鸡传染性支气管炎强毒株S1基因及其强毒株和应用的制作方法

本申请为2012年12月06日提交的申请号为201210519405.7，发明名称为“鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用”的中国发明专利申请的分案申请。

本发明属于禽类生物制药技术领域，涉及一种鸡传染性支气管炎强毒株s1基因、含有该强毒株s1基因的鸡传染性支气管炎强毒株及该强毒株在疫苗效力检验方面的应用。

背景技术：

鸡传染性支气管炎(avianinfectiousbronchitis，ib)是鸡的一种急性，高度接触传染性的病毒性疾病。我国从1953年开始有呼吸道病变型ib的发病报道，1982年在广东首次发现肾病变型ib，近年来全国各地均有ib的流行，其中多以肾病变型为主。自1995年以来我国江苏、山东、山西、安徽等省发生了一种以生长阻滞、极度消瘦、拉稀为主要症状，以腺胃肿大为主要病理特征的腺胃病变型ib。该病发病率为30％～50％，病死率达30％以上。患病鸡体重出现负增长，饲料报酬显著下降，给养禽业造成重大损失。

王玉东等于1997年对腺胃型传染性支气管炎做了如下报道：1996年9月以来在青岛及附近地区养鸡场25～70日龄育成鸡连续发生了一种以流泪、眼肿、伴有呼吸道症状，极度消瘦、拉稀、死亡为特征的传染病，主要剖检症状为：腺胃肿大如球状，腺胃壁增厚，腺胃粘膜出血溃疡，胰腺肿大出血。发病率可达100％，死亡率为3％～95％不等。不同品种鸡都有发病。研究表明，病原为冠状病毒，我们将该病暂定名为鸡腺胃型传染性支气管炎。

免疫接种是防治鸡传染性支气管炎病毒的最有效手段。目前，市场上已经有一些弱毒疫苗在临床上应用，也有一些新的毒株被分离。由于ibv血清型众多，且流行毒株与疫苗株相比在基因水平上存在较大变异，致使已有疫苗株不能够有效防制ib流行毒株攻击，ib的防制效果并不理想。例如，中国专利cn101514334a公开了一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用；中国专利cn102220287a公开了一种鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用；中国专利cn101100656a公开了一种鸡肾型传染性支气管炎hn99株病毒株。以上专利均涉及到一些新的鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，可用于制备活疫苗，但这些毒株均未表明可以对腺胃型鸡传染性支气管炎病毒有良好的保护作用。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种可以能够有效防制ib流行毒株攻击，对腺胃型传支具有较好保护力的疫苗。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因，该弱毒株s1基因编码的多肽能够刺激机体产生中和抗体。

本发明还进一步提供了一种含有该s1基因的弱毒株，该弱毒株可用于制备抗鸡传染性支气管炎疫苗组合物，能够有效防止腺胃型传支病毒的攻击，对腺胃型传染性支气管炎具有较好保护力。

本发明还提供了一种鸡传染性支气管炎弱毒株制得的亚单位疫苗。

特别地，本发明提供了一种由本发明的鸡传染性支气管炎弱毒株制得的鸡传染性支气管炎诊断药剂。

本发明还进一步提供了一种与本发明的鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因同源的鸡传染性支气管炎强毒株s1基因及含有该强毒株s1基因的鸡传染性支气管炎强毒株，该强毒株可用于抗传染性支气管炎疫苗或亚单位疫苗或疫苗组合物的效力检验。

为此，本发明提供了一种鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因，其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。

本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因是病毒在演化过程中最容易发生变异的基因，其编码的多肽能够刺激机体产生中和抗体，且其高变区主要位于s1基因内。通过对本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因序列进行分析，发现了鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因的序列总长度为1562bp。

在本发明的一个具体的实施例中，对鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因进行分离纯化。先从鸡传染性支气管炎弱毒株病毒液中提取核酸，并以此为模板，经反转录后，用特异性引物进行pcr扩增，之后用pcr产物纯化试剂盒回收目的片段，即获得纯化的鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因。

从genbank中下载ibvh52、h120和w93疫苗株s1基因序列，用dnastar软件与本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因序列进行多重比对，比对方法为：打开dnastar软件，选用megalign功能，在“file”中载入需比对序列，选择“align”中“byclustalvmethod”进行比对，选择“view”下的“sequencedistances”即可看到比对序列的核苷酸遗传距离(见图1)。通过比对发现本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因与常见的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株h52株、h120株和w93株s1基因的同源性分别为71.4％、71.6％和71.3％。

本发明还提供了一种含有本发明所述弱毒株s1基因的鸡传染性支气管炎弱毒株。该弱毒株可用于制备抗鸡传染性支气管炎疫苗组合物，能够有效防止腺胃型传支病毒的攻击，对腺胃型传染性支气管炎具有较好保护力。

本发明中所用术语“病毒疫苗株”是指用于制备疫苗的病毒株。

本发明中所用术语“s1蛋白”是指s1基因的表达产物。

所谓“基因的表达”是指细胞在生命过程中，把储存在dna序列中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。

本发明中，所用术语“腺胃型传染性支气管炎病毒，简称腺胃型传支”(avianinfectiousbronchitis，ib)是指本发明中所述传染性支气管炎病毒为腺胃型传染性支气管炎弱毒株，其具有如下特征：

(1)发病鸡腺胃肿大如球状，腺胃壁增厚，腺胃粘膜乳头出血溃疡；

(2)病毒分离物对ndvlasota株病毒的繁殖产生干扰；

(3)病毒分离物对1％鸡红细胞不产生凝集；

(4)特异性血清中和试验结果标明，病鸡的病毒分离物与yb160阳性血清呈阳性反应，而与ndvlasota株、ibdvb87株、aivh9n2株、eds76的阳性血清均呈阴性反应。

在本发明中，“鸡传染性支气管炎弱毒株”应该从广义上加以理解，其包括含有seqidno.1核苷酸序列的弱毒株s1基因或含有与seqidno.1的核苷酸序列的弱毒株s1基因的同源性在80％以上的核苷酸序列的s1基因的鸡传染性支气管炎弱毒株，优选含有与seqidno.1的核苷酸序列的弱毒株s1基因的同源性在90％以上的核苷酸序列的s1基因的鸡传染性支气管炎弱毒株，更为优选的是，含有与seqidno.1的核苷酸序列的弱毒株s1基因的同源性在95％～99％以上的核苷酸序列的s1基因的鸡传染性支气管炎弱毒株。

在本发明中所用术语“同源性”是指两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，blast软件(在美国国立生物技术信息中心(ncbi)的网址上可获得：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，或者见，例如，altschuls.f.etal，j.mol.biol.，215:403-410(1990)；stephenf.etal，nucleicacidsres.，25:3389-3402(1997))，clustalw2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得)。

在一个具体实施方式中，一种根据本发明所述的弱毒株，其中，所述弱毒株为鸡传染性支气管炎病毒yb160株(avianinfectiousvirusstrainyb160)，其保藏编号为:cctccno：v201235，保藏日期：2012年08月29日，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。

本发明还提供了一种含有本发明所述的鸡传染性支气管炎弱毒株的抗鸡传染性支气管炎疫苗组合物。

在一个优选实施例中，所述疫苗组合物包括传染性支气管炎病毒yb160株。

根据本发明，所述疫苗组合物还进一步含有冻干保护剂。所述冻干保护剂包括但不限于含有明胶和蔗糖。

在本发明的一个具体实施例中，所述疫苗组合物由传染性支气管炎病毒yb160株和冻干保护剂组成：取传染性支气管炎病毒yb160株的生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释10万倍，接种于9～10日龄spf(specificpathogenfree，无特定病原体)鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置于37℃条件下孵育。弃去24h死胚，鸡胚观察至72h，将30～72h的鸡胚气室向上，置于4℃条件下冷却4～24h。收获鸡胚尿囊液，将6～8个鸡胚尿囊液混合为一组，置于灭菌瓶中，在2～8℃条件下保存，同时做无菌检验，测得病毒含量应为10^7.0eid50/0.1ml。经无菌检验和病毒含量测定合格的鸡胚尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按1:1(v/v)配苗，冻干保护剂以8％(w/v)明胶、40％(w/v)蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40min，放4℃保存，72h内用完。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混匀后，即为疫苗组合物原液。将疫苗组合物原液进行无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。本发明所制备的鸡传染性支气管炎疫苗组合物每羽份中ibv为10^4.5eid50。

在本发明的一个优选实施例中，所述疫苗组合物还包括其他弱毒疫苗株。其中，所述其他弱毒疫苗株包括但不限于鸡新城疫病毒弱株和/或法氏囊弱毒株等诸如此类。优选所述其他弱毒疫苗株为鸡新城疫弱毒株。

本发明还提供了一种根据本发明所述的鸡传染性支气管炎弱毒株在预防和治疗鸡腺胃型支气管炎的应用。所述应用应该理解为在制备用于预防和治疗鸡腺胃型支气管炎的疫苗及其组合物中的应用。

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗实质上含有序列表中seqidno.3的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤：

(1)利用逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)方法克隆yb160株s1蛋白的编码基因；

(2)构建包含s1基因的重组转移质粒pfastyb160s1；

(3)构建重组杆状病毒racyb160s1；

(4)重组杆状病毒racyb160s1感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养；

(5)重组杆状病毒的鸡传染性支气管炎病毒重组s1基因表达鸡传染性支

气管炎病毒重组s1蛋白，收获和纯化鸡传染性支气管炎重组s1蛋白；

(6)利用鸡传染性支气管炎病毒重组s1蛋白，辅以佐剂，经乳化，制备

鸡传染性支气管炎病毒亚单位疫苗。

本发明另外还提供了一种与本发明所述弱毒株的s1基因同源的鸡传染性支气管炎强毒株s1基因，其核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示。

本发明还提供一种含有本发明所述强毒株s1基因的鸡传染性支气管炎强毒株，其特征在于：所述强毒株为鸡传染性支气管炎病毒ybx株(avianinfectiousvirusstrainybx)，其保藏编号为:cctccno：v201236，保藏日期：2012年08月29日，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。

本发明还进一步提供了一种根据本发明所述强毒株在抗传染性支气管炎疫苗或亚单位疫苗或疫苗组合物的效力检验中的应用。其采用传染性支气管炎病毒ybx株作为强毒株进行攻毒试验。

在本发明中，上述强毒株除用于抗传染性支气管炎疫苗或亚单位疫苗或疫苗组合物的效力检验外，其还是本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株及鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因的重要来源。本发明中鸡传染性支气管炎弱毒株是由本发明所述强毒株s1基因的鸡传染性支气管炎强毒株经传代致弱获得的。而鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因则是从本发明的鸡传染性支气管炎弱毒株经分离纯化获得的。

本发明还特别提供了一种由鸡传染性支气管炎弱毒株制得的鸡传染性支气管炎诊断药剂，其可用于鸡传染性支气管炎疫苗效力检验中抗体水平的测定。

根据本发明的鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因是病毒在演化过程中最容易发生变异的基因，其编码的多肽能够刺激机体产生中和抗体，且其高变区主要位于s1基因内。由含有该弱毒株s1基因的鸡传染性支气管炎弱毒株所制得的鸡传染性支气管炎疫苗组合物或亚单位疫苗均能够有效防治ib流行病毒的攻击，尤其对腺胃型传染性支气管炎具有较好保护力。

根据本发明的鸡传染性支气管炎弱毒株制得的鸡传染性支气管炎诊断药剂可用于鸡传染性支气管炎疫苗效力检验中抗体水平的测定。本发明的传染性支气管炎强毒株可用于抗传染性支气管炎疫苗或亚单位疫苗或疫苗组合物的效力检验。

附图说明

图1为实施例1中本发明鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因与ibv常见疫苗株h120、h52和w93株s1基因的核苷酸序列比对结果。

图2为实施例2中本发明传染性支气管炎病毒yb160株第f115、f125、f145、f160、f170代病毒液s1基因的核苷酸序列比对结果。

图3为实施例5中ibvs1基因的pcr扩增产物鉴定结果；图3中的附图标记的含义如下：1ibvs1基因扩增产物；2dnamarker2000。

菌种保藏

鸡传染性支气管炎病毒yb160株(avianinfectiousvirusstrainyb160)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年08月29日，保藏编号：cctccno：v201235。

鸡传染性支气管炎病毒ybx株(avianinfectiousvirusstrainybx)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年08月29日，保藏编号：cctccno：v201236。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：本发明鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株(ibv)的制备

ibv强毒株为鸡传染性支气管炎病毒ybx株

传染性支气管炎病毒株传代致弱，使用9～10日龄spf(specificpathogenfree，无特定病原体)鸡胚对株进行连续传代致弱，每代次通过尿囊腔接种3枚鸡胚，连续传至170代，进行致弱评价试验。将f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代毒株分别接种1日龄spf鸡，每只鸡滴鼻、口服、肌肉注射1ml，其中f145、f160和f170代毒接种的雏鸡，未发现发病和死亡，说明该毒株在f145、f160和f170代毒已经完全致弱，对鸡只具有较好的安全性。同时用本发明弱毒株免疫15日龄雏鸡，于免疫后15天，用同源强毒进行攻击，发现免疫组鸡只状态良好，无发病症状。而对照组发病明显，其在攻毒后约30％(6-7/20)鸡死亡。以上实验经过2次重复，得到一致的结果，说明致弱毒株具有良好的免疫保护性，选取f160代毒作为疫苗研制的候选毒株。

实施例2：本发明弱毒疫苗株鸡传染性支气管炎病毒yb160株的培育及其基因稳定性

1.材料与方法

1.1病毒株ybx传代致弱

使用9～10日龄spf鸡胚对ybx株进行连续传代致弱。每个代次毒通过尿囊腔接种3枚鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃孵育72h(弃去24h内死胚)，每日观察鸡胚两次，如果鸡胚在24～72h死亡，则置4℃保存。72h后将所有接胚取出置4℃，4～24h，观察记录鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液进行下一代传代。选择72h未死，但病变典型，尿囊液清亮的鸡胚进行传代。

1.2病毒滴度测定

取f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代次毒的鸡胚尿囊液，分别依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数(10⁴～10⁷或10⁵～10⁸)的病毒悬液分别接种5枚9～10日龄spf鸡胚，每枚鸡胚接种0.1ml，将鸡胚置37℃温箱中孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按reed-muench法计算eid50。

1.3无菌检验和支原体检验

将yb株f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代次毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.4外源病毒检验

将yb160株f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代次毒进行外源病毒检测。

1.5yb160株的致弱评价

180只1日龄spf鸡随机分为9组(每组20只)，分别将9组鸡饲养于9个负压隔离器中，雏鸡自由采食饮水。在15日龄时，1～8组雏鸡分别用鸡胚代次毒f30(10^6.5eid50)、f65(10^7.2eid50)、f90(10^7.5eid50)、f115(10^7.8eid50)、f125(10^8.0eid50)、f145(10^8.2eid50)、f160(10^8.3eid50)和f170(10^8.2eid50)进行接种，每只滴鼻0.1ml；第9组雏鸡作为对照组，每只滴鼻0.1ml正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察ibv靶器官、组织的病理变化并于接种后14日，使用同源强毒ybx进行攻击，每只点眼滴鼻0.1ml；攻毒后，每日观察、记录鸡群发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察靶器官、组织的病理变化。

1.6yb160株的免疫效力评价

1.6.115日龄的spf鸡免疫效力试验

40只1日龄spf鸡随机分为2组(每组20只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食饮水。15日龄时，其中一组雏鸡使用yb160株进行接种，每只滴鼻0.1ml；另一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻0.1ml正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，并于免疫后15天，对每组采集血清进行特异性抗体检测，具体方法参照传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒说明书进行；同时将2组雏鸡用同源强毒ybx进行滴鼻攻击，每只0.1ml；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况。

1.6.23日龄spf鸡免疫效力试验

方法同1.6.1，spf鸡为3日龄。

1.7yb160株基因稳定性试验

将f115、f125、f145、f160、f170株s1基因测序，比较其基因稳定性。

2结果

2.1yb160株的传代致弱

我们利用ibv－ybx强毒株在spf鸡胚上连续传代170代，培育出了一株毒力明显减弱，并且具有良好免疫原性的ibv弱毒株。试验证实ibv-yb160f160代毒力明显下降，以10^5.5eid50接种1日龄spf鸡5/5无不良反应。ibv-yb160f160代毒连续通过1日龄spf鸡体5代，未见毒力返强。以10³eid50免疫1日龄spf鸡，攻毒后10/10保护，对照10/10发病。

2.2病毒滴度测定结果

yb160株可高度适应鸡胚，f30代的eid50为10^6.5/0.1ml，传代后病毒滴度逐渐升高，f65～f125代≥10^7.0eid50/0.1ml，f145～f160代趋于稳定，滴度约为10^8.2eid50/0.1ml。

表1yb160株鸡胚传代毒滴度测定结果

2.3无菌检验和支原体检验

鸡胚传代过程中的f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代次毒经检验无细菌、霉菌和支原体污染。

2.4外源病毒检验

鸡胚传代过程中的f30、f65、f90、f115、f125、f145、f160和f170代次毒经检验无外源病毒污染。

2.5yb160株不同代次毒的致弱评价

yb160株在鸡胚上连续传代后对spf雏鸡的致病力逐渐减弱。结果见表2。

表2yb160不同代次毒对spf鸡的致病力

2.6yb160株免疫效力初步评价

2个不同日龄的免疫组(使用yb160株f160代进行免疫，10^5.0eid50)，在免疫后15天，采集鸡只血清样品，应用间接elisa试剂盒检测发现，接种过yb160株的血清样品全部转为ibv抗体阳性，而对照组血清样品均为阴性。使用同源强毒ybx对免疫组和对照组攻击后观察5天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症状；而对照组鸡发病明显，表现为精神沉郁、拱背、被毛粗乱、张口呼吸等症状，且在攻毒后约30％(6-7/20)死亡(见表3)。

表3yb160株的免疫效力评价

2.7yb160株基因稳定性：

f115、f125、f145、f160、f170株s1基因核苷酸序列同源性在97.5％以上(见图2)，说明其在传代过程中保持了基因序列的稳定。

实施例3：疫苗制备

2.1鸡传染性支气管炎活疫苗(yb160株)的制备

取yb160株毒种(保藏号为cctcc.v201235)，用灭菌生理盐水稀释10万倍，接种于9～10日龄spf鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。弃去24h死胚，鸡胚观察至72h，将30～72h的鸡胚气室向上，置4℃冷却4～24h。收获鸡胚尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2～8℃保存，同时做无菌检验，测得病毒含量为10^7.0eid50/0.1ml。经无菌检验和病毒含量测定合格的鸡胚尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按1:1(体积比)配苗，冻干保护剂以8％(w/w)明胶、40％(w/w)蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40min，放4℃保存，72h内用完。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。得到鸡传染性支气管炎疫苗每羽份中ibv病毒含量为10^4.5eid50。定批号为07012.2主动免疫试验

将1～3组3日龄spf雏鸡分别接种3批疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(即10^4.5eid50)。第4组3日龄spf雏鸡每只滴鼻接种1滴灭菌生理盐水。免疫后14天，4组鸡用滴鼻、点眼方法各接种1滴(约0.03ml)ybx强毒(10^6.0eid50)，同时肌肉注射1.5ml。观察14日，记录发病和死亡情况。

2.3被动免疫试验

将1～3组18周龄aa种鸡分别接种3批疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量即10^4.5eid5)。第4组18周龄aa种鸡每只滴鼻接种1滴灭菌生理盐水。免疫后14天后，每组随机取鸡胚100枚孵化，每组取孵化得小鸡60只分别于7天、9天和14天测定母源抗体并用滴鼻、点眼方法各接种1滴ybx强毒，同时肌肉注射1.5ml。观察14日，记录发病和死亡情况。

3结果

3.1主动免疫试验

各批疫苗免疫组免疫14日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，出现精神沉郁、羽毛松乱等临床症状，在观察期内死亡的鸡只解剖发现腺胃肿大的特异性病变。批号201113为辽宁益康生物股份有限公司的鸡传染性支气管炎活疫苗(w93株)，批号s111101为乾元浩公司的鸡传染性支气管炎活疫苗(h52)，详细结果见表4。

表4鸡传染性支气管炎活疫苗主动免疫效力试验数据

3.2被动免疫试验

yb160株传染性支气管炎疫苗免疫健康aa鸡所产鸡蛋孵化的雏鸡均能够在9天内获得保护作用，攻毒保护率在90％以上。抗体检测结果显示，虽然检测结果仍然保持阳性，但是母源抗体在持续感染过程中对强毒攻击的保护率在逐渐降低。这可能一方面与传染性支气管炎主要以上呼吸道局部免疫为主，另一方面在免疫类型方面以细胞免疫为主，以体液免疫为辅有关，检测结果与攻毒保护结果见表5。

表5鸡传染性支气管炎疫苗(yb160株)被动免疫试验结果

实验结果表明，主动免疫保护率为80％，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。

实施例4：新支(ndvlasota株+ibvyb160株)二联活苗的免疫效力实验

1材料

用法与用量：按瓶签标注羽份，用生理盐水稀释，用滴瓶吸取疫苗，每只鸡滴鼻1滴(约0.03ml)。

2方法

2.1新支(ndvlasota株+ibvyb160株)二联活苗的制备

ndv病毒液的制备：取lasota株毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4)，每胚尿囊腔内接种0.1m1。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每日照蛋1次，将在60小时前死亡的鸡胚弃去。60小时后，每4～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出。直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。收获鸡胚尿囊液，每若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置于灭菌瓶中。留样测定ha，ha<1：256者应弃去。同时作无菌检验，应无细菌生长。测得病毒含量应为108.0eid50/0.1ml。

ibv病毒液的制备：取本发明生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释10万倍，接种于10日龄spf鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1nl，接种后密封针孔，置37℃孵育。弃去24h死胚，鸡胚观察至72h，将30～72h的鸡胚气室向上，置4℃冷却4～24h。收获鸡胚尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2～8℃保存，同时做无菌检验，测得病毒含量应为10^7.0eid50/0.1ml。

新支(ndvlasota株+ibvyb160株)二联活苗的制备：经无菌检验和病毒含量测定合格的ndv和ibv鸡胚尿囊液，1:1(体积比)混合后，再与蔗糖明胶保护剂按1:1(体积比)配苗，冻干保护剂以8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40min，放4℃保存，72h内用完。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。本发明所制备新支二联苗中，鸡传染性支气管炎疫苗每羽份中ibv为10^4.5eid50，鸡新城疫病毒lasota株病毒含量为10^6.5eid50。定批号为0901。

批号为201118的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(lasota株+h120株)购自哈药集团生物疫苗有限公司，批号为110516的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(lasota株+h52株)购自广东大华农动物保健品股份有限公司。

2.2效力试验

2.2.1用鸡胚检验

将疫苗用生理盐水稀释至l羽份/0.5ml，分别装入两支试管中，每管lml。第一管加入等量的抗鸡新城疫病毒特异性血清，第二管加入等量的抗鸡传染性支气管炎病毒yb160株特异性血清。在室温中和1小时(中间摇1～2次)，此时病毒含量为0.1羽份/0.1ml。第一管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄spf鸡胚5个，每胚0.1ml，于37℃观察6日，根据接种后24～144小时死胚及6日时存活的鸡胚中出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病变胚的总和，计算eid50。第二管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各接种鸡胚5个，每胚0.1m1，48小时以前死亡的不计，48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同稀释度等量混合，至120小时取出活胚，逐个收获胚液，分别测定血凝价，血凝价≥1:128(微量法)判为感染，计算eid50。

2.2.2用鸡检验

(1)鸡新城疫部分

用30～60日龄的spf鸡10只，每只滴鼻接种l/100使用剂量，10～14日后，连同条件相同的未免疫对照鸡3只，各肌肉注射含10^5.0eld50的鸡新城疫北京株强毒lml，观察14日。

(2)鸡传染性支气管炎部分

用l～3日龄spf鸡10只，每只滴鼻1个使用剂量的疫苗，10～14日后，连同对照鸡10只，用ybx株强毒原液点眼、滴鼻各1滴，同时肌肉注射1.5ml，观察14日。

3结果

3.1鸡胚检查法

3批二联苗每批任抽1瓶分别用无菌生理盐水稀释至l羽份/0.5ml，分别装入两支试管中，每管lml。第一管加入等量的抗鸡新城疫病毒特异性血清，第二管加入等量的抗鸡传染性支气管炎病毒yb160株特异性血清。在室温中和1小时(中间摇1～2次)，此时病毒含量为0.1羽份/0.1ml。第一管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄spf鸡胚5个，每胚0.1ml，于37℃观察6日，根据接种后24～144小时死胚及6日时存活的鸡胚中出现失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病变胚的总和，计算eid50。第二管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各接种鸡胚5个，每胚0.1m1，48小时以前死亡的不计，48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同稀释度等量混合，至120小时取出活胚，逐个收获胚液，分别测定血凝价，血凝价≥1:128(微量法)判为感染，计算eid50。检验鸡新城疫部分每羽份病毒含量均≥10^6.5eid50，鸡传染性支气管炎部分每羽份病毒含量均≥10^4.0eid50。新支二联苗效力检验(鸡胚法)检验合格。结果见表6。

表6二联苗效力检验(鸡胚法)结果

3.2鸡检查法3批二联苗每批任抽1瓶分别用无菌生理盐水稀释。

(1)鸡新城疫部分

用30日龄的spf鸡10只，每只滴鼻接种l/100使用剂量，10～14日后，连同条件相同的未免疫对照鸡3只，各肌肉注射含104.0eld50的鸡新城疫北京株强毒lml，观察14日。检验鸡只中对照鸡3/3发病死亡，免疫鸡保护率均达到90％。

(2)鸡传染性支气管炎部分

用l日龄spf鸡10只，每只滴鼻1个使用剂量的疫苗，另15只同日龄spf鸡作为对照在同等条件下隔离饲养。14日后，连同对照鸡10只，用ybx株强毒原液点眼、滴鼻各1滴，同时肌肉注射1.5ml，观察14日。检验鸡只中攻毒对照鸡8/10发病，免疫鸡保护率均达到80％，正常对照鸡无任何里临床症状。新支二联苗效力检验(鸡检查法)检验合格，结果见表7、8。

表7二联苗效力检验(鸡检查法)新城疫部分结果

表8二联苗效力检验(鸡检查法)传支部分结果

实验结果表明，用本发明鸡传染性支气管炎yb160株制备的新支二联活疫苗免疫的鸡只，对ndv和ibv(ybx强毒)强毒攻击的护率均在80％以上，说明用本发明毒株制备的新支二联活疫苗对鸡新城疫和腺胃型鸡传染性支气管炎均有良好的保护效力。

实施例5：传支yb160株亚单位疫苗的制备及效力检验

1.材料与方法

1.1s1基因测序及pmdyb160s1重组质粒的构建

首先设计引物ibv-87(5‘-tattgattagagatgttggg-3’)和引物s1oligo3’(5‘-cataactaacataagggcaa-3’)，以保藏号为cctcc.v201235的ibv-yb160株的基因组rna为模板，通过rt-pcr扩增ibvs1基因，并将扩增的s1基因序列克隆入pmd-18t载体中，获得重组质粒pmdyb160s1。

1.2重组转座质粒的构建

将重组质粒pmdyb160s1和转移载体pfastbachta分别以bamhi和sali酶切后，回收s1基因片段和载体片段，用t4dnaligase连接后，转化大肠杆菌dh5a，涂布含有庆大霉素和氨苄青霉素的lb平板上培养，挑菌增菌培养后，提取质粒dna，通过电泳，初步筛选出分子量较高的质粒，然后对其进行单、双酶切鉴定，确定目的基因的插入及连接方向，获得重组转移质粒pfastyb160s1。

1.3重组杆状病毒racyb160s1的获得

将pfastyb160s1转化含有病毒穿梭质粒bacmid的大肠杆菌dh10bac感受态细胞(购自invitrogen公司)中，获得重组穿梭质粒rbacmidyb160s1；pcr筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒rbacmidyb160s1dna。采用reagent转染sf9细胞(购自invitrogen公司)，待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物m13f和m13r进行pcr验证目的重组s1基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为racyb160s1。扩增重组杆状病毒racyb160s1作为种毒，通过噬斑法进行效价滴定后于4℃保存备用。

1.4重组s1蛋白的表达与鉴定

将racyb160s1重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫highfivetm(购自invitrogen公司)。在含有200～350ml的expressfivesfm培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养highfivetm细胞，接种细胞密度为0.3～0.6×106个细胞/ml。当细胞密度达到1×10⁶个细胞/ml时，用重组病毒racyb160s1接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数(m.o.i)，分别是0.01、0.1、1.接种重组杆状病毒后，以26～28℃，转速为100rpm，培养4天。

接种后每12小时对各瓶取样，即48h、60h、72h、84h和96h取样。各样品以10000g离心20min，分离上清液和沉淀。上清液通过1um的滤膜进行过滤，过滤后进行sds-page电泳和紫外分光光度计测定上清液中的鸡传染性支气管炎病毒重组s1蛋白及其含量。

采用westernblotting鉴定表达的鸡传染性支气管炎病毒重组s1蛋白。分别收集重组病毒感染的highfivetm细胞，经3000r/min离心10min取上清，进行sds-page电泳。

1.5收获和纯化鸡传染性支气管炎病毒重组s1蛋白

将培养物经10000g离心20min，分离沉淀和上清液，上清液通过1um的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，超滤膜孔径为10000(切割分子量)，纯化后的样品溶液经7mm二乙烯亚胺(bei)灭活重组杆状病毒载体，36～48小时，加入等量的硫代硫酸钠中和。

1.6鸡传染性支气管炎亚单位疫苗的制备

准备不同浓度的抗原稀释物：将重组s1蛋白用pbs(ph7.4)稀释成0.5微克/毫升、1微克/毫升、2微克/毫升、4微克/毫升。

将上述不同浓度的抗原稀释物，与油佐剂isa206混合乳化。isa206佐剂经121℃、60min高压湿热灭菌，按照抗原：佐剂体积比例46:54混合。使用德国产ika2000/4型乳化机，先将佐剂加入乳化机佐剂料筒内，在搅拌状态下(100r/min)缓缓将抗原水相滴入佐剂中，滴完后，继续搅拌5min。用乳化机5000r/min，循环乳化4min，得到亚单位疫苗。

1.7ibv亚单位疫苗的效力检测

a.亚单位疫苗在spf鸡的免疫反应及抗体水平的检测

试验鸡为21日龄的无特异性病原(spf)鸡15只，免疫组10只，对照组5只，滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(h120株)1羽份，接种后21日，分别采血，各皮下或肌肉注射亚单位疫苗0.3ml。spf鸡在隔离器内饲养。注射后28天，再分别采血，分离血清，将两次血清分别测定hi抗体效价。二免血清hi抗体效价的几何平均值应不低于首免血清的4倍。

hi抗体检测方法：

(1)鸡传染性支气管炎hi抗原血凝价测定取96孔v型微量反应板1块，每孔加25μlpbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)，第1排加25μl抗原，并作2～4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25μlpbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)，最后再加入1％鸡红细胞悬液25μl，用微量振荡器混匀，2～8℃静置40分钟判定结果，以使100％红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。

(2)4ha抗原的配制根据测定的hi抗原ha效价，用pbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)配制4ha单位抗原。将配制好的4ha单位抗原用pbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。在每一稀释度的25μl抗原中加25μlpbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)，再加入1％鸡红细胞悬液25μl，混匀，2～8℃静置40分钟，判定结果。如果1:4稀释为100％红细胞凝集终点，表明配制的是4ha单位抗原；如果100％红细胞凝集终点是1:5，1:6，表明配制的4ha单位抗原实际上是高于4个单位；如果100％红细胞凝集终点是1:2，1:3，表明配制的4ha单位抗原实际上是低于4个单位。应根据检验结果作适当调整，使抗原工作液确定为4ha单位。

(3)血凝抑制试验(hi)

①取96孔v型微量反应板，每孔中加25μlpbs(0.01mol/l，ph值7.0～7.4)。

②分别吸取25μl待检血清，加至每块板的第1排各相应孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释。

③分别向各孔中加入4ha单位的抗原25μl，2～8℃静置30分钟。

④每孔中加入1％(v/v)鸡红细胞悬液25μl，轻轻混匀，2～8℃静置40分钟。

⑤结果判定将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。当阴性血清hi效价不高于1:8、阳性血清hi效价与规定效价相比误差不高于1:2时，试验方可成立。以完全抑制4ha单位抗原的血清最高稀释度作为hi效价。

b.亚单位疫苗免疫spf鸡后的ibv病毒攻毒试验

上述“a”项的免疫鸡和非免疫鸡，二免后28天，用ybx株强毒原液点眼、滴鼻各1滴，同时肌肉注射1.5ml，观察14日。

2结果

2.1重组质粒的构建与鉴定pcr产物大小约1700bp，结果见附图3，其中，第1孔为ibvs1扩增产物；第2孔为dnamarker2000。将pcr产物进行测序，由电泳及测序结果可知，重组载体pmdyb160s1含序列表中的seqidno.1序列。

2.2重组转座质粒的鉴定经酶切鉴定，s1基因的插入方向正确，酶切片段的大小与预期结果相符。

2.3包含鸡传染性支气管炎病毒s1基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含鸡传染性支气管炎病毒s1基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞(购自invitrogen公司)中，转染后24h开始有细胞出现死亡，此后细胞有继续增殖的趋势。72h后细胞开始出现病变，细胞核肿大，病变逐渐增多，96h后细胞开始死亡，1周后基本全部死亡。

2.4重组s1蛋白的表达及鉴定

在重组病毒感染细胞72h后上清中重组蛋白含量达到60微克/毫升。说明重组病毒感染细胞后，培养至少72h后回收培养上清，能够显著提高鸡传染性支气管炎病毒重组s1蛋白的产率。

sds-page蛋白质电泳凝胶观察到大小约为56kda的特异性条带，即为重组鸡传染性支气管炎病毒s1蛋白。将目的蛋白进行测序，由电泳及测序结果可知，重组鸡传染性支气管炎病毒s1蛋白序列含序列表中的seqidno.3序列。

2.5重组蛋白收获与纯化：通过紫外分光光度计对纯化蛋白进行含量测定，达到68微克/毫升。

2.6亚单位疫苗的检验：制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合规定。疫苗保存于4℃。

本发明方法生产的蛋白抗原还可以与其他的油性佐剂、水性佐剂或其他佐剂混合使用，如本领域常见的白油佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂等。

2.7亚单位疫苗的效力检验结果

亚单位疫苗免疫后抗体检测结果见表9，由此表结果可知，二免后血清hi抗体效价的几何平均值均不低于首免血清的4倍。

表9用亚单位疫苗免疫的spf鸡体内产生抗ibvhi抗体检测结果

亚单位疫苗的攻毒保护试验中，检验鸡只中攻毒对照鸡5/5发病，免疫鸡保护率均达到90％，正常对照鸡无任何临床症状，具体结果见表10。

表10用亚单位疫苗免疫spf鸡后的ibv病毒攻毒试验结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>普莱柯生物工程股份有限公司

<120>鸡传染性支气管炎强毒株s1基因及其强毒株和应用

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