1.一种吡虫啉多克隆抗体制备方法,其特征在于步骤如下:
(1)称取吡虫啉于三口烧瓶中,用DMSO 溶解,再加入KOH ;另称取β-巯基丙酸,用DMSO 溶解并转移至恒压滴液漏斗中;在搅拌下将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中,于油浴上使之缓慢升温至100℃,保温2 h后,撤去油浴;待产物自然冷却至室温后,加入水,以HCl溶液调节pH 值为3;将此混合液转移到分液漏斗中,用二氯甲烷分3次提取,收集有机相;用NaHCO3水溶液分3 次洗涤二氯甲烷提取液,收集水相;用乙醚洗涤水相,弃去乙醚层;再用HCl溶液调节水相pH 值为3,然后用乙酸乙酯分3 次萃取水相,合并乙酸乙酯提取液;用蒸馏水洗涤乙酸乙酯,弃水层;提取液经无水硫酸钠干燥后,减压浓缩,得到黄色粘稠液体;加入丙酮溶液溶解,静置过夜,有黄色晶体析出;过滤,取出晶体,供MS 和1H-NMR 鉴定结构, 即得到吡虫啉的半抗原;
(2)将半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,然后加二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,让其在室温下搅拌反应过夜,反应液经离心后,吸取上清液缓慢滴加到牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液,搅拌反应6 h;待反应完成后,装入透析袋进行透析,透析结束后取出分装保存于-20℃的冰箱中,即得到吡虫啉的人工完全抗原;
(3)利用吡虫啉人工抗原对小型哺乳动物进行免疫,所得到的多克隆抗体即为吡虫啉多克隆抗体。
2.一种检测吡虫啉残留的ELISA检测试剂盒,其特征在于包括有:
包被有吡虫啉包被原的酶标板;
吡虫啉抗体;
吡虫啉标准品;
辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体;
洗涤液Na2HPO4·12H2O 68.8 g,NaH2PO4 6.9 g,NaCl 45 g;
底物液: 底物液A:无水乙酸钠8.2 g,β-糊精2.5 g,过氧化氢脲428.6 mg,加双蒸水至1000 mL,调节PH至5.0,4℃保存;底物液B:取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中,棕色瓶保存。
3.使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min;
反应终止液为1.25 mol/L的H2SO4。
4.根据权利要求2所述的检测吡虫啉残留的ELISA检测试剂盒,其特征在于所述吡虫啉偶联抗原是由吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到,所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白。
5.一种利用如权利要求2或3所述的试剂盒检测果蔬中吡虫啉残留的方法,其特征在于主要步骤如下:
(1)称取果蔬中可食用部分,加入取提取液,充分研磨并过滤,所得滤液即为待测样品;
(2)在包被有吡虫啉抗原并封闭好的酶标板孔中,加入相同体积的吡虫啉抗体及待测样品,37 ℃孵育40 min后用洗涤液,静置5min,甩掉洗液,将酶标板拍干,洗涤3次;
(3)加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL,37 ℃孵育40min后用洗涤液,静置5min,甩掉洗液,将酶标板拍干,洗涤3次;
(4)加入新鲜配制的底酶标板物显色液,每孔0.1 mL,37 ℃反应30min,观察颜色变化;
(5)待显色反应结束后,加入终止液,每孔0.05 mL,终止反应;
(6)将酶标板置于酶标仪中,于490 nm波长处测定检测结果。