一种香椿内生真菌TS4及其次级代谢产物、制备方法和应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种香椿内生真菌TS4及其次级代谢产物、制备方法和应用。

背景技术：

随着人们对食品安全的要求日益强烈，对天然抗氧化剂的研究也日益增多。脂质氧化是引起食品败坏的因素之一，并且与各种人类疾病息息相关，如炎症、衰老和癌症等。随着人口老龄化的加剧，人们对抗氧化衰老产品的日益需求以及自由基生物学和医学研究的日趋深入，天然抗氧化剂的开发和利用越来越引起人们的重视，逐渐成为生命科学研究领域的热点之一，所以抗氧化物质的筛选具有重要的理论和实践意义。抗氧化剂不但能够有效地抑制油脂和食品的氧化，防止油脂酸败，延长保质期，而且还能预防和减轻体内细胞膜脂质过氧化物的破坏，保持组织的完整性以及在生命活动中起着极其重要的作用，具有防癌、抗衰老等功能。

相对于化学添加剂来说，植物源以及微生物源天然生物活性物质具有安全、低毒、高效、不在人畜体内积累等特点，为新型添加剂的应用开拓了美好的前景。在目前普遍采用的植物源物质方面，由于没有统一的规划，滥采乱挖现象时有发生。同时，植物资源本身比较稀少，生长速度相对缓慢，再生较难，容易造成生态破坏等问题，制约了植物源产品的开发。而生活在植物体内这一特殊进化环境中的内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物，研究发现内生真菌产物中存在多种新型活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗癌等作用，而且真菌易于培养，可以通过培养条件优化来大幅度提高其有效成分产量，以便用于工业化生产，具有广阔的前景。香椿是我国特有的集材、菜、药为一体的珍贵木本植物，已有研究表明香椿叶的提取物中富含多酚、黄酮等活性物质，具有显著的阻止豆油氧化的功能；具有一定的降血糖活性；并对大肠杆菌、枯草芽抱杆菌等有抑制作用。但目前国内外有关香椿内生真菌及从其次级代谢产物中开发天然活性物质的的相关研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种香椿内生真菌TS4及其次级代谢产物、制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种香椿内生真菌TS4，该真菌为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、近缘毛壳Chaetomium subaffine，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCC No.12978。

一种制备香椿内生真菌TS4的次级代谢产物的方法，步骤如下：

（1）菌株发酵：

将保藏号为CGMCC No.12978的香椿内生真菌TS4接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180摇床发酵培养6-8d；

（2）菌株次级代谢产物的制备：

将步骤（1）所得菌株TS4的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌TS4的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。

利用所述制备方法制备的香椿内生真菌TS4的次级代谢产物。

所述香椿内生真菌TS4的次级代谢产物在制备抗氧化保健食品和/或药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌TS4 (Chaetomium subaffine)，该菌的次级代谢产物具有很好的抗氧化活性，无毒副作用，适用于抗氧化保健食品和药物的研发和制备，具有很好的市场前景；

（2）所述的制备香椿内生真菌TS4 (Chaetomium subaffine)次级代谢产物的方法简单易行，成本低。

附图说明

图1为实施例1香椿内生真菌TS4菌株形态特征，其中a为菌落正面形态，b为菌落反面形态，c、d分别为菌丝（×20）及（×100）。

图2为实施例1香椿内生真菌TS4的18S rDNA基因片段扩增图谱，其中1--18S rDNA基因片段扩增产物，2为DNA Ladder Mix Marker。

图3为实施例1香椿内生真菌TS4的ITS rDNA基因片段扩增图谱，1--ITS rDNA基因片段扩增产物，2为DNA Ladder Mix Marker。

图4为实施例1香椿内生真菌TS4菌株基于18S基因序列构建的系统进化树。

图5为实施例1香椿内生真菌TS4菌株基于ITS基因序列构建的系统进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：

供试香椿材料：采自河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地。

PDA平板培养基和/或PDA斜面培养基，其成分为：土豆煮汁1000mL、葡萄糖20g、琼脂20g，自然pH值，121℃下20 min高压灭菌后可用；PDA液体发酵培养基，其成分为：土豆煮汁1000mL、葡萄糖10g、麦芽糖20g、甘露醇20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、味精5g，自然pH值，121℃下20 min高压灭菌后可用。其中，土豆煮汁：取新鲜土豆去皮切成1cm³大小块状，每200g土豆加蒸馏水1000mL煮沸40 min，四层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至1000mL。

实施例1

1. 香椿内生真菌的分离与筛选

表面消毒：用流水将香椿茎表面浮土冲洗干净，然后用无菌水漂洗2次，风干表面水分，转移至超净工作台，在无菌操作条件下，将香椿茎在70v%乙醇中浸泡1min，取出后在有效氯3wt%次氯酸钠溶液中浸泡1min，再在70v%乙醇中浸泡30s，然后用无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干表面，备用。

菌株的分离、纯化：表面消毒好的香椿茎，无菌条件下，用灭菌后的剪刀将其剪成0.5cm左右的小块，放在PDA平板培养基上，每板4根，于28℃恒温培养箱培养3d，当植物组织内部向培养基周围长出菌丝时，将菌丝转移到新的PDA平板培养基上划线培养，5d 后分离纯化得到单个菌落，然后转移到PDA斜面培养基试管中，28℃恒温培养5d 后，即获得香椿内生真菌TS4，4℃冰箱保存，备用，并于2016年9月30日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.12978。

2. 香椿内生真菌的鉴定

2.1 形态学鉴定

将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS4接种在PDA平板培养基上，28℃连续培养4-5d，观察菌落形态特征。挑取菌落边缘菌丝，制作水浸片，在光学显微镜下观察菌丝体的形态特征。

2.2 分子生物学鉴定

①DNA提取：将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS4转接到PDA平板培养基上，28℃培养5天。基因组DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)，严格按照说明书操作。提取的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳检测(150 V，100mA 20 min)，4℃保存备用，或于-20℃中长期保存。

②PCR扩增18S和ITS序列

18S rDNA扩增引物：NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)，NS6(5’-GCAT

CACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)

ITS rDNA扩增引物：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS4(5’-TC

CTCCGCTTATTGATATG C-3’)

PCR扩增体系如表1所示：

PCR反应条件如表2所示：

③PCR扩增产物的电泳检测：产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后4℃保存备用。

④PCR产物纯化和测序：由上海生工有限公司进行。

⑤系统进化树的构建：将所测得的序列在NCBI中进行Blast比对，下载与供试菌株序列同源性相近的菌株序列利用ClustalX软件进行序列的多重比对，利用MEGA5.05软件N-J方法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自展数为1000。

3. 结果：

(一)菌株形态特征

TS4菌株菌落正面浅色，气生菌丝浅褐色；反面呈淡黄色（图1a、b）。菌株生长速度较快，28℃培养4-5d菌落布满培养皿。显微镜观察下菌丝有分支，有隔，光滑透明（图1c、d）。

(二)菌株的18S、ITS序列及其系统发育学分析

以提取出的菌株TS4的DNA为模板，对其18S和ITS rDNA基因片段进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图2、3所示，扩增产物分别为1300bp和500bp左右的特异性扩增条带，大小与期望值相符。PCR扩增产物由上海生工有限公司进行测序，测序结果，分别如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示，表明：该菌株的18S和ITS rDNA基因序列长度分别为1265bp和553bp。

将PCR扩增获得的18S rDNA序列（SEQ ID No.1）在NCBI中进行BLAST分析，结果表明，菌株TS4的18S rDNA序列与毛壳属Chaetomium sp.的18S序列同源性最高，相似性达99%。利用ClastalX与Mega5.0软件，基于18S rDNA序列构建系统发育树，见图4，从系统进化树上可以看出，每一个属分别形成一个独立的分枝，菌株TS4与Chaetomium sp.( EU826480.1)和Chaetomium sp.( AB521039.1)处于同一分枝，亲缘关系最近，判断该菌株为毛壳属。

将PCR扩增获得的ITS rDNA序列（SEQ ID No.2）在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，该序列与Chaetomium subaffine的ITS序列同源性很高，相似性达99%。基于ITS rDNA序列构建系统发育树，见图5，从系统发育树可以看出每一个种分别形成一个独立的分枝，菌株TS4与Chaetomium subaffine(JN209929.1)和Chaetomium sp.(AM944353.1)聚为一枝，表现出非常近的亲缘关系。

综合菌落形态、显微形态特征以及18S和ITS rDNA基因序列分析结果，将香椿内生真菌TS4鉴定为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、近缘毛壳Chaetomium subaffine。

实施例2 香椿内生真菌TS4的次级代谢产物的制备

香椿内生真菌TS4的次级代谢产物的制备，步骤如下：

1、菌的发酵培养

（1）种子培养：将4℃冰箱保存的香椿内生真菌TS4接种到PDA平板培养基上，28℃培养箱活化培养4d；

（2）扩大培养：将盛有200mL PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶用封口膜封口，高压灭菌锅中121℃灭菌20min；冷却后接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块，封口，置于摇床中培养，自然光照，28℃、150rpm摇床发酵培养7d，得到发酵培养物。

2、菌株次级代谢产物的制备

（1）提取：菌株发酵完成后，香椿内生真菌TS4的发酵培养液先用匀浆搅拌机搅碎，再用布氏漏斗抽滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准；

（2）浓缩：将乙酸乙酯萃取液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩蒸干，即得到香椿内生真菌TS4的次级代谢产物。

实施例3 香椿内生真菌TS4的次级代谢产物抗氧化活性测试

采用DPPH自由基清除法对香椿内生真菌TS4的次级代谢产物抗氧化活性进行测定。

样品液配制：将香椿内生真菌TS4的次级代谢产物用无水乙醇溶解配成10mg/mL的溶液。

测定：准确称取0.0197g DPPH，用无水乙醇定容至250mL，配成2×10^-4mol/L的DPPH溶液。取样品液和2×10^-4mol/L DPPH溶液各2mL分别加入试管中，摇匀，室温下避光放置30min，使其充分反应，以无水乙醇为参比，在517nm波长处比色，测定其吸光度Ai；同时测定2mL无水乙醇与2mL DPPH溶液的混合液的吸光度Ac和2mL样品溶液与2mL无水乙醇的吸光度Aj。计算DPPH自由基清除率见公式。

清除率（%）=[Ac-（Ai-Aj）]/ Ac*100

结果：经测试，香椿内生真菌TS4的次级代谢产物对DPPH自由基的清除率为99.21%，具有很好的抗氧化活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种香椿内生真菌TS4及其次级代谢产物、制备方法和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1265

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctcattaaat cagttatcgt ttatttgata gtaccttact acatggataa ccgtggtaat 60

tctagagcta atacatgcta aaaatcccga cttcggaagg gatgtattta ttagattaaa 120

aaccaatgcc cttcggggct ctctggtgat tcataataac ttctcgaatc gcacggcctt 180

gcgccggcga tggttcattc aaatttctgc cctatcaact ttcgacggct gggtcttggc 240

cagccgtggt gacaacgggt aacggagggt tagggctcga ccccggagaa ggagcctgag 300

aaacggctac tacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ccgacacggg 360

gaggtagtga caataaatac tgatacaggg ctctttcggg tcttgtaatt ggaatgagta 420

caatttaaat cccttaacga ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 480

aattccagct ccaatagcgt atattaaagt tgttgaggtt aaaaagctcg tagttgaacc 540

ttgggcctag ccggccggtc cgcctcaccg cgtgcactgg ctcggctggg cctttccttc 600

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aagcatatca ata 553