本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是一种精确测量人群端粒长度的方法。
背景技术：
端粒，是特殊的核蛋白复合物，由进化上保守的串联重复DNA序列TTAGGG组成，位于真核生物染色体末端，在真核细胞生物学中起到重要作用。端粒的缩短起到有丝分裂计数器和寿命限制的作用，能在细胞水平反应器官的衰老。端粒长度的研究，对端粒及端粒相关疾病甚至肿瘤的研究方面极其重要。端粒长度测量是研究端粒生物学及端粒功能失调对退行性疾病影响的重要手段。临床上，端粒长度测量被广泛运用于诊断端粒相关疾病，包括心血管疾病、进行性肝硬化、风湿性关节炎等。精确可靠的端粒长度测量对端粒临床意义的研究极其需要。
目前，常用的测量端粒长度方法还没有一种能做到精确、容易和快速，且目前所采用的端粒测量方法操作复杂，要求较高，或需要大量DNA样本，很难进行人群端粒长度的精确测量及比较。末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment，TRF)分析法是首次用于检测端粒长度的方法，被认为是端粒测量的黄金标准法(gold standard)，但TRF分析需要大量的DNA(0.5～5μg，≥106个细胞)，同时，它对基因组的完整性及DNA样本纯度要求较高。荧光原位杂交定量法(Quantitative-fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)要求每个样本中至少有15～20个处于分裂中期的细胞，才能获得可靠的端粒长度测量。结合流式细胞术(flow cytometry)的荧光原位杂交(Flow-FISH)也用于测量端粒长度，但整个过程较为费时，技术昂贵，且操作要求苛刻。
实时定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)法测量端粒长度的主要原理是用特异的引物来扩增端粒，通过收集荧光估算出端粒的总长度(T)，用单拷贝基因的引物扩增单拷贝基因，来估算基因组拷贝数(S)，根据T/S比率，估算出每个二倍体基因组中端粒的平均长度。而RT-qPCR最主要的局限在于样本之间可变性较大，移液过程中误差大，此外，这个方法还需要进行假设，包括各DNA样本完整性一致，都为二倍体，核型稳定等。对于结果而言，不同RT-qPCR实验所测出的端粒长度也很难进行比较。
技术实现要素：
本发明的目的是针对背景技术存在的问题，提供一种精确测量人群端粒长度的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种精确测量人群端粒长度的方法，其特征在于，该测量方法单拷贝基因选用编码酸性核糖体磷蛋白质P0的36B4基因，步骤包括：
(1)人基因组DNA提取：静脉穿刺取血150～200μl，用血液基因组提取试剂盒提取样本基因组DNA，同时计算其浓度和纯度；
(2)设计标准物和引物并合成；
(3)设计端粒和36B4标准曲线：
①端粒标准曲线设计，根据引物合成报告书中的分子质量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德罗常数Avogadro’s number＝6.02×1023，端粒标准品的质量MW/Avogadro’s number＝0.44×10-19g，计算出最高浓度的标准物Standard A相当于有1.14×1012kb端粒，稀释六个端粒标准物A～F(1012～107)，最低浓度的标准物相当于含1.14×107kb端粒，端粒标准曲线对样品的端粒总长度进行度量，得出具体数值；②根据引物合成报告书中的分子质量MW＝23268.15μg/μmole，单拷贝基因标准品的质量MW/Avogadro’s number＝0.38×10-19，计算出最高浓度的标准物Standard A含20pg的36B4合成物，相当于2.63×108个基因组拷贝，稀释六个36B4标准物A～F(108～103)，最低浓度的标准物相当于有2630个基因组拷贝，通过单拷贝基因标准曲线对样品的基因组数量进行度量；
(4)RT-qPCR法测量人群端粒长度：样品体系和标准品体系按Power SYBR Green mastermix(2×)10μl、引物-F 1μl、引物-R1μl、双蒸水4μl、DNA 4μl，20μl体系；按95℃10min，95℃15s、60℃1min、×40，进行PCR反应；
(5)数据分析：样本的端粒总长度和基因组拷贝数，二者的比率就是样本的端粒绝对长度。
进一步的，步骤(2)中，所述标准物包括端粒标准物和36B4标准物，所述端粒标准物序列如SEQ ID No.1所示，所述36B4标准物序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，步骤(2)中，所述引物序列为：
Telo-F CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
Telo-R GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
36B4-F CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC
36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。
本发明的有益技术效果是：本发明在RT-qPCR法的基础上加入端粒标准曲线和单拷贝基因标准曲线对T、S值进行更准确度量，以此获得更准确的端粒长度，且DNA用量少，仅需60ng，测量速度快，有可比性，能精确的大批量测量出端粒长度，特别适合人群端粒长度测量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、人的基因组DNA提取
静脉穿刺取血150～200μl，用北京天根血液基因组提取试剂盒进行人样本基因组DNA提取。
取细胞DNA提取液5μl，加入495μl的三蒸水稀释500倍，紫外分光光度计测定260nm和280nm波长的OD值，DNA浓度的计算公式如下：
DNA的浓度(μg/μl)＝OD260×稀释倍数×50/1000
DNA的纯度为OD260与OD280的比值，当OD260/OD280在1.8左右时，说明样本DNA的纯度较高，比值如果大于1.9，说明样品有RNA污染，比值如果小于1.6，说明样本有蛋白质等污染。
2、设计标准物和引物并合成；
3、设计端粒和36B4标准曲线：
①端粒标准曲线设计，根据引物合成报告书中的分子质量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德罗常数Avogadro’s number＝6.02×1023，端粒标准品的质量MW/Avogadro’s number＝0.44×10-19g，计算出最高浓度的标准物Standard A相当于有1.14×1012kb端粒，稀释六个端粒标准物A～F(1012～107)，最低浓度的标准物相当于含1.14×107kb端粒，端粒标准曲线对样品的端粒总长度进行度量，得出具体数值；②根据引物合成报告书中的分子质量MW＝23268.15μg/μmole，单拷贝基因标准品的质量MW/Avogadro’s number＝0.38×10-19，计算出最高浓度的标准物Standard A含20pg的36B4合成物，相当于2.63×108个基因组拷贝，稀释六个36B4标准物A～F(108～103)，最低浓度的标准物相当于有2630个基因组拷贝，通过单拷贝基因标准曲线对样品的基因组数量进行度量；
。端粒长度和基因组数的标准曲线，将样本中的总端粒长度除以样本中的总基因组数，得到样本中的每个基因组端粒平均长度。
4、RT-qPCR法测量人群端粒长度
(1)引物及标准物按实验浓度要求进行溶解和稀释后，-20℃保存，稀释引物及标准品4℃备用不超过1周。
(2)RT-qPCR反应体系为：
样本体系：
为确保实验数据的稳定和准确，每个样本都进行三次平行重复实验，采用ABI八连管。同时进行的端粒标准曲线反应体系中，只需将DNA样本换为标准物，此外，还需要在每个标准物小管中加入质粒DNA(E.coli)，以保证标准物小管中的总DNA的量也为20ng。在加样过程中需要特别小心，避免吸样和加样误差，同时，由于Power SYBR Green含高浓度去垢剂，容易起泡，因此，在取样和加样过程中，应避免小泡产生以造成误差。同时，在加样到八连管的过程中，也要保证混样均匀，取量精确，避免实验误差的产生。同时，为确保每一板样本的值有可比性并减少实验误差，需要在每一板中加入阳性对照(已知端粒长度的样本DNA)和空白对照。
(3)在PCR仪上设置标准曲线法并准确设置好每个标准品的值，将空白对照、阳性对照、标准物、样本放入ABI实时荧光定量PCR仪上，循环条件为：
95℃10min；95℃15s，60℃1min(40个循环)
5、数据分析
反应结束后，检查阳性对照扩增及无扩增的阴性对照，观察标准物和样品的扩增，确保每个目标样品都落在标准曲线生成的直线范围内——任何扩增出这条直线范围的样品都应该在接下来的分析中舍弃。单个样品都一式三份的分析，并且只有Ct值的标准误﹤1Ct(CV﹥5％)这个数据才能被接受。样品的标准物要是大于1Ct，那么在接下来的分析中这个数据就应该被丢弃，并且重新分析。
系统依据标准曲线给每个样品分别生成两个定量值，即每个目标样本的端粒总长度(kb/reaction)和基因组拷贝数(基因组拷贝数/reaction)，二者的比率就是样本的端粒绝对长度(TL/diploid genome，kb)。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。