禽传染性支气管炎弱毒疫苗株、疫苗及其应用的制作方法

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本发明涉及疫苗领域，尤其涉及禽传染性支气管炎疫苗株、疫苗及其应用。

背景技术：

禽传染性支气管炎(InfectiousBronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus,IBV)引起的高传染性病毒性疾病。其高致病性、接触性传染和全球广泛分布的特征使其成为除新城疫和高致病性禽流感外被广泛研究的病毒学呼吸道疾病。禽传染性支气管炎病毒对于不同日龄的鸡只都有感染性，其对于不同组织的嗜性使得感染部位不局限于呼吸道，胃、肠道、肾脏和输卵管等部位都会发生病变(Cavanagh2007)。禽传染性支气管炎病毒(IBV)致病率高达100％，感染雏鸡的死亡率为25％-30％(Bande,2015)。感染雏鸡若与其他细菌性或病毒性病原一起发生混合或继发感染，会增加鸡只死亡率(Matthijs,2003)。从1931年首次发现至今(Schalk,1931)，禽传染性支气管炎的爆发在世界各国多有报道。20世纪90年代后至今，该病在国内频繁爆发，使得感染鸡群肉鸡质量下降，蛋鸡产蛋量下降，给我国养禽业带来极大的经济损失。

禽传染性支气管炎病毒属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)。该病毒为带囊膜，不分节段的单股正链RNA病毒。病毒粒子直径为80-120nm，囊膜表面均布着约20nm长的纤突。病毒基因组编码的主要结构蛋白为纤突蛋白(S,spike)、基质蛋白(M,matrix)、核衣壳蛋白(N,nucleocapsid)和囊膜蛋白(E,envelope)(Bande,2015)。S蛋白是高度糖基化跨膜蛋白，大小为150-200kDa。该蛋白在宿主细胞受体识别、抗体诱导、致病性和基因分型等方面起着关键作用(Bande,2015)。S蛋白基因转译后被裂解为S1(520aa)和S2(625aa)两个亚基。其中，S1蛋白识别并结合宿主细胞受体，S2蛋白通过构象变化，使病毒囊膜和宿主细胞膜融合，让病毒基因组进入宿主细胞中(Belouzard,2012)。S蛋白可以诱导机体产生相应抗体以及免疫反应，而在S1、S2两个糖蛋白亚基中，S1是主要免疫原性蛋白，具有多个抗原表位(Ignjatovic,1991；Ignjatovic,2005)。S1蛋白同样对受体结合以及细胞膜融合起着决定性作用(Belouzard,2012)。

传统血清学实验例如病毒中和实验(VN)发现禽传染性支气管炎病毒存在多种血清分型(OIE,2008)，其抗原多样性使得不同禽传染性支气管炎病毒毒株间不能产生有效的交叉保护(Farsang,2002；Ladman,2006)。因此，针对禽传染性支气管炎病毒不同的血清型，市场上存在各种不同的减毒活疫苗和灭活疫苗(Bijlenga,2004)。目前，减毒活疫苗是广泛用于禽传染性支气管炎防控的手段。减毒活疫苗一般选取抗原性良好的禽传染性支气管炎病毒毒株，比如MASS型M41或H52、H120等，是第一代应用在禽传染性支气管炎疫情防控的产品(Lee,2010)。灭活疫苗一般与减毒活疫苗组合使用，也可以单独使用。然而，研究发现，与减毒活疫苗相比，灭活疫苗单独使用时免疫时效较短(Ladman,2002)。此外，一些新型疫苗也用于禽传染支气管炎的防治，包括病毒载体疫苗，亚基和多肽疫苗以及质粒DNA疫苗，这些新型疫苗可以产生明显的体液以及细胞介导的免疫反应，以达到免疫保护效果(Bande,2015)。

研究发现，个体间遗传差异会影响免疫应答效力(Cavanagh,2007)。并且，禽传染性支气管炎病毒的S1蛋白氨基酸序列上2-3％的改变(10-15aa)就会导致血清型的改变，因而产生变异株并可能影响相近血清型间的交叉免疫保护(Cavanagh,1997)。因此，禽传染性支气管炎病毒的S1蛋白序列成为禽传染性支气管炎防控的研究热点。基于S1基因的序列分析，主要分布于世界各地的禽传染性支气管炎病毒也被分为经典株和变异株(Chang-Won Lee,2003)。其中，经典株M41和H120被广泛用作疫苗株(Sjaak de Wit,2011)。然而，世界动物卫生组织(OIE)提出，禽传染性支气管炎病毒血清型分布在疫苗的使用上存在地缘性影响。禽传染性支气管炎病毒其他变异株的分布一般限于特定区域，比如，病毒株M41、Arkansas和Connecticut在美国广泛分布，而病毒株4/91(793/B,CR88)和D274则主要存在于欧洲(Sjaak de Wit,2011；Bande,2015)。最近中国QX变异株在欧洲、亚洲、中东和非洲爆发的事实则说明了IBV在地理分布上的迁移和该QX基因型病毒的重要性，其分布的广泛性对禽传染性支气管炎的防控带来了极大的挑战(Jia,1995；Moreno,2016；Zhao,2016)。然而，禽传染性支气管炎病毒跨地域传播的可能性有待进一步确认(Ducatez,2009)。

对国内禽传染性支气管炎病毒的流行病学调查研究数据，发现我国在禽传染性支气管炎的防控有以下特点：1.在国内目前广泛流行的禽传染性支气管炎病毒毒株主要为QX基因型；2.目前国内对禽传染性支气管炎的防控一般使用Mass型疫苗株，如H120、H52、Ma5、M41。但是Mass型与国内流行的基因型进化关系较远，因此交叉保护较差；3.防控QX型禽传染性支气管炎病毒的商品化疫苗相对较少。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种禽传染性支气管炎弱毒疫苗株、疫苗及其应用。

一种禽传染性支气管炎弱毒疫苗株S，保藏编号为CCTCC NO：V201647。该弱毒疫苗株S属于禽传染性支气管炎病毒IBV-S，拉丁文学名：Infectious Bronchitis Virus。弱毒疫苗株S的保藏日为2016年9月16日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称为CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学。

一种禽传染性支气管炎疫苗组合物，包含弱毒疫苗株S和药学上可接受的佐剂或载体。

所述弱毒疫苗株S在制备禽传染性支气管炎疫苗中的应用。

所述弱毒疫苗株S在制备作为免疫原使用的蛋白质或多肽中的应用。

所述弱毒疫苗株S在制备作为用于检测血清中特异性抗体的蛋白质抗原中的应用。

一种禽传染性支气管炎弱毒疫苗株SU，保藏编号为CCTCC NO：V201648。该弱毒疫苗株SU属于禽传染性支气管炎病毒IBV-SU，拉丁文学名：Infectious Bronchitis Virus。弱毒疫苗株SU的保藏日为2016年9月16日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称为CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学。

一种禽传染性支气管炎疫苗组合物，包含弱毒疫苗株SU和药学上可接受的佐剂或载体。

所述弱毒疫苗株SU在制备禽传染性支气管炎疫苗中的应用。

所述弱毒疫苗株SU在制备作为免疫原使用的蛋白质或多肽中的应用。

所述弱毒疫苗株SU在制备作为用于检测血清中特异性抗体的蛋白质抗原中的应用。

发明人根据病料来源地、来源年份远近，选择可能出现弱毒株的部分病料重新进行病毒分离、动物回归实验及S1基因序列比对，得到一株QX基因型禽传染性支气管炎病毒天然弱毒疫苗株，命名为S(简称为S株)。S株可作为弱毒疫苗直接应用于预防家禽免于禽传染性支气管炎的感染及传播。S株对SPF鸡毒力较弱，感染鸡不出现发病及死亡症状，不易传播且排毒率低，安全性高；S株属于CHI分支，即QX基因型，可针对国内优势IBV种群进行免疫保护，有效性良好。

为进一步获得效果更好的弱毒疫苗株，使用极限稀释法对S株进行快速纯化及鸡胚适应，获取可预防QX基因型禽传染性支气管炎的弱毒疫苗株，命名为SU(简称为SU株)。本发明使用极限稀释传代法，在较少代次内筛选纯化出遗传单一且在鸡胚内能高滴度繁殖的SU株。对SU株进行了安全性试验、免疫效力试验，证明SU株对SPF鸡安全，免疫保护效果与市售LDT3、H120效果相近，具有作为安全疫苗候选株的可能。

附图说明

图1为S株感染鸡胚后病变图。

图2为N基因RT-PCR鉴定结果图。其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1为IBV部分N基因的扩增产物，泳道N为以水为模板的阴性对照，泳道P为以H120基因组为模板的阳性对照。

图3为M基因RT-PCR鉴定结果图。其中，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为IBV部分N基因的扩增产物，泳道N为以水为模板的阴性对照，泳道P为以H120基因组为模板的阳性对照。

图4为电镜下S株病毒粒子形态图。

图5为S1基因RT-PCR鉴定结果图。其中，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为S1基因RT-PCR扩增结果，泳道N为以水为模板的阴性对照，泳道P为以H120基因组为模板的阳性对照。

图6为阳性克隆菌液PCR结果图。其中，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～3为菌液PCR条带，泳道N为以水为模板的阴性对照。

图7为S株S1基因与34株参考株遗传进化分析结果图。

图8为S株全基因组序列的遗传进化分析结果图。

图9为SU株尿囊液内病毒粒子的Western Blot检测结果图。其中，泳道M为Marker，泳道N为接种PBS的鸡胚尿囊液，泳道P为含有H120的尿囊液，泳道1为传代过程中出现的阳性样品。

图10为电镜下SU株病毒粒子形态图。

图11为SU株与S株比对缺失示意图。

图12为3日龄SPF雏鸡免疫后第5天肾脏病理切片，200倍放大。其中，图12a为LDT3免疫组，图12b为SU免疫组，图12c为H120免疫组，图12d为未免疫组。

图13为亲本毒株SF攻毒5天后排毒率。

图14为异源毒株M41攻毒5天后排毒率。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1、S株的分离鉴定

(1)S株的分离培养

选择来自2009年湖北、2009年湖南、2009及2010年四川、2009年广东、2010年广西病鸡气管、支气管、肺、肾脏组织作为病料样品。处理后的病料匀浆上清经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚后连续盲传3代，得到含有IBV的尿囊液再接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵育约48h，提取尿囊液，得到分离毒株。

(2)IBV的鉴定

a)分离毒株经尿囊腔途径接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养6～7天后，未死亡鸡胚出现侏儒胚症状，结果如图1所示。

b)分离毒株经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚作为试验组，以水经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚作为对照组。37℃孵化10-12h后，同时经尿囊腔途径接种100×EID₅₀新城疫病毒(NDV)0.1ml/胚，继续孵化48h收毒并测定尿囊液的血凝效价(HA)。试验组鸡胚(IBV+NDV)的血凝价为1-5log2，对照组鸡胚(NDV)的血凝价为8-9log2，存在干扰作用，初步确定病料中含有禽传染性支气管炎病毒。

c)抽取盲传3代后鸡胚尿囊液中病毒RNA，使用针对禽传染性支气管炎病毒基因组M基因和N基因的保守区段设计的引物进行RT-PCR鉴定病毒。同时设立以水为模板的阴性对照组和以H120基因组为模板的阳性对照组。针对N基因保守区段设计的上游引物NpF的具体序列为CGGAGCAATAGCAAGAAAAGC，下游引物NpR的具体序列为GCAGCAACCCACACTATACCATC。针对M基因保守区段设计的上游引物MpF的具体序列为CCTAAGAACGGTTGGAAT，下游引物MpR的具体序列为TACTCTCTACACACACAC。

RT-PCR结果如图2和图3所示。由图2和图3可知，试验组(IBV)的N基因和M基因的条带大小分别约500bp和740bp，和目标片段大小一致，进一步证明分离毒株为禽传染性支气管炎病毒。

(3)病毒粒子形态

将步骤(1)提取的尿囊液浓缩，使用电镜观察病毒粒子形态(图4)，发现S株病毒形态多为椭圆形或球形，直径约100nm，有时呈多形性。病毒表面纤突均匀排列呈放射性。

(4)基于禽传染性支气管炎病毒S1基因序列的进化分析

针对S1基因两端外保守序列设计引物，上游引物S1F的具体序列为TTGAAAACTGAACAAAAGACCG，下游引物S1R的具体序列为TACAAAACCTGCCATAACTAACAT。

按Takara公司PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶说明书说明合成cDNA。PCR扩增参照KOD Plus Neo DNA聚合酶的说明书配成反应体系，94℃预变性1min；94℃30s，55℃30s，68℃54s，30个循环；68℃延伸5min；4℃终止。PCR扩增S1基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测得到约1.7kb的目的条带，条带大小与以H120基因组为模板的阳性对照一致(图5)。

PCR产物经HiPure PCR Pure Micro Kit(Magen)回收纯化后，按Takara公司的pMD19simple T Vector的说明书进行TA克隆，挑选阳性转化子(图6)进行测序。S1基因的核苷酸序列(不含UTR)如SEQ ID NO：1所示。将S1的全基因序列提交NCBI BLAST SERVER进行序列的同源性检索鉴定。BLAST结果显示，S株的S1基因与中国分离毒株的相似度达99％，与在四川分离的CK/CH/SC/MS11-4、以及在浙江分离的许多不同分离株极为相近，其次评分稍低的是来自安徽、江苏、广西、广东的分离株。

从GenBank数据库中选取34株中国及世界各地分离毒株及常用疫苗毒株的S1基因作为参考序列(表1)，与S株的S1基因进行序列比对。使用Clustalx、MEGA6.0分析软件系统发育分析，采用邻位相接法(Neighbor-Joining)构建进化树并用Bootstrap值来评估进化树的可靠性(图7)。结果显示，35株IBV S1基因序列分别聚类形成8簇，S株与国内典型QX型IBV聚类为CHI分支，与LDT3聚类于不同分支；国内常用疫苗株H120、H52、W93聚类为Mass基因型，与国内分离株聚类于不同大分支上，亲缘关系较远。

表1、Genbank 34株IBV参考序列

(5)S株全基因组克隆

参照GenBank中已公布的IBV全基因组序列，选用多个血清型中经典代表毒株进行序列比对分析，利用IBV基因组中保守度高的区段，设计得到10对用于扩增禽传染性支气管炎病毒基因的引物(表2)。

表2、基因组PCR扩增引物

病毒RNA提取、cDNA第一链合成以及PCR扩增方法如前所述。PCR扩增参数为：94℃1min；94℃30s，55-65℃30s，68℃延伸45s-1min，30个循环；68℃延伸5min；4℃终止。根据片段长度延伸时间不同，一般为1kb/30s。PCR产物回收纯化与连接、连接产物转化感受态细胞、阳性菌落的鉴定和测序方法如前所述。应用DNASTAR.Lasergene.v7.1分析软件对测序得到的S株的全长进行拼接整理，并将毒株的全基因序列提交NCBI BLAST SERVER进行序列同源性检索鉴定。

S株全基因序列比较分析的参考毒株均来自GenBank(表3)，应用Clustalx软件分别对1a、1b、S1、S2、3a、3b、E、M、5a、5b和N 11个基因进行多序列比对，应用MEGA6.0分析软件进行各个基因的系统发育分析，邻位相接法(Neighbor-Joining)构建进化树后用Bootstrap值来评估进化树的可靠性(表图7)。S株的1a和1b基因序列如SEQ ID NO：3-4所示，S株的S2、3a、3b、E、M、5a、5b和N基因序列分别如5-12所示。结果显示S株与国内分离株的亲缘关系非常近。而这些分离毒株的来源地多分布于四川、山东、黑龙江。S株的原始病料来源于四川，因此S株的进化与四川区域流行的IBV毒株存在紧密关系。

表3、全基因组分析Genebank代表毒株

实施例2、S株鸡胚半数感染量(EID₅₀)、致病力和安全性试验

(1)S株鸡胚半数感染量(EID₅₀)

将实施例1步骤(1)中的提取的尿囊液(病毒液)进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释梯度，通过尿囊腔接种方式无菌接种6枚SPF鸡胚，37℃孵育。每12h观察一次鸡胚，弃去24h内死亡的鸡胚，连续观察144-168h，死亡鸡胚马上放入4℃冷藏，观察结束后把所有鸡胚取出，死胚、侏儒胚、蜷曲胚都记为感染，记录各稀释度的感染胚数量，使用Reed-Muench方法计算病毒的EID50为10-5.5/ml。

(2)S株致病力

取5日龄SPF鸡组用S株通过点眼滴鼻攻毒作为试验组，10^5.0EID₅₀/羽，进行动物回归实验。使用疫苗株H120、LDT3点眼滴鼻攻毒作为阳性对照，10^3.5EID₅₀/羽。每日观察，计算感染、死亡率。在人工感染5天后采集咽拭子、肛拭子进行RT-PCR检测排毒情况。7天后将所有活鸡剖杀，检查气管、肺、肾脏病变情况(表4)。实验过程中，试验组鸡只未出现任何临床症状或一过性反应。鸡只采食，精神正常，说明S株对5日龄SPF鸡无明显致病力。与对照毒株相比，S株排毒率为50％，发病率死亡率为0，说明S株可能为禽传染性支气管炎病毒天然弱毒株。

表4、不同IBV致病力测定结果

(3)S株安全性

取5日龄SPF鸡用S株尿囊液点眼滴鼻攻毒，剂量为10^5.0EID₅₀。攻毒后每天观察鸡只发病情况。5天后，剖杀观察鸡只内脏病变情况，取肾脏、气管、肺研磨液4℃8000rpm离心3min，取上清液进行RT-PCR检测。如RT-PCR检查为阴性，将上清液接种至9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵育48h后无菌收集尿囊液再进行RT-PCR检测。使用含有IBV的内脏匀浆上清液或在鸡胚扩繁后的尿囊液继续进行复壮，对3-7日龄SPF鸡通过点眼滴鼻进行攻毒，重复以上操作10次。

取3周龄SPF鸡20只分3组。一组为阴性组，对鸡只进行PBS点眼滴鼻。另一组使用在鸡只上传代5次和10次的S株进行攻毒，攻毒剂量为10^5.0EID₅₀。攻毒后观察鸡只状态，攻毒后第3天，传代5次攻毒组(简记为S-5)10只鸡中只有1只出现声音沙哑的症状，第4天再出现一只有精神萎靡的症状，第5天出现1只死鸡，但所有鸡只剖检后无肉眼可见病变。传代10次攻毒组(简记为S-10)出现6只感染鸡只，排白色水样便且声音沙哑，第5天出现2只死鸡，死鸡剖检后发现肾脏有轻微肿大，活鸡则无明显变化。攻毒后第5天对所有鸡只进行拭子采集、内脏采集，检测感染率，记录攻毒后的感染、死亡情况(表5)，说明S株的毒力返强，但仍在安全范围内，适合作为弱毒疫苗使用。

表5、S株不同代次毒力测试

实施例3、SU株的分离鉴定

(1)极限稀释传代法

将S株尿囊液进行10倍梯度稀释，选取与其EID₅₀数量级相同的稀释梯度及比此稀释度高10倍、100倍的2个稀释度的稀释液接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵化48h后无菌收集尿囊液。4℃8000rpm速度离心15min后取上清进行Western Blot检测禽传染性支气管炎病毒(图9)。目的条带和以H120为阳性对照的条带大小一致，证明样品含有禽传染性支气管炎病毒。以含有唯一一个或两个出现阳性条带的最高稀释度内的阳性尿囊液的稀释度作为下次的第一个稀释度继续往下稀释10倍、100倍，重复上述鸡胚接种及尿囊液收集、Western Blot检测操作3-5代。

(2)SU疫苗候选株筛选

对原始毒株及极限稀释传代、普通传代法传代后得到的第3、第5代病毒进行S1测序比对。极限稀释传代法在短短传代第3次及第5次后，得到的毒株S1基因测序后发现，所挑取的10个克隆中与原代S株的S1基因序列比对均出现了2个能引起氨基酸改变的点突变(表6)。使用普通传代方法传代5次后的毒株，所挑取的10个克隆中与原代S株的S1基因序列比对，8个S1基因与亲本毒株S相同，其余2个于81位存在T→C的点突变，但该突变并未带来氨基酸的突变。选择极限稀释传代法第5代毒株命名为SU，拟作为疫苗候选株。

表6、SU株和S株的S1基因序列比较

(3)病毒粒子形态

将IBV尿囊液浓缩，使用电镜观察病毒粒子形态(图10)，发现SU株病毒形态多为椭圆形或球形，直径约100nm，有时呈多形性。病毒表面纤突均匀排列呈放射性。

(4)SU株的全基因组测序分析

SU株病毒基因组的提取、基因组cDNA的合成、S1基因的引物设计、S1基因的PCR扩增、S1基因的克隆与序列测定方法如上所述。

对SU株进行全基因组测序分析，再将其序列与亲本毒株S株进行比对(表7，图11)。和亲本毒株S株进行序列对比发现，1a、1b基因内出现的点突变较多，其余较重要的结构蛋白如S1、S2突变却较少，M基因核苷酸突变并未引入氨基酸替换，E、N基因未出现任何点突变。表7中双下划线标记指替换的氨基酸仍保持为极性氨基酸，波浪线标记指替换后氨基酸由非极性氨基酸替换为极性氨基酸，点画线标记指替换后极性氨基酸变为非极性氨基酸。SU由于核苷酸改变引起的氨基酸替换的次数是13次，而其中氨基酸极性改变的替换共7次，非极性替换为极性占2/7，极性替换为非极性占5/7，替换为非极性氨基酸的概率更高。SU株的S1基因序列如SEQ ID NO：2所示。SU株S1基因的两个点突变都引起了极性氨基酸替换为非极性氨基酸的改变，这个改变可能引起了S1蛋白二级结构的变化。除此之外，对S株、SU株全基因组进行完整比对，发现SU株在N基因终止密码子后的3’UTR出现了110bp的缺失(图11)。

表7、SU株和S株全基因组序列比较

实施例4、SU株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)、最佳免疫剂量、安全性实验和有效性实验

(1)SU株鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定

采用实施例2所述的EID₅₀测定方法，对SU株进行EID₅₀的测定，其EID₅₀为10^-7.37。

(2)SU株最佳免疫剂量的测定

取3日龄SPF鸡通过点眼滴鼻途径进行免疫，免疫21天后对鸡只进行采血，血清用于ELISA检测抗体水平，以血清内的抗体水平高低评估SU株对鸡只免疫系统的刺激，确定最佳免疫剂量为10^5.5EID₅₀。

(3)SU株安全性实验

取3日龄SPF鸡，第1-3组为SU免疫组，免疫剂量分别为10^3.5EID₅₀、10^4.5EID₅₀、10^5.5EID₅₀/羽，免疫途径为点眼滴鼻。设商业疫苗株LDT3、H120阳性对照组，免疫剂量为推荐使用一羽份剂量(10^3.5EID₅₀)。另设不进行免疫的阴性对照组。免疫3周内连续观察鸡只的精神、采食、饮水、排泄状况。所有SU免疫组与H120、LDT3免疫组均未出现任何IB临床症状，精神、采食、排泄物状态均与阴性对照组的无差别。免疫5天后取拭子进行RT-PCR检测排毒率(表8)，结果表明SU株排毒率低，证明SU株对SPF鸡的毒力可能比LDT3、H120要弱，直至使用10^5.5EID50的免疫剂量，鸡只才有接近100％的排毒率。

表8、3日龄SPF攻毒后排毒率

免疫5天后每组剖杀3只鸡并取气管、肺、肾进行病理切片制作(图12)，观察疫苗是否会对鸡只产生病理损伤。切片观察发现，SU组和H120疫苗免疫组别的气管、肺、肾与不作免疫操作的阴性对照组相比，均未出现明显的病理变化，但LDT3免疫组别的肾脏切片形态与未免疫组出现差别，肾小管结构松散、肾小管管型明显，肾脏可能出现了一定的损害。因此，SU株对鸡只的器官并无明显的损害，与常用的H120疫苗具有相近的安全性。

取1日龄SPF鸡，SU组免疫组免疫剂量分别为10^4.5EID₅₀、10^5.5EID₅₀、10^6.5EID₅₀/羽，每日观察鸡只情况(表9)。第3天观察到除对照组外，每组鸡都有排出水样粪便，但鸡的精神状态都较好，没有病症。第5天采拭子，鸡的叫声清亮，没有罗音、呼噜声、张口呼吸、甩头、或打喷嚏等，直至到第21天都没有出现死鸡。

(4)SU株有效性实验

取3日龄SPF鸡，用SU株通过点眼滴鼻途径进行剂量为10^5.5EID₅₀/羽的免疫。免疫21日后，所有组别使用相应攻毒毒株(亲本毒株SF或异源毒株M41)以10^5.0EID₅₀/羽的攻毒剂量点眼滴鼻攻毒，每日观察鸡只状态，并于攻毒后第5天取咽拭子、肛拭子进行RT-PCR检测，检测排毒率。同时设置LDT3、H120阳性对照组及阴性对照组。其中，亲本毒株SF是S株经常规传代方法传至第14带获得的毒力返强毒株。

对亲本毒株SF的攻毒保护(图13)。观察期，阴性对照组出现张口呼吸和精神萎靡的疑似IB临床症状，其他鸡只并未出现明显症状。攻毒5日后拭子排毒率显示，24日龄SPF鸡在SF株10^5.0EID₅₀/羽攻毒5天后，阴性对照组咽拭子和肛拭子排毒率达100％；SU免疫组咽拭子排毒率为81.25％，肛拭子排毒率为35％，对SF株有较好的免疫保护效果。

对异源毒株M41的交叉保护(图14)。观察期，阴性对照组出现甩头和精神萎靡的疑似IB临床症状，其余鸡只未表现明显症状。攻毒5日后SU免疫组别在咽拭子排毒率为40％，对异源毒株M41的保护效果较LDT3组好，但仍较H120组差。

另取1日龄SPF鸡，用SU株通过点眼滴鼻途径进行剂量为10^4.5EID₅₀/羽，10^5.5EID₅₀/羽和10^6.5EID₅₀/羽的免疫。第3天观察到除对照组外，每组鸡都有排出水样粪便，但鸡的精神状态都较好，没有病症。第5天采拭子，鸡的叫声清亮，没有罗音、呼噜声、张口呼吸、甩头、或打喷嚏等，直至到第21天都没有出现死鸡。免疫21日后，所有组别使用相应攻毒毒株SF以10^5.0EID₅₀/羽的攻毒剂量点眼滴鼻攻毒，每日观察鸡只状态，统计死亡率(表9)。同时设置H120阳性对照组及阴性对照组。

表9、1日龄SPF鸡攻毒后观察结果

本发明分离鉴定了一株禽传染性支气管炎弱毒毒株S和SU对S株的S1基因进行遗传进化分析，证实S株属于QX型禽传染性支气管炎病毒，可针对国内优势IBV种群进行免疫保护。对S株除两端UTR之外的基因组全长与GenBank上25株禽传染性支气管炎病毒参考毒进行比对分析，S株的进化受国内分离株影响较大，与Mass型疫苗株及国外分离株亲缘关系远，且S很可能为重组毒株。S株可作为天然弱毒疫苗直接应用于预防家禽免于禽传染性支气管炎的感染及传播，对SPF鸡毒力较弱，感染鸡不出现发病及死亡症状，不易传播且排毒率低。

使用极限稀释传代法，在较少代次内筛选纯化出遗传单一且在鸡胚内能高滴度繁殖的禽传染性支气管炎病毒毒株SU株。对SU株进行了安全性试验、免疫效力试验，证明SU株对SPF鸡安全，免疫保护效果与市售LDT3、H120效果相近，具有作为安全疫苗候选株的可能。

因此，可以通过常规方法将S株和SU株结合药学上可接受的佐剂或载体制成相应疫苗，该疫苗能够诱导靶动物产生针对QX型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答，预防该型鸡传染性支气管炎的发生。所述疫苗可以采用以下方法制备，如将S株或SU株作为生产用毒种，接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL，置于37℃，继续孵育；接种后48小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2-8℃冷却后，收获含毒鸡胚尿囊液，混合后与加入常用的冻干保护剂混匀，分装后进行冷冻真空干燥，即制成鸡传染性支气管炎活疫苗。此外，也可以将S株和SU株作为免疫原使用的蛋白质或多肽、作为检测血清中特异性抗体的蛋白质抗原。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 中山大学

<120> 禽传染性支气管炎弱毒疫苗株、疫苗及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus)

<400> 1

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<212> DNA

<213> 禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus)

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