌黑曲霉bp12±3于pda液体培养基中活化(活化条件：28℃，180rpm，培养5-7天)，作为种子液；2、按照5％(v/v)的接种量接入pda液体培养基中，28℃，180rpm，培养7-10天；3、过滤收集滤液，滤液中加入1/3体积的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上层有机相；4、于旋转蒸发仪上35℃除去有机溶剂，用甲醇溶解粘在壁上的物质并挥发干燥，通过重量法测定发酵液粗取物含量；其中内生菌bp12±3发酵液粗取物含量平均约为120mg/l。实施例5：高效液相色谱(hplc)定量检测黑曲霉bp12±3含紫杉醇类似物代谢活性物质1、实施例4中获得的脂溶性物质及流动相处理：将实施例4获得的浓缩产物13200r/min离心2min，吸取上清液，经0.22μm孔径滤膜过滤除去杂质，然后同配好的流动相(甲醇/水＝65/35，v/v)一起超声波排气，时间分别为3min、10～15min；2、色谱条件为：色谱柱，ods(c18)柱4.6×250mm，5nm；柱温，常温；样品及流动相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；样品进样量，20μl；紫外检测波长，227nm；3、测得紫杉醇标准品(购自sigma)的rt(保留时间)为13～14min(图3)；4、在实施例4制得的脂溶性提取物中发现与紫杉醇标准品的rt(保留时间)相似的成分(图4)，出峰时间为12.8min，可将内生菌bp12±3代谢活性物质鉴定为紫杉醇类似物；5、使用hplc伍丰液相色谱工作站软件根据色谱图测算出bp12±3代谢抽提物中紫杉醇类似物的相对峰面积为29445.61，相对百分含量为10.5％。实施例6：黑曲霉bp12±3发酵液提取物对hela肿瘤细胞的抑制作用1、取对数生长期的hela细胞(华联科生物技术有限公司)铺板，将细胞按100μl/孔(1～5×103个细胞/孔)接种于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；2、将实施例4制备的含紫杉醇类似物的黑曲霉bp12±3发酵液提取物配置不同浓度(表1)，取10μl分别加入样品孔中(1～5×103个细胞/孔)，37℃，5％co2培养箱中培养24h；3、取出培养板，吸去上清，每孔加入90μl新鲜培养液(含有10％胎牛血清的dmem培养液)和cck-810μl，同样的条件下继续培养4h；4、用酶标仪在450nm处读取吸光值(a450值)，计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算：hela细胞抑制率(ir)＝(对照孔a值—样品孔a值)/对照孔a值×100％(表1)。通过上述实验，发现黑曲霉bp12±3发酵液粗取物对hela肿瘤细胞有明显的抑制作用，抑制作用与提取物浓度呈正相关关系；当药物浓度为0.1155μg/ml时，抑制率为29.82％，浓度增加到1.155μg/ml时，抑制率达到40.27％，当浓度增加到11.55μg/ml时，抑制率达到62.91％。表1黑曲霉bp12±3发酵液提取物对hela细胞的抑制作用实施例7：液质联用仪(hplc-ms)确定bp12±3发酵液中紫杉醇类似物为巴卡亭ⅲ1、液相色谱仪器型号：岛津lc-30auplc(1)样品及流动相处理：将实施例4制备的脂溶性浓缩产物13200r/min离心2min，吸取上清液，经0.22μm孔径滤膜过滤除去杂质，然后同配好的流动相(乙腈/水＝65/35，v/v)一起超声波排气，时间分别为3min、10～15min；(2)色谱条件为：色谱柱，ods(c18)柱4.6x250mm，5nm；柱温，常温；样品及流动相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；样品进样量，20μl；紫外检测波长，227nm；2、质谱仪器型号为absciex4500qqq(三重四级杆液质联用仪)利用液质联用仪对实施例4中提取的和实施例5中初步鉴定的紫杉醇类似物进行进一步结构鉴定(表2)，表明其母离子da为609.200，子离子da分别为549.200、367.000和427.100，源电压均为146，碰撞能分别为34、40和40，与紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ标准品完全一致。由此，可将内生菌bp12±3产生的紫杉醇类似物定性为巴卡亭ⅲ。表2巴卡亭ⅲ标准品及bp12±3紫杉醇类化合物质谱分析参数q1mass(da)q3mass(da)dpcedwell(msec)609.200549.2001463450609.200367.0001464050609.200427.1001464050实施例8：不同前体物质对黑曲霉bp12±3产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的影响1、配制苯甲酸钠、乙酸钠、l-苯丙氨酸3种前体溶液，在0.08mpa下灭菌20min；2、将黑曲霉bp12±3接种于pda液体培养基，28℃，180rpm，发酵培养至第5天，将3种前体分别加入发酵培养基中，其中一瓶不加任何前体做为对照，前体添加量分别为l-苯丙氨酸终浓度3.0mg/l，乙酸钠终浓度3.5g/l，苯甲酸钠终浓度32.0mg/l；3、每种发酵培养基中均补加蔗糖溶液，终浓度5.0g/l；4、培养至第8天，通过实施例4所述的方法提取黑曲霉bp12±3代谢粗产物并采用高效液相色谱(hplc)对代谢抽提物中紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ进行定性和定量检测，并计算紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ增长率，结果见表3。以l-苯丙氨酸为前体，巴卡亭ⅲ的产量增加最多，增长率为129.84％。结果表明，l-苯丙氨酸能够作为一种有效的前体物质，用于培养黑曲霉bp12±3并高效生产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ。表3不同前体对黑曲霉bp12±3产紫杉烷类化合物巴卡亭ⅲ的影响当前第1页12