本发明属于抗生素发酵无菌检查技术领域，具体涉及一种农用抗生素发酵过程中杂菌的检测方法。
背景技术：
发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌污染的情况下进行。发酵生产的环节比较多，尤其是好氧液态深层分批单一纯种发酵生产，由于发酵周期较长，发酵工序较复杂，如无菌空气制备，菌种培养的无菌操作，培养基和发酵设备、管道的灭菌，培养过程的灭菌操作等，每一个环节都有可能造成污染杂菌。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。为了防止染菌，人们采取了一系列措施，如改进生产工艺，对发酵罐、管道和其他附属设备、培养基及空气等过程严格灭菌，对蒸汽、无菌空气除严格按无菌要求供应外，还健全了生产技术管理制度，大大降低了生产过程染菌率。但是至今仍无法完全避免染菌的严重威胁，轻者影响了产品的收率和产品的质量，重者会导致“倒罐”，甚至停产，造成严重的经济损失。
据报道，国外抗生素发酵染菌率为2%～5%，国内的青霉素发酵染菌率2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率1%～2%。染菌对发酵产率、提取率、得率、产品质量和三废治理等都有很大的影响。
从国内外目前的报道来看，在现有的科学技术条件下要做到完全不染菌是不可能的。目前要做的是要提高生产技术水平，强化生产过程管理，防治发酵染菌的发生。一旦发生染菌，应尽快找出污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断，无菌试验是对生产菌种斜面或孢子瓶、摇瓶种子、各级种子罐和发酵罐培养液，定期取样培养，定期检查是否染菌的过程。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速地检查出杂菌的污染。
目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、酚红肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异常观察法等。
如《生物工艺原理（第三版）/高等教育规划教材》第十一章发酵生产染菌及其防治，第二节发酵异常现象及原因分析，二染菌的检查和判断。简要概述了酚红肉汤培养法、平板（双碟）培养法发酵生产染菌的检测方法。该检测方法缺点：检测前后对比不明显不利于分辨，检测时间较长。
因此，本领域迫切需要一种观察明显，培养时间短，检测快速的农用抗生素发酵过程中杂菌的检测方法。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种准确、快速的农用抗生素发酵过程中杂菌的检测方法，实现抗生素发酵过程中及时、快速判断杂菌污染，从而达到产品质量的控制。
本发明提供的农用抗生素发酵过程中杂菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配制
按照质量百分比，培养基配方为：葡萄糖（ar）：2-5%，蛋白胨（br）：0.5-1%，牛肉膏（br）：0.5-1%，nacl（ar）：0.1-0.5%，指示剂：0.1-0.5%，琼脂：1-1.5%，余量为水；ph：6.8～7.2；
（2）灭菌
在110-150℃下灭菌10-60min；
（3）摆斜面
把灭好菌的试管摆成斜面；
（4）检测
将检测液少许加入无菌样中，放入36～37℃恒温箱内培养12～16小时，观察无菌斜面是否有黄斑，黄斑则染杂菌。
在本发明的优选的实施方案中，培养基的配制步骤为：①称取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加热溶解；③加入1%苯酚红溶液溶解均匀；④加入琼脂加热溶解后，分装到20×200mm试管中，加棉塞包扎。
在本发明的优选的实施方案中，按照质量百分比，培养基配方为：葡萄糖（ar）：2%，蛋白胨（br）：0.5%，牛肉膏（br）：0.5%，nacl（ar）：0.5%，指示剂：0.5%，琼脂：1.5%，余量为水；ph：7.2。
在本发明的优选的实施方案中，所述的指示剂为1wt%的苯酚红溶液。
在本发明的优选的实施方案中，1%苯酚红溶液的配制方法为：①称取苯酚红1g加95%的酒精10ml；②加无盐水90ml；③搅拌均匀用中速滤纸过滤。
在本发明的优选的实施方案中，采用10%naoh调值。
在本发明的优选的实施方案中，所述培养基中的水选自ph5.5～6.5、电导率≤2us/cm的无盐水。
在本发明的优选的实施方案中，步骤（4）中的培养条件为温度36～37℃，湿度50～60%。
在本发明的优选的实施方案中，所有操作均为无菌操作。
在本发明的优选的实施方案中，步骤（4）中具体的检测步骤为：按照权利要求1-6中任一项所述的条件，分别取适量无菌培养液和培养液，于无菌苯酚红试管斜面中，在温度36～37℃；湿度50～60%的条件下培养12～16小时后，进行肉眼观察。
与现有技术中的显微镜检查法、酚红肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异常观察法相比，本发明通过所培养基配方与所述检测方法配合使用，菌斑明显，易于观察，简单、快速、准确的判定，比现有技术中的检测方法能节省至少50%的时间，适于普遍推广应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
实施例1
2015年7月生产多抗霉素时出现的几批染菌罐，用酚红肉汤培养法确定染菌为40小时左右，这时发酵罐ph开始急剧下降，糖耗快，氨氮降低，发酵单位开始下滑，只能提前放罐，严重影响正常生产。采用如下条件：培养基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚红液（指示剂）：5ml；琼脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚红液配制：①称取苯酚红（指示剂）1g加95%酒精10ml；②加无盐水90ml；③搅拌均匀用中速滤纸过滤。配制方法：①称取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加热溶解；③加入1%酚红液溶解均匀后，用10%naoh调ph6.8～7.2；④加入琼脂加热溶解后，分装到20×200mm试管中，加棉塞包扎。灭菌：在115℃下灭菌30min。摆斜面：把灭好菌的试管摆成斜面。检测方法：①将发酵液每8h少许加入无菌样中（注意整个取样过程的无菌操作），放入36～37℃恒温箱内培养。②20小时左右观察无菌斜面时，发现无菌斜面有少数黄斑，显微镜检查确定污染杂菌，及时采取抑菌控制方法继续发酵，最终发酵含量和正常发酵罐批低2.0%。无菌检测时间比用酚红肉汤培养法检测时间快20小时左右。
实施例2
2015年9月生产多抗霉素时出现的几批种子罐染菌，用酚红肉汤培养法确定染菌为32小时左右，这时种子罐的种子液已接种到发酵罐，发酵罐ph开始急剧下降，糖耗快，氨氮降低，泡沫增大，几乎没有发酵单位，只能倒罐。采用如下条件：培养基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚红液（指示剂）：5ml；琼脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚红液配制：①称取苯酚红（指示剂）1g加95%酒精10ml；②加无盐水90ml；③搅拌均匀用中速滤纸过滤。配制方法：①称取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加热溶解；③加入1%酚红液溶解均匀后，用10%naoh调ph6.8～7.2；④加入琼脂加热溶解后，分装到20×200mm试管中，加棉塞包扎。灭菌：在115℃下灭菌30min。摆斜面：把灭好菌的试管摆成斜面。检测方法：①将种子液每4h少许加入无菌样中（注意整个取样过程的无菌操作），放入36～37℃恒温箱内培养。②16小时左右观察无菌斜面时，发现无菌斜面有少数黄斑，显微镜检查确定污染杂菌，及时重新做种子接种，减少了经济损失。无菌检测时间比用酚红肉汤培养法检测时间快16小时左右。
实施例3
2016年4月生产春雷霉素时出现的几批染菌罐，用酚红肉汤培养法确定染菌为60小时左右，这时发酵罐ph开始急剧上升，糖耗快，氨氮降低，发酵单位开始下滑，泡沫增大逃逸，只能提前放罐，严重影响正常生产。采用如下条件：培养基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚红液（指示剂）：5ml；琼脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚红液配制：①称取苯酚红（指示剂）1g加95%酒精10ml；②加无盐水90ml；③搅拌均匀用中速滤纸过滤。配制方法：①称取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加热溶解；③加入1%酚红液溶解均匀后，用10%naoh调ph6.8～7.2；④加入琼脂加热溶解后，分装到20×200mm试管中，加棉塞包扎。灭菌：在115℃下灭菌30min。摆斜面：把灭好菌的试管摆成斜面。检测方法：①将发酵液每8h少许加入无菌样中（注意整个取样过程的无菌操作），放入36～37℃恒温箱内培养。②36小时左右观察无菌斜面时，发现无菌斜面有少数黄斑，显微镜检查确定污染杂菌，及时采取抑菌控制方法继续发酵，最终发酵含量和正常发酵罐批低1.0%。无菌检测时间比用酚红肉汤培养法检测时间快24小时左右。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。