一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及基因诊断遗传性疾病领域，具体的说是一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

白内障是由于先天性或后天性因素导致的晶状体混浊，其中先天性白内障在世界范围内的患病率为0.0l％~0.06％，我国约为0.05％。预防先天性白内障引起的视力损害是世界卫生组织（WHO）国际项目“2020年消灭可避免失明”的一个重要组成部分。

先天性白内障表现明显的临床异质性，按临床表型可分全白内障、膜性白内障、核性白内障、绕核性白内障、前极白内障、后极白内障、缝状白内障、点状白内障、盘状白内障，珊瑚型等，其发病机制复杂，涉及遗传、代谢性疾病、宫内感染及自发性等因素，其中约有30％-50％与遗传有关，统称为遗传性白内障。遗传性白内障的遗传方式包括常染色体显性、常染色体隐性和性染色体连锁遗传等，其中以常染色体显性遗传为主。据统计我国家族性白内障患者中，常染色体显性遗传的白内障占家族性白内障总数的73%。

晶状体的发育是一个非常复杂的过程，涉及许多基因，这些基因任何一个发生突变后都可能导致晶状体混浊，也就是我们所说的白内障。通过研究遗传性白内障去认识在细胞层次发挥不同功能的基因(蛋白质)，是人类认识该类基因乃至其基因家族最为有效的途径。所以从科学理论研究来说，遗传性白内障对于阐明人类基因功能是一个很好的遗传性模式疾病。

为了寻找引起白内障的致病基因，常采用的分子遗传学研究方法包括功能克隆(如候选基因筛选和蛋白质分析)、位置克隆、定位候选基因克隆(如基于家系的连锁分析和等位基因共享分析)等。迄今为止，已明确30个基因与单纯遗传性白内障相关，统称为遗传性白内障致病基因，其大致可归为四大类：晶体蛋白基因(CRYAA、CRYAB、CRYBAI/A3、CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGB、CRYGC、CRYGD、CRYGS)、细胞骨架或膜蛋白基因(GJA3、GJA8、MIP、LIM2、BFSP1、BFSP2、EPHA2、TMEM114、CHMP4B、VIM)、转录因子调控基因(HSF4、PITX3)和其他相关基因(GCNT2、FOXE3、WFS1、UNC45B、TDRD7、FYCO1)等。

遗传性先天性白内障具有高度的遗传异质性和临床异质性，即不同的基因突变可导致相同表型的白内障，不同表型的白内障可由相同的基因突变造成。由于遗传性白内障致病基因众多，且基因型与表型之间不存在一定的相关性，使其临床基因检测颇具挑战性。

随着生物技术的高速发展，特别是外显子组测序及全基因组测序等，为遗传性疾病致病基因突变的筛查和发现提供了快捷的手段，但费用相对昂贵。因此，该类技术常常应用于排除已知致病基因之后，以降低实验的成本风险，否则性价比太高。目标序列捕获测序技术可实现高通量众多已知致病基因突变筛查，具有快捷、高效等优势，但费用较高。从科学严谨性来说，以上新技术筛查到可疑致病基因突变最后仍需金标DNA测序Sanger法进一步验证。因此，在精准医学时代，建立快速、经济又高效的遗传性白内障致病基因检测体系不仅有助于尽快排查白内障家系的已知致病基因，发现新的突变位点，同时又可为发现新的致病基因提供可靠的家系材料及其后继研究方法决策的制定。在临床应用上，可开发成相应的白内障基因诊断试剂盒，为有白内障家族史者提供科学的遗传咨询与产前基因诊断。

目前，就我们所知，遗传性白内障致病基因的研究主要限于科研，尚未见临床上有遗传性白内障致病基因检测产品；而检索到与白内障致病基因筛查有关的专利则仅针对单个遗传性白内障致病基因突变检测方法或试剂盒，未见有针对多个遗传性白内障致病基因突变检测试剂盒的发明专利申请。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、经济又高效的白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的理论依据是遗传性白内障存在高频致病基因或突变热点区域，具体获得白内障致病基因高频突变谱的操作步骤如下：首先，检索自1997年发现第一个人类遗传性白内障致病基因CRYBB2以来至2014年7月国内外报道与遗传性白内障致病基因及其突变的相关文献211篇，统计299个家系或先证者，涉及30个相关致病基因，分布于16条染色体(chr.1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 21, 22)，鉴定221个单一突变(Uni-mutation)，分布于72个外显子，占基因总外显子数的34.6%(72/205)；随后，分析致病基因的发生频谱，结果显示90.97%的病例数与16个致病基因的突变有关，其发生频谱由高到低依次为GJA8 和CRYGD (11.04%)，GJA3和 CRYAA(10.03%)，CRYBB2(7.69%)，CRYBA1(6.35%)，MIP(5.02%)， EPHA2, CRYGC, CRYAB和HSF4(4.01%), FYCO1(3.34%), CRYBB1(3.01%), BFSP2(2.68%)， GCNT2和PITX3 (2.34%)；其中FYCO1和GCNT2仅涉及常染色体隐性遗传；最后，进一步分析致病基因各外显子发生突变频率，结果显示57.19%的突变位于8个基因的11个外显子上，65.22%的突变位于12个基因的15个外显子上，70.23%的突变位于13个基因的18个外显子上，80.27%的突变位于18个基因的26个外显子上。统计分析结果直观图见附图1，且本发明将此18个基因的26个外显子定义为白内障致病基因高频突变外显子。

本发明提供的白内障致病基因检测试剂盒，该基因检测试剂盒主要检测上述定义的白内障致病基因高频突变外显子的蛋白编码区及其剪切位点连接区，即白内障致病基因高频突变区域，就可以检出80%的遗传性白内障家系的致病基因突变。

本发明提供的白内障致病基因检测试剂盒，该基因检测试剂盒包括27对PCR引物，是根据上述白内障致病基因高频或热点突变区域的DNA序列，采用Primer和Generunner等生物学软件设计和人工合成；27对PCR引物的具体信息见表1。

表1. 本发明提供的26对引物信息及其PCR条件

本发明提供的白内障致病基因检测试剂盒组成部件如下表2：

表2白内障致病基因检测试剂盒组成

本发明提供的试剂盒用于白内障致病基因检测方法，该方法主要包括三部分内容：

1）应用本发明的白内障致病基因检测试剂盒进行PCR扩增目标基因的DNA片段；2）PCR产物的DNA测序分析，发现变异位点；

3）鉴定目标基因变异位点是否为致病性突变位点。

所述试剂盒的白内障致病基因检测方法，具体操作步骤如下：

1）按下表3配制PCR反应液（50μl），混匀置于PCR仪上；

表3 PCR反应体系（100μl）组成

2）按下列条件进行PCR扩增反应：

94℃/4min 预变性；94℃/30sec, 57℃-61℃(退火温度依据不同PCR引物而异，具体参考附表1)/30sec,72℃/1min，30个循环； 72℃/4min；4℃保存。

3）PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定：取9ulPCR产物，加入1ul的10×上样缓冲液，于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统下检测PCR产物的特异性及其大小是否与预期相符。

4）PCR产物的DNA测序分析，发现变异位点：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后采用ABI3730XL 自动DNA测序仪进行DNA测序，测序结果与正常DNA序列Blast比对分析，筛查变异位点。

5）鉴定致病性突变位点：如果变异位点为已知致病基因突变位点，即确定其为致病性突变；如果变异位点为新变异位点，则通过SNP排除、疾病表型与变异位点共分离、蛋白序列同源性比较、以及应用一些生物学蛋白变异功能预测软件分析，包括PolyPhen2 (Polymorphism Phenotyping v2)和SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)对编码区新发的错义突变进行功能预测，以及HSF (Human Splicing Finder) 对于内含子上剪接点的改变进行预测。

除本发明提供的基因检测试剂盒外，根据本发明提供的白内障致病基因高频突变区域，应用现有的生物学技术，如DNA芯片技术和目标序列捕获二代测序技术，可简单开发相关的白内障致病基因检测试剂和方法。因此本发明提供的白内障致病基因高频突变区域亦适合上述技术，但不限于上述技术。

本发明还提供了16个白内障致病基因新突变位点，见表5和附图2。 根据本发明提供的新突变位点，应用现有技术，如基于PCR扩增技术的DNA测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP) 分析、单链构象多态性检测（SSCP）、等位基因特异PCR、实时定量PCR以及高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析等，可简易针对本发明提供的新突变位点信息开发相应的快捷检测试剂和方法。因此本发明提供的16个白内障致病基因高新突变亦适合上述技术，但不限于上述技术。

为说明本发明所具有的优点和有益效果，先列举一些相关的现有技术情况：Hansen L等对28个丹麦白内障家系采用PCR扩增17个白内障致病基因的所有外显子，DNA测序结果显示其检出率为71% (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009，50, 3291-3303)；Sun W等在25个中国人白内障家系采用PCR扩增12个白内障致病基因的所有外显子，DNA测序结果显示其检出率为40% (Mol Vis. 2011，17, 2197-2206)；Ponnam SP等在40个印度白内障家系采用SSCP（single strand conformation polymorphism）技术筛查10个白内障致病基因的所有外显子，其检出率仅10%(Mol Vis. 19, 1141-1148 2013)；Sun W等采用外显子组测序技术筛查18个中国人白内障家系，其检出率67.6%（PLoS One. 2014，9, e100455)；Ma AS等采用目标序列捕获二代测序技术在46个先天性白内障家系中筛查32个白内障致病基因，其检出率70%（Hum Mutat. 2016，37, 371-384)。

与现有技术相比，本发明所具有的优点和有益效果是：

由于本发明基于白内障致病基因突变热点区域建立白内障致病基因检测体系，仅通过筛查18个白内障致病基因的26个外显子，就可检测80%的遗传性白内障家系的致病基因突变。故本发明在不降低检出率的基础上可明显降低白内障致病基因检测的工作量和成本等，具有快速、经济和高效等优势。

在基础研究方面，用本发明提供的白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法可实现快速排查白内障家系的已知致病基因，发现新的突变位点，扩充白内障致病基因突变谱，又可为筛查新的白内障致病基因提供可靠而宝贵的遗传资源；在临床应用上，用本发明提供的试剂盒及其方法体系进行白内障致病基因检测，可为白内障家族史提供科学的遗传咨询和产前诊断。

附图说明

图1 白内障致病基因高频突变区域的选择：黑色点表示该研究选择热点突变区域，包括了18个基因上的26个外显子，这些区域覆盖了文献报道的80.27%白内障家系致病基因突变；点的大小与该外显子突变的频率有关，突变频率越高，点的直径越大。；可期望36.11%（26/72）的外显子区域可以覆盖约80%以上的突变。

图2：白内障致病基因新突变位点的DNA测序图。

具体实施方式

实施例1：白内障致病基因高频突变谱

为了获得白内障致病基因高频突变谱，即致病基因及其外显子突变热点区域，我们检索PubMed收录人类单纯遗传性白内障致病基因及其突变的相关文献210篇(自1997年发现第一个人类遗传性白内障致病基因CRYBB2以来至2014年7月)，共报道了299个家系或先证者，涉及30个相关致病基因，分布于16条染色体(chr.1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 21, 22)，鉴定了221个单一突变(Uni-mutation)，分布于72个外显子，占基因总外显子数的34.6%(72/208)。以家系或先证者为单位，统计30个白内障致病基因上的所有突变；然后，按照外显子突变进行汇总频率统计，由高到底进行排序，绘制白内障致病基因高频突变谱，结果详见附图1；最后，本发明选择分布于18个基因的26个外显子作为突变热点区域（详见表1），进行后继的白内障致病基因检测分析。

实施例2：白内障致病基因检测方法

根据实施例1选择的白内障致病基因突变热点区域，采用Primer、Generunner等生物学软件设计和合成相应的PCR引物；以先证者gDNA为模板，PCR扩增相应蛋白编码区和剪切接合区的DNA片段，PCR引物和PCR条件见表1。PCR产物纯化后，用ABI 3730XL 全自动测序仪(Automated Sequencer PE Biosystems, Foster City, CA)进行DNA直接测序。

通过DNA序列比对，分析筛查致病基因变异位点。如果变异位点为已知突变位点，即确定其为致病性突变；如果变异位点为新的，则通过SNP排除、疾病表型与变异位点共分离、蛋白序列同源性比较、以及应用一些生物学蛋白变异功能预测软件分析，包括PolyPhen2 (Polymorphism Phenotyping v2)和SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)对编码区新发的错义突变进行功能预测，以及HSF (Human Splicing Finder) 对于内含子上剪接点的改变进行预测。

对于筛查到的新发突变，在突变基因的上下游分别选择2-3个含高信息STR微卫星标记，PCR扩增微卫星位点DNA区域，扩增产物在ABI3730自动测序仪上用毛细管凝胶电泳进行分离，DNA片段大小用GeneMarker2.4.0软件进行分析，用Cyrillic 2.1 软件画家系图，并构建单体型，进一步确证新致病基因突变位点。

实施例3：遗传性白内障家系或散发病例血样标本收集及基因组DNA的分离、纯化

为验证是否存在白内障致病基因高频突变谱和发现新的致病基因突变，本发明收集了43个白内障先证者（31个来自常染色体显性遗传家系，8个来自无家族史家系和4个散发病例）及其234个家系成员的血样标本；另外，收集112份正常人血样标本作为对照。按Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Beijing, China)试剂盒说明操作从全血样中提取和纯化基因组DNA（gDNA）。

实施例4：白内障致病基因检测试剂盒的应用

以实施例3的基因组DNA为对象，应用实施例2建立的白内障致病基因检测方法。结果发现7个已知突变位点（表4）和16个新突变位点（表-5和附图-2）。统计分析结果显示：60.5% (26/43)的先证者/家系中检出致病性的突变，低于文献报道的检出率80.27% (240/299，X2=7.99，p=0.005)。而对于常染色体显性遗传家系来说，检出率为80%(24/30)，与基于文献报道的检出率83.57%(234/280)无统计学差异(X2=0.489, p=0.484)。对于无家族史家系和散发病例，检出率仅为16.67% (2/12)。 故本发明提供的试剂盒及其检测方法特别适合常染色体显性遗传白内障家系致病基因的检测。

表4.在10个先天性白内障家系中鉴定7个已知致病基因突变位点

表5 在先天性白内障家系中鉴定16个白内障致病基因新突变位点

备注: D= damaging; PD = probably damaging; MPA = mostprobably affecting splicing

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建医科大学

<120> 一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法

<130> 54

<160> 54

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttggaaagga gaggtacccc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagaggccac agacaacatg a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttccggatcc tgcctctgta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctttcatct tgccctacgt a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccatcccagt accatccag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctgcttgag cttcttcca 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acggtggact gcttcatctc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctatctgct ggtgggaagt g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaacacgaa aatgcccttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcttgaaac catccagtga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttcttcatg agctcacgcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgacggagca agaccagagt 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctgaccccag tacagtacag t 21

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

catttctctc tcgctgtcac tctctc 26

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actctgggca aatgaacacc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcccctatcc ccactctatg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caggctcagg tccagagaag 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggaagcaaa ggaagacaga 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gttgtcatgg catttggtct c 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cttgataatt tgggcctgcc 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cctgtcaact cattcctcaa ctc 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cacctggtgg agaaaaatca a 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctcaccaag ctggactgc 19

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gccaggaaca cacagaaaat att 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgcagcaacc acagtaatct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cccaccccat tcacttctta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggacccaaga gtgagcatga 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccctcctcct ctttgctcat 20

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cccgggaagc caggttatca gaagt 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttgagactg ctggggtaac ctgac 25

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agctctcttg ccctacaggt cccc 24

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctaagtgctc agctgtgtgc gtctc 25

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gccacctcat ctcgtttatt g 21

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gggagcaagc cagtcaaaa 19

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agctgggcat ccaggttt 18

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cctgcaccca cagtacattc t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgcataaaat ccccttaccg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cctccctgta acccacattg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tgggtgcact gggaagaga 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gaagccagag gtcagcagag 20

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ccagacaggg catcagt 17

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tggtacagca gccaacac 18

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcacagagca ggaagggata 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgaggaagtc acatcccagt 20

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccttcagcat cctttgggtt ctct 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gcagttctaa aagcttcatc agtc 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gaaaccatca atagcgtcta aatg 24

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tgaaaagcgg gtaggctaaa 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gactgtccac ccagacaagg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tcagggagtc agggcaatag 20

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tgaaggagca ctgttaggag atg 23

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

agagggatag ggcagagttg att 23

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

aacccctgac atcaccattc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

aaggactctc ccgtcctagc 20