专利名称：重组水蛭素在防治糖尿病性白内障中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域或蛋白质多肽药物领域，涉及采用水蛭素在防治糖尿病性白内障中的应用。
背景技术：
糖尿病严重危害人类的身体健康，而糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)则是一种主要的糖尿病并发症和致盲性眼病。随着生活水平不断提高和人口老年化，全球糖尿病患者日渐增多，糖尿病性白内障患者人数也随之剧增，据统计我国II型糖尿病患者中白内障发病率高达62. 37%。虽然白内障可以通过手术加以摘除，但手术后常会引发晶状体后囊膜浑浊(后发性白内障)等并发症。更值得注意的是，糖尿病患者白内障往往不适合这种手术治疗，因为许多患者手术治疗后这种晶状体后囊膜浑浊(后发性白内障)等并发症会尤为严重。因此，糖尿病性白内障的药物治疗一直受到医疗专家们的关注，尤其是在白内障发病的初期， 医生们都倾向于首选药物治疗，以缓解症状控制病情发展。因此，寻找有效的糖尿病性白内障防治药物具有重要的实际应用价值。水蛭素是一种天然抗凝的蛋白质多肽，由65 66个氨基酸组成，其分子如蝌蚪状。水蛭素分子由2个结构域组成，它们分别与凝血酶分子表面两个不同的表面位点作用。其N-端结构域是一个由氨基酸1-47形成的球状致密的核心结构，它与凝血酶的活性位点(active site)结合，抑制其催化活力；而其带负电荷的羧基末端结构域氨基酸 (49-65/66)则与凝血酶的阴离子结合外侧位点(anion binding exosite，或称纤维蛋白原识别位点)结合，从而抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用。在这两个结构域之间存在一指状结构(finger like structure)从复合物中突出向外延伸，不与凝血酶接触。这一指状结构系水蛭素氨基酸残基27-31和36-40形成一反向平行β -折叠(antiparallel β -sheet)链，指端由氨基酸残基32-35形成柔性β -转角，研究表明该指状结构并不参与凝血酶的抑制作用，属于非功能必需区。水蛭素是目前发现的最强有力的凝血酶抑制剂，它能有效地抑制动脉、静脉血栓的形成及弥散性血管内凝血(DIC)，在心脑血管血栓性疾病防治疗方面具有极高的药用价值。由于水蛭素对游离的凝血酶和结合在血栓上的凝血酶都可以起到抑制作用(肝素只能作用于游离的凝血酶)，同时没有肝素过敏引起的血小板减少副作用，因此水蛭素的作用效果要优于肝素。此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具有巨大的潜在临床应用价值。吴梧桐等(中国发明专利，专利号03132224.7)药理试验证明重组水蛭素对 D-半乳糖及亚硒酸钠诱导的动物白内障体内和体外模型均具有显著的防治效果，但未见到实验证明重组水蛭素对链脲佐菌素(str印tozotocin，STZ)诱导的糖尿病性白内障模型的防治效果。
发明内容
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，尤其是在防治糖尿病性白内障中的应用。一、实验材料1.受试药品重组水蛭素(III)滴眼液，为无色透明液体，其配制方法见中国发明专利(专利号03132224. 7)。用水蛭素滴眼剂基质分别配成2000U/ml、1000U/ml和500U/ ml，于4°C冰箱冷藏。2.阳性对照药品吡诺克辛钠滴眼液(白内停)，武汉远大制药集团股份有限公司产品(批号101015)，规格每片含吡诺克辛钠0. 8mg，于4°C冰箱冷藏。3.实验动物雄性SPF级SD大鼠，体重130士20g，共计120只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司(合格证号SCXK(沪)2008-0016)。实验鼠颗粒饲料饲养，自由饮水。4.其它试剂STZ(美国 Sigma 公司提供，China CAS NO. 18883-66-4 Pcode 1000830091.)；柠檬酸(中国医药集团上海化学试剂公司，批号20000801)；柠檬酸钠 (上海试剂四厂，批号080330)；复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐制药有限公司，批号 110102)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。5.主要实验仪器AZ5E型裂隙灯显微镜(苏州六六视觉股份有限公司)二、本发明的部分药理学试验数据。1. STZ制备取0. 21g柠檬酸加入IOml蒸馏水配成柠檬酸溶液，取0. 29g柠檬酸钠加入IOml蒸馏水配成柠檬酸钠溶液。取上述柠檬酸溶液1. Iml和柠檬酸钠溶液0. 86ml配制成PH = 4. 5的IOOml缓冲溶液。取缓冲溶液70ml，加入STZ1. 4g充分溶解，配制成2% STZ 溶液[1]。2.糖尿病白内障模型制备及重组水蛭素(III)滴眼液的治疗作用大鼠禁食Mh，不禁水，分为正常对照组和模型组2组。正常对照组大鼠腹腔注射 (65mg/kg)上述缓冲溶液，模型组大鼠腹腔注射2% STZ(65mg/kg，0. 325ml/100g)溶液。注射完毕，正常饲养大鼠。7 后，大鼠空腹血糖> Ilmmol 为糖尿病模型成功标准，造模 2周后将大鼠使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，用裂隙灯显微镜观察大鼠晶状体混浊程度，记录结果[1]。根据晶状体的混浊程度，将造模大鼠随机分为5组，使不同混浊程度大鼠能均勻分配到模型组，阳性药组，高剂量组，中剂量组，低剂量组；另设一组为正常对照组，大鼠共分6组，每组16只大鼠。高剂量组，中剂量组，低剂量组分别给予2000U/ml，1000U/ml，500U/ ml重组水蛭素III滴眼，阳性药组给予白内停滴眼，均为每日3次，每次1滴。于给药4周后，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，用裂隙灯显微镜定期观察大鼠晶状体的混浊程度，观察后记录结果。晶状体混浊程度按表1标准分别赋予不同分值，进行组间t检验[2’3]。表1.大鼠晶状体混浊程度评分标准
权利要求
1.重组水蛭素在预防和治疗糖尿病性白内障中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，具体说是在预防和治疗糖尿病性白内障中的应用。
文档编号A61P27/12GK102258771SQ20111019549
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者吴梧桐, 谭树华, 龚晓健 申请人:中国药科大学