一种细胞囊泡快速标记装置及方法与流程

本发明涉及一种实验室用方法，具体而言，是一种细胞囊泡快速标记装置及方法，该装置简单，方法高效，可进行实时观察记录和实验。

背景技术：

细胞囊泡形态和动态变化的研究首先需要对囊泡进行荧光标记。目前，常用的标记办法是，用一定浓度的荧光染料进行细胞外孵育，待标记上后将胞外的染料进行洗脱，然后到显微镜下进行动态观察并记录，从标记、到洗脱、再到转移到显微镜下观察记录，这个过程通常需要10-30分钟的时间。然而，很多类型的囊泡动态变化过程非常短暂，在洗脱和转移的过程中就已经发生了巨大的变化，而这个时间的变化过程是无法被观察和记录的。因此，本发明在现有标记方法的基础上进行了改造，利用一种气压作用于微型电极释放微量标记染料的装置，并利用染料在液体中快速扩散的现象，节省了洗脱和转移的时间，获得了一种能快速有效标记、并能实时观察记录的囊泡标记方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的快速有效标记、并能实时观察记录的细胞囊泡标记装置及方法。

本发明的细胞囊泡快速标记装置，包括荧光显微镜、显微镜专用活细胞培养系统、玻璃微电极、压力控制器、电刺激器和气瓶，气瓶(压缩空气或氮气)与压力控制器连接，压力控制器输出端通过气管连接玻璃微电极尾端，电刺激器与压力控制器相连用于控制压力控制器的气压输出频率和时长，玻璃微电极内灌有囊泡标记染料，用于对置于显微镜专用活细胞培养系统上的细胞囊泡进行标记，荧光显微镜进行实时观测。

作为优选，所述的玻璃微电极尖端可以为2μm，外径1mm，内径0.5mm。

采用本发明装置进行细胞囊泡快速标记的方法，包括如下步骤：

在玻璃微电极内灌入细胞囊泡相应的囊泡标记染料，消除气泡，染料灌入量为玻璃微电极2/3长度；

将气瓶(压缩空气或氮气)连接到压力控制器上，调节输出气压(通常调至3psi)，将玻璃微电极尾端通过气管与压力控制器输出端连接；

连接电刺激器和压力控制器，通过设置电刺激器的参数来控制压力控制器的气压输出频率和时长；

在显微镜专用活细胞培养系统上对细胞囊泡进行标记，荧光显微镜进行实时标记观测。

采用本发明的方法完成标记后，停止给气，染料浓度会因扩散作用迅速降低，无需洗脱可以直接进行囊泡动态变化的后续观察。

本发明有如下特点：1)标记精度高，可针对指定的细胞进行标记；2)标记过程可以精确控制；3)标记后无需洗脱即可进行观察和记录；4)整个过程在显微镜下实施，标记过程可实时记录；5)可以实现同步药物刺激。因此，本发明的装置及方法可快速有效标记、并能实时观察记录。

附图说明

图1囊泡标记装置示意图。

图2玻璃微电极显微图，尖端直径约为2μm，图解比例尺：5μm。

图3通过微电极释放的染料sulforhodamine101(sr101)扩散特性。图3(a)荧光强度检测示意图，不同颜色的同心圆分别代表距离电极尖端不同距离的位置(同心圆半径分别为15μm，50μm，100μm，150μm，200μm，250μm)，图解比例尺，50μm。图3(b)sr101荧光强度定量分析，所有数据以15μm处的荧光强度值为基准做归一化处理。图3(c)电极尖端300μm范围内荧光染料sr101在不同时间的扩散分布图，x和y坐标轴示意以电极尖端为原点的位置。sr101在5min左右即达到稳定分布状态，并在30min内保持该稳定状态。

图4小胶质细胞迁移过程中的囊泡可以用胞饮泡的标记物dextran染色，图中分别用alexafluor488dextran(3000mw,1μg/μl；绿色，af3k)和texasreddextran(70,000mw，1μg/μl；红色，tr70k)对胞饮泡进行了标记，图解比例尺：10μm。

图5胞饮泡在小胶质细胞迁移过程中的动态变化。图5(a)-(c)胞饮泡不同类型的动态变化。图5(a)箭头指示从胞饮泡中分裂出来的小囊泡，图5(b)和图5(c)中的红色和绿色箭头指示先后形成的两个胞饮泡之间的相互作用，图5(c)中的白色和黄色箭头指示囊泡形成后成熟变小的过程，图解比例尺：10μm。图5(d)胞饮泡进入小胶质细胞后的面积动态变化统计结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明所涉及的方法作进一步说明。

本发明提出了一种新型的囊泡标记方法及装置，该方法是采用一种用于膜片钳实验的玻璃微电极，通过一定频率和压力的气体，将微电极中的染料均匀地释放到细胞周围，形成稳定的染料浓度，从而实现对特定的囊泡进行标记。

如附图1所示，实现该方法的装置由激光共聚焦显微镜(型号：fv1000，日本olympus公司)、显微镜专用活细胞培养系统(型号：inu-zilcs-f1，日本tokaihit公司)，玻璃微电极(外径1mm，内径0.5mm，货号bf100-50-15，美国sutterinstrument公司)、压力控制器(型号：picospritzeriii，美国parker公司)、电刺激器(型号：sen-7103，日本nihonkohden公司)和气瓶组成。玻璃微电极由微电极拉制仪(型号：p-97，美国sutterinstrument公司)制备，尖端直径约为2μm，如图2所示。在玻璃微电极内灌入相应囊泡标记染料，约2/3长度即可，注意消除气泡。首先，将气瓶(压缩空气或氮气)连接到压力控制器上，调节输出气压(一般为3psi)，将玻璃微电极通过气管与压力控制器连接；其次，连接电刺激器和压力控制器，通过设置电刺激器的参数来控制压力控制器的气压输出频率和时长，以控制玻璃微电极中囊泡标记染料的释放速度。完成标记后，停止给气，染料浓度会因扩散作用迅速降低，无需洗脱可以直接进行囊泡动态变化的后续观察。

标记过程在显微镜专用活细胞培养系统上实施，保证培养系统内co2浓度为5％、温度控制在37℃左右，仪器稳定后，设置激光共聚焦显微镜拍摄参数，每隔一定时间拍摄一张图片，整个过程都可以实现实时活细胞荧光观察和记录。

此外还可以利用另一个玻璃微电极，对细胞进行特定药物的刺激。

本发明的装置可用于将贴壁在玻片上的细胞转移到活细胞培养系统的小室内，内含l15培养液或ecs，上面盖一层甲基硅油以维持稳定的温度和渗透压，通过玻璃微电极释放染料和刺激分子，形成的稳定浓度梯度，诱导细胞的形成囊泡并被标记。无需洗脱，可以快速有效地实现对细胞囊泡的标记，可极大地提高实验效率，对生物实验具有重大意义。

下面以小胶质细胞胞饮泡的快速标记及记录方法作为具体实例进行说明：

原代小胶质细胞培养及纯化

1)准备工作：准备好预铺pdl的75-cm²flask，并用无菌双蒸水清洗；用酒精棉球擦拭手术器械；准备冰盒，hbss(4℃预冷)，mem(含10％(vol/vol)fbs)培养液和胰酶(37℃预热)。

2)取新生sd大鼠(p0-2)，全身喷洒消毒酒精，用断头法获得大鼠头部。

3)在超净台中，用眼科剪沿颅骨中线分别剪开头皮和颅骨，用眼科镊剥开头骨，小心取出大脑，迅速转移到含预冷hbss的35-mm培养皿(置于冰盒上)中。

4)在解剖镜下，用系结镊分离左右脑半球，去除脑膜，去除残余的血窦和血管组织，去除核团和海马，仅留皮层。

5)用镊子将皮层剪成2-mm³的小块，将皮层碎片转移到含有0.25％胰酶的1.5-mlep管中(每两个皮层用0.6ml胰酶)，37℃消化12min。

6)用mem(含10％fbs)终止消化反应，在玻璃管中用5-ml移液器用力吹打约25次后，静置5min，等待组织块沉淀，收集上清，4℃下500g离心5min。

7)弃上清，将细胞沉淀用mem(含10％fbs)重悬，接种于前面准备好的flask中(每个flask种植约2个皮层的细胞量)，每个flask中的培养液为10-15ml。

8)将细胞放在37℃培养箱中(95％空气/5％co2)培养，第二天全换液，之后每隔三天半换液。

9)培养6-8天后小胶质细胞成熟，此时，在相差显微镜下观察，星形胶质细胞铺满瓶底，呈平滑丝绸状，上层可见圆形饱满、明亮、贴壁性弱的细胞，部分已经悬浮在培养液中，这些细胞大部分被鉴定为小胶质细胞；轻轻的摇动flask使细胞脱落，收集上清，4℃下500g离心5min。

10)弃上清，用3-4mlmem(含10％fbs)重悬，种于8×8mm盖片上，每玻片约50μl悬液，细胞密度约为4×10⁴cells/cm²。

11)将玻片放在37℃培养箱中(95％空气/5％co2)静置15min，使细胞贴壁，然后用mem(含10％fbs)洗去未贴壁的细胞，并加入新鲜的mem(含10％fbs)，置于37℃培养箱中待用，放置时间不超过2天。

本文中的小胶质细胞培养方法参考了nakajima的方法，并略作修改。前期准备和培养过程大概需要一周的时间，通过这种方法可以获得高纯度的小胶质细胞，通过免疫染色的方法验证，其纯度可高于95％。

囊泡标记及动态分析

1)利用显微镜专用的co2活细胞培养系统，维持稳定的细胞状态，约30min可以使体系温度达到稳定状态。

2)连接压力给药系统，设置压力输出参数(见图1)。

3)在微电极内灌入用于诱导胞饮泡的atpγs(1mm)和标记胞饮泡的染料dextran(1μg/μl)，约2/3长度即可，注意消除气泡。

4)将步骤1中纯化得到的小胶质细胞转移到含有1.5ml培养液的chamber上，上面盖一层甲基硅油，以维持实验过程中温度和渗透压的稳定。

5)用显微操纵器将微电极移到细胞层上面，电极尖端位于视野的中间。

6)在60倍水镜下用激光共聚焦显微镜进行dic和荧光通道时间序列成像，图像尺寸1024×1024pixels，时间间隔20sec，成像开始时同时打开压力给药系统，作用10min后细胞基本标记上dextran，停止压力给药系统，染料因扩散作用迅速稀释，无需洗脱，此过程连续成像直到实验结束，总时间30-50min(如图4和图5)。

7)获取图像后，用imagej和imaris等软件对小胶质细胞胞饮泡的动态变化过程进行追踪和分析(如图5)。