本发明涉及一种高细胞选择性的环形抗菌肽OIR3及其制备方法和应用。
背景技术：
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)，又称抗微生物肽，是由细菌特定基因编码产生的一类小分子多肽，具有广谱抗菌性。抗菌肽最早是20世纪80年代从惜比古天蚕(Hyatophora cecropia)中发现的。抗菌肽主要生物学作用是其可杀灭包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在内的多种细菌，具有抗菌谱广，杀菌速度快的特点。除了抑制和杀死细菌外，还具有抗真菌、抗病毒、抑制或杀伤肿瘤细胞、杀灭引起疟疾、利什曼病等疾病的寄生虫、抗原虫等作用。抗菌肽通过物理渗透的方式作用于细菌细胞膜，使细胞膜出现孔状结构，导致菌体细胞内容物泄露，菌体细胞死亡。抗菌肽独特的抑菌机制使其成为医疗、食品、畜牧等领域抗生素有前景的替代物质。目前，上千种抗菌肽已经从各种动植物体中提取出来，但作为抗生素替代品的抗菌肽却很少。限制抗菌肽成为抗生素替代物的原因有以下两个方面：一方面是抗菌肽的毒性，比如对红细胞造成溶血，或对正常体细胞具有杀害作用，也就是细胞选择性低，那么，寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的方法势在必行。细胞选择性是抗菌肽对不同细胞的不同选择性作用，也就是对有害微生物有抑制或杀伤作用，而对正常细胞没有毒性作用。抗菌肽的治疗指数是评价其细胞选择性的关键性指标。抗菌肽的治疗指数越大，抗菌肽的细胞选择性就越高，说明该抗菌肽成为抗生素替代品的可行性越大。第二个方面是生产成本问题。目前对于抗菌肽的结构功能研究，主要通过化学合成的方法获得抗菌肽，氨基酸数目越多，合成成本越高，所以，细胞选择性高的抗菌小肽成为人们研究的热点。
短杆菌肽是由短芽孢杆菌中提取的一类物质的总称，如短杆菌肽A，短杆菌肽B，短杆菌肽C，短杆菌肽D，短杆菌肽S等。短杆菌肽S(Gramicidin S，GS)是Bacillus brevis分泌的由10个氨基酸组成的环状肽类抗生素(Val-Orn-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn-Leu-DPhe-Pro)。短杆菌肽的环状结构对其活性是非常重要的，线性化的GS的活性只有环状结构的十分之一。短杆菌肽S是环形抗菌肽，它具有以下特征：1)一个大的薄片状的柔性的环状结构；2)同时具有一个极性和非极性的表面；3)若干带正电荷的侧链基团伸出这个平面。
技术实现要素：
基于以上不足之处，本发明提供一种高细胞选择性的环形抗菌肽OIR3及其制备方法和应用，该抗菌活性较高而细胞毒性相对较低。
本发明所采用的技术如下：一种高细胞选择性的环形抗菌肽OIR3，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：如上所述的一种高细胞选择性的环形抗菌肽OIR3的制备方法包括如下步骤：
1)选用碱性带正电荷的精氨酸和脂肪族疏水性氨基酸以及芳香族脯氨酸，由肽键连接形成环形结构，根据环形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n，n＝3，设计获得环形抗菌肽OIR3；
2)采用固相化学合成法，然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成环形抗菌肽OIR3的制备。
如上所述的一种高细胞选择性的环形抗菌肽OIR3，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明在短杆菌肽S结构与功能研究基础上，根据环形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n(n＝1、2和3)，全新设计环形抗菌肽OIR1(Ile Arg Pro Ile Arg Pro)、OIR2(Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Pro)和OIR3(Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro)。精氨酸是带正电荷的碱性氨基酸，与细菌细胞膜发生静电吸引作用，脂肪族疏水性氨基酸异亮氨酸，可与细菌表明的磷脂发生疏水性作用，破坏细菌的磷脂膜，从而产生生物学活性。通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现OIR3不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌六种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，综合来看，OIR3是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽OIR3的质谱图。
具体实施方式
实施例1
环形抗菌肽OIR1的氨基酸序列为：
Ile Arg Pro Ile Arg Pro
1 5 6
环形抗菌肽OIR2的氨基酸序列为：
Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Pro
1 5 10
环形抗菌肽OIR3的氨基酸序列为：
Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro
1 5 10 14
根据环形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n(n＝1、2和3)设计得到抗菌肽OIR1、OIR2和OIR3。
实施例2
将上述两个抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
1)抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Pro+2cl2树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Pro+2cl2树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷DMF(二氯甲烷)溶液，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用DMF溶液洗涤沉淀，HBTU(六氟磷酸酯)，NMM(N-甲基吗琳),反应30分钟，真空干燥，得到多肽，再切割得到环好的粗品。
使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
表1抗菌肽的设计
实施例3
对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌和溶血活性试验进行比较检测；
抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
检测结果见表2。通过表2可以看出，OIR3对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较强的抑菌活性。
表2抗菌肽的抑菌和溶血活性
溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μl PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。
检测结果见表2。溶血浓度越大，表明溶血活性越小；通过表2可以看出，OIR1、OIR2和OIR3在检测范围内均没有溶血活性。
以上结果显示，随着IleArg基本单元的二元叠加，抗菌活性显著提高，溶血活没有变化。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的细胞选择性。由表2可以看出，OIR3具有较高的治疗指数，表明设计得到的OIR3抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。
<110> 东北农业大学
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile
1 5 10
Arg Ile Arg Pro
11 14