抗ICOS的抗体及其用途的制作方法

本发明涉及抗ICOS的抗体及其用途。

发明背景

在若干癌症中，免疫抑制T细胞响应的建立与差的预后和疾病进展相关。在建立免疫耐受性中涉及的不同细胞效应器中，CD4⁺调节性T淋巴细胞亚群(Treg)专门抑制其它T细胞(Tconv)以及树突功能。所述抑制可以与患癌症尤其是乳腺癌的患者的差的存活率相关。

已经显示由CD4⁺T细胞产生的大量的IL-10和少量的IFNγ与降低的CD8⁺T细胞毒力、较低的T细胞增殖有关，并且参与单核细胞分化成涉及肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)的免疫抑制的M2c型巨噬细胞。

发明人之前报道了包括大量Treg(Ta-Treg)的记忆CD3⁺CD4⁺ T细胞浸润原发性乳腺肿瘤。通过Ta-Treg和浆细胞样DC(pDC)的原发性乳腺肿瘤浸润均与患乳腺肿瘤的患者的差的预后和差的存活率相关。

发明人进一步确认了涉及Treg的免疫抑制机制在大多数癌症和慢性感染中观察到。这些抑制机制阻止对抗癌症和慢性病毒感染的有效的免疫响应。

目前，在使用细胞疗法、抗-CD25mAb或低剂量的化疗的癌症和慢性感染中以Treg为靶向。然而，所述策略不提供可接受的结果。

此外，已经报道了Treg可能在与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病中具有重要的角色。

然而，目前没有可获得的和有效的策略用于治疗Treg相关的疾病。因此，仍然迫切需要针对涉及Treg的疾病提供有效的治疗策略。

发明概述

令人惊讶地，发明人表明ICOS和其配体之间的相互作用通过与浆细胞样树突状细胞(pDC)的相互作用在一些癌症中在Treg的激活、增殖和抑制功能中具有重要的作用。随后，他们集中他们的努力以产生具有拮抗剂和激动剂效果的特异性抗体。

所述拮抗剂抗体能有效治疗与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病或病症。所述激动剂抗体能有效治疗与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病或病症。

因此，本发明涉及抗ICOS的抗体或其衍生物，其：

通过抑制ICOS和ICOS-L之间的固定从而中和(neutralize)ICOS在Treg上的结合(engagement)；和

取消(abrogate)通过pDC诱导的Treg增殖。

在本发明的上下文中，所述抗体也被称为“拮抗剂抗体”。

本发明进一步涉及对抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos145-1和Icos 314-8和其衍生物，Icos 145-1和Icos 314-8其可分别由按照布达佩斯条约的条款于2009年7月2日以登录号CNCM I-4179和CNCM I-4180保藏在“法国国家培养物和微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)"(CNCM，Institut Pasteur，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，法国)的杂交瘤获得。

本发明还涉及根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物用作药物。本发明进一步涉及根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物用于治疗癌症或慢性感染。

本发明进一步涉及抗ICOS的抗体或其衍生物，其：

诱导IL-10和IFNγ生成；

诱导CD4+ T细胞增殖；

降低Tconv增殖，和

增加Treg的免疫抑制功能。

在本发明的上下文中，所述抗体也可以被称为"激动剂抗体"。

本发明还涉及抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17和其衍生物，Icos 53-3、Icos 88-2和Icos92-17其可分别由按照布达佩斯条约的条款于2009年7月2日以登录号CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178保藏在“法国国家培养物和微生物保藏中心″(CNCM，Institut Pasteur，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，法国)的杂交瘤获得。

本发明涉及根据本发明的激动剂抗体或其衍生物用作药物。本发明还涉及根据本发明的激动剂抗体或其衍生物用于治疗自身免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病。

特别地，本发明涉及以下各项：

1.一种抗ICOS的抗体或其衍生物，其通过抑制ICOS和ICOS-L之间的固定从而中和ICOS在Treg上的结合；和取消通过浆细胞样树突状细胞诱导的Treg增殖。

2.一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos 145-1和Icos 314-8及其衍生物，Icos 145-1和Icos 314-8能够分别从以登录号CNCM I-4179和CNCM I-4180于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

3.一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体具有以下6个CDR：

4.第3项的抗体，其中编码所述6个CDR的核苷酸序列如下：

5.第1-4项任一项的抗体用作药物。

6.第1-4项任一项的抗体用于治疗与Treg介导的免疫响应抑制有关的疾病或病症。

7.第6项的抗体，其中所述疾病或病症选自癌症和慢性感染。

8.第7项的抗体，其中所述癌症选自人恶性淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌。

9.一种抗ICOS的抗体或其衍生物，其：

诱导IL-10和IFNγ产生；

诱导CD4+ T细胞增殖；

降低Tconv增殖，和

增加Treg的免疫抑制功能。

10.一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17和其衍生物，Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17能够分别从以登录号CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

11.一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体具有以下6个CDR：

12.第11项的抗体，其中编码6个CDR的核苷酸序列如下：

13.第9-12项任一项的抗体用作药物。

14.第9-12项任一项的抗体用于治疗与过度免疫响应有关或由过度免疫响应引起的疾病或病症。

15.第14项的抗体，其中所述疾病选自自身免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病。

16.第14项的抗体，其中所述疾病为炎症性疾病。

17.第16项的抗体，其中所述炎症性疾病选自神经系统炎症性疾病、黏膜炎症性疾病、炎症性皮肤病和自身免疫性关节炎。

18.第17项的抗体，其中所述炎症性疾病选自多发性硬化症、炎症性肠道疾病、哮喘或扁桃体炎、皮炎、牛皮癣、接触性超敏反应和类风湿性关节炎。

19.用于诊断乳腺癌患者复发或早期死亡的风险增加的方法，包括在所述患者样品中定量ICOS阳性Treg细胞的步骤。

20.用于选择对抗ICOS免疫疗法治疗敏感的患者的方法，包括在所述患者样品中定量ICOS阳性Treg细胞的步骤。

发明详述

定义

如本文所用，术语"ICOS″或"可诱导T细胞共刺激分子"是指55-60kDa的跨膜同型二聚糖蛋白，其在其细胞外部分中递呈IgV型域和在其细胞质部分中递呈YMFM基序中的酪氨酸。已显示ICOS与其配体的结合诱导ICOS细胞质部分中酪氨酸的磷酸化。所述磷酸化是募集激活PI3K/AKT信号通路的p85 PI3K调节性亚基的原因。

ICOS结合也被描述为诱导CD40L在细胞表面的表达。已知CD40L对T淋巴细胞和B淋巴细胞之间的协作具有重要影响。

已发现在TCR激活之后，ICOS将在常规T细胞上(Tconv CD4+，CD8+亚群)以及Treg上表达。发明人证实所述激活在患有黑素瘤或乳腺癌的患者中更加重要。

如本文所用，术语"ICOSL"、"ICOS-L"和"B7-H2″是指ICOS配体。所述配体存在于淋巴细胞例如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞上，以及非淋巴细胞例如内皮或上皮细胞上。ICOS结合在淋巴细胞激活中具有重要作用，而且它诱导T淋巴细胞，尤其是Treg的增殖和存活。

如本文所用，术语"JICOS 1″是指表达ICOS的特异性细胞株。

如本文所用，各种语法形式的″单克隆抗体″是指仅含有一类能够与特定的表位免疫反应的抗体结合位点的抗体群体。因此，单克隆抗体通常具有对于与其免疫反应的任何表位的单一结合亲和力。单克隆抗体可因此包含具有多个抗体结合位点的抗体分子，每个抗体结合位点对于不同的表位是免疫特异性的，例如双特异性单克隆抗体。尽管在历史上单克隆抗体通过克隆纯免疫球蛋白分泌细胞系的无限增殖化产生，但克隆纯抗体分子群体也可通过本发明方法制备。制备单克隆抗体的实验室方法为本领域所熟知(参见，例如，Harlow等，1988)。单克隆抗体(mAb)可通过将纯化的突变TXAS免疫接种于哺乳动物，例如小鼠、大鼠、人和类哺乳动物中来制备。将免疫的哺乳动物中产生抗体的细胞分离并与骨髓瘤或异种骨髓瘤细胞融合以制备杂交细胞(杂交瘤)。生成单克隆抗体的杂交瘤细胞用作所需的单克隆抗体的来源。这种杂交瘤培养的标准方法描述于Kohler和Milstein(1975)中。虽然可通过杂交瘤培养产生mAb，但本发明不限制于此。还可预期使用通过从本发明杂交瘤克隆的表达核酸产生的mAb。也就是说，可将表达通过本发明杂交瘤分泌的分子的核酸转移至另一个细胞系以产生转化系。转化系的基因型不同于初始杂交瘤，但也能够产生对应于通过杂交瘤分泌的那些的本发明抗体分子，包括整个抗体分子的免疫活性片段。参见，例如，Reading的美国专利号4,642,334；PCT公开号；Winter等的欧洲专利公开号0239400和Cabilly等的欧洲专利公开号0125023。也可预期不涉及免疫的抗体生产技术，例如使用噬菌体显示技术以研究天然文库(自非免疫动物)；参见Barbas等(1992)，和Waterhouse等(1993)。

如本文所用，术语″抗ICOS抗体″是指直接对抗ICOS的单克隆抗体，优选使用重组体ICOS-Fc作为免疫原而获得的。

如本文所用，术语″抗体的衍生物″是指包含所述抗体的6个CDR的抗体。

如本文所用，术语″53.3mAb″或"Icos 53-3″是指直接对抗以登录号CNCN I-4176于2009年7月2日保藏于CNCM的ICOS的单克隆抗体。所述抗体为ICOS的激动剂。术语″53.3mAb的衍生物″是指包含53.3mAb的6个CDR的抗ICOS抗体。

如本文所用，术语″88.2mAb″或"Icos 88-2"是指以登录号CNCN I-4177于2009年7月2日保藏于CNCM的抗ICOS的单克隆抗体。所述抗体为ICOS的激动剂。发明人已证实在IL-2存在下使用所述抗体促进Treg增殖和IL-10分泌。术语"88.2mAb的衍生物″是指包含88.2mAb的6个CDR的抗ICOS抗体。

88.2mAb的6个CDR如下表1所示：

表1

如本文所用，术语″92.17mAb″或"Icos 92-17″是指直接对抗以登入号CNCN I-4178于2009年7月2日保藏于CNCM的ICOS的单克隆抗体。所述抗体为ICOS激动剂。术语″92.17mAb的衍生物″是指包含92.17mAb的6个CDR的抗ICOS抗体。

如本文所用，术语″145.1mAb″或"Icos 145-1″是指以登录号CNCN I-4179于2009年7月2日保藏于CNCM的抗ICOS的单克隆抗体。所述抗体为ICOS拮抗剂。术语″145.1mAb的衍生物″是指包含145-1mAb的6个CDR的抗ICOS抗体。

如本文所用，术语″314.8mAb″或"Icos 314-8″是指以登录号CNCN I-4180于2009年7月2日保藏于CNCM的抗ICOS的单克隆抗体。发明人已证实使用所述抗体阻断IL-10通过Tconv分泌。所述抗体为ICOS拮抗剂并高度适用于在癌症例如乳腺癌中预防树突状细胞介导的调节性T细胞扩增和抑制功能。术语″314.8mAb的衍生物″是指包含314.8mAb的6个CDR的抗ICOS抗体。

314.8mAb的6个CDR如下表2所示：

表2

如本文所用，术语″本发明的抗体″是指：

抗ICOS的抗体，其能够通过抑制ICOS和ICOS-L之间的固定从而中和ICOS在Treg上的结合并能够取消通过浆细胞样树突状细胞诱导的Treg增殖，即拮抗剂抗体；以及

抗ICOS的抗体，其能够诱导IL-10和IFNγ生成、诱导CD4⁺ T细胞增殖；降低Tconv增殖、和增加Treg的免疫抑制功能，即激动剂抗体。

所述表达也包含所述抗体的任意衍生物。

优选地，本发明抗体选自53.3mAb、88.2mAb、92.17mAb、145.1mAb、145.1mAb和314.8mAb和其衍生物。

如本文所用，术语"抗ICOS的拮抗剂抗体"是指能够结合ICOS而不引发类似于通过天然存在的ICOS诱导的响应的细胞响应的抗体。术语"本发明拮抗剂抗体"是指145.1mAb、314.8mAb和其衍生物。

如本文所用，术语"抗ICOS的激动剂抗体"是指能够结合ICOS并引发类似于通过天然存在的ICOS诱导的响应的细胞响应的抗体。因此，所述抗体模拟ICOS的作用。术语"本发明激动剂抗体"是指53.3mAb、88.2mAb、92.17mAb和其衍生物。

如本文所用，术语"抗原递呈细胞"和"APC"是指一类免疫细胞，其能够内化和处理抗原，以致抗原定子以能够被免疫系统识别的方式作为MHC-相关复合物递呈于细胞表面(例如，MHC I型限制性细胞毒性T淋巴细胞和/或MHC II型限制性辅助T淋巴细胞)。允许细胞作为APC的两个必要性质是处理吞噬抗原的能力和MHC基因产物的表达。APC的实例包括树突状细胞(DC)、单核噬菌细胞(例如巨噬细胞)、B淋巴细胞、皮肤Langerhans细胞和人的内皮细胞。

如本文所用，术语"Treg"和"调节性T细胞"是指特定群体的T淋巴细胞，其具有体外显性抑制响应者T细胞增殖和抑制自身免疫性疾病的能力。Treg已被暗示为人抗肿瘤免疫响应最终失败的主要贡献者。例如，在卵巢癌中，Treg抑制肿瘤-特异性T细胞并且大量的肿瘤相关的Treg与存活时间降低相关。发明人已证实Treg选择性抑制宿主的免疫响应并从而促进癌症进展，尤其在乳腺癌中。Treg初始被鉴定为CD4⁺CD25⁺细胞群，但也通过叉头族转录因子FoxP3的表达来表征。

发明人已证实与从相同患者的血液提取的Treg相比较，Treg在患者癌症组织中原位增殖并表达细胞表面标志物ICOS和CD39。

相反地，术语"Tconv"是指除Treg之外的T细胞。因此，术语"Tconv"包括功能为中和抗原(例如通过生成调节其它细胞活性的细胞因子或通过细胞毒活性)的T细胞。该术语包括T辅助细胞(例如ThI和Th2细胞)和细胞毒T细胞。在这方面，T辅助细胞优选表达CD4和表达低水平或不可检测水平的CD25。CTL细胞优选表达CD8和低水平或不可检测水平的CD4。优选地，非Treg细胞不表达CD4和CD25。优选地，非Treg细胞不表达FoxP3。

如本文所用，术语"肿瘤相关的调节性T细胞"和"Ta-Treg"是指与肿瘤相关，例如与乳腺肿瘤相关的调节性T细胞。发明人事实上已证实Ta-Treg存在于乳腺肿瘤组织的淋巴浸润物中并对患有乳腺癌的患者的存活率具有负面影响。

如本文所用，术语"浆细胞样树突状细胞"和"pDC"是指血液中循环和在外围淋巴器官中发现的先天免疫细胞。它们构成属于外围血液单核细胞(PBMC)组的细胞组。

如本文所用，术语"肿瘤相关的浆细胞样树突状细胞"和"Ta-pDC"是指与肿瘤例如乳腺肿瘤相关的浆细胞样树突状细胞。发明人已证实在ICOS/ICOSL共刺激的相关性下，Ta-pDC能够诱导Ta-Treg的增殖。

如本文所用，术语"IL-10"和"白介素-10"是指人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，其为抗炎症性细胞因子。该细胞因子主要由单核细胞产生并以较低的程度由淋巴细胞产生。该细胞因子在免疫调节和炎症中具有多效性。它下调Th1细胞因子、MHC II类抗原的表达。它还增强B细胞存活、增殖、和抗体生成。该细胞因子可阻断NF-KB活性，并参与JAK-STAT信号通路的调节。

如本文所用，术语″IFNγ"和"干扰素-γ″是指具有146个氨基酸亚单元的二聚蛋白质。IFN-γ在免疫系统中的重要性部分来源于其直接抑制病毒复制的能力，和最重要地来源于其免疫刺激和免疫调节作用。IFNγ作为先天免疫响应的一部分主要通过自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤细胞T(NKT)细胞产生，并且一旦发生抗原-特异性免疫则通过CD4和CD8细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。

如本文所用，术语"治疗"是指逆转、减轻、抑制该术语所应用的紊乱或病症、或者这种紊乱或病症的一种或多种症状的进展、或预防这种紊乱或病症、或者这种紊乱或病症的一种或多种症状。

"治疗有效量"意欲用于赋予受试者治疗效果所需的活性剂的最小量。例如，"治疗有效量"为在与疾病相关的病态症状、疾病进展或生理病症中诱导、改进或另外引起改善的量，或改善对紊乱的抗性的量。

如本文所用，术语"预防"是指减轻还未被诊断为患有疾病或病症的受试者中出现的疾病或病症。如本文所用，术语"受试者"表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物、和灵长类动物。优选根据本发明的受试者为人。

术语"癌症"包括多种器官系统，例如感染肺、乳房、甲状腺、淋巴、胃肠道、和生殖泌尿道的恶性肿瘤，以及腺癌，其包括恶性肿瘤例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。

术语"Treg相关的疾病"应包括其中调节Treg数和/或活性可提供有益效果的任何疾病或紊乱或状态。该术语包括：

-与Treg介导的受试者免疫响应抑制相关的疾病和病症，

-与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病和病症。

如本文所用，术语“与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病和病症”为由免疫调节细胞例如肿瘤-特异性T细胞的增殖的Treg抑制而引起的疾病和病症。如之前所述，发明人已证实Treg与患有癌症的患者中差的诊断率和存活率相关。

与Treg介导的受试者免疫系统抑制相关的疾病和病症的非限制性实例为癌症和慢性感染。

如本文所用，“与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病和病症”为例如自身免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病。

该表达进一步包括炎症性病症，例如神经系统的炎症性疾病(例如多发性硬化症)、黏膜炎症性疾病(例如炎症性肠道疾病、哮喘或扁桃体炎)、炎症性皮肤疾病(例如皮炎、牛皮癣或接触性超敏反应)、自身免疫性关节炎(例如类风湿性关节炎)。

如本文所用，术语"免疫响应"是指淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞、粒细胞、和由以上细胞或肝脏产生的可溶大分子(包括抗体、细胞因子、和补体)的协同作用，其导致癌症细胞、转移性肿瘤细胞、恶性黑素瘤、入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、或在自身免疫或病态炎症的情况下受试者的正常细胞或组织从受试者机体的选择性破坏、毁灭、或中和。

如本文所用，"自身免疫性疾病"为由个体自身组织产生并直接对抗个体自身组织的疾病或紊乱。

本发明的拮抗剂抗体

已证实ICOS的特异性配体ICOS-L在浆细胞样树突状细胞上表达。发明人已表明肿瘤相关的Treg与肿瘤相关的浆细胞样树突状细胞密切接触，说明这种相互作用允许肿瘤中ICOS与ICOS-L结合。

他们进一步表明原位ICOS/ICOS-L相互作用导致ICOS-L在Ta-pDC膜上的下调。发明人已开发了直接对抗ICOS的拮抗剂抗体并表明所述抗体的加入完全取消了pDC上ICOS-L的下调，其是造成Ta-Treg激活和增殖的原因。

发明人已表明根据本发明的拮抗剂抗体中和了ICOS在Treg上的结合并取消了它们通过pDC诱导的扩增。更确切地，所述抗体取消了通过ICOS/ICOSL相互作用诱导的Treg增殖和IL-10分泌。

因此，本发明的拮抗剂抗体高度适用于取消病理机制中所涉及的免疫抑制响应。因此，它们用于治疗与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病和病症。

因此，本发明涉及一种抗ICOS的抗体和其衍生物，其：

通过抑制ICOS和ICOS-L之间的固定中和ICOS在Treg上的结合；和

取消通过浆细胞样树突状细胞诱导的Treg增殖。

在一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述抗体为人源化抗体。

对于"中和ICOS在Treg上的结合"，其是指抗体干扰ICOS和其配体ICOS-L之间的协作。

对于"取消Treg增殖"，其是指与对照组织、优选非肿瘤组织、更优选血液相比较，在目标组织优选肿瘤组织中观察到Treg增殖的显著降低，优选完全停止。

本发明进一步涉及一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos 145-1和Icos 314-8和其衍生物，Icos 145-1和Icos 314-8可分别从以登录号CNCM I-4179和CNCM I-4180于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明还涉及一种包含抗体的6个CDR的抗体，所述抗体选自Icos 145-1和Icos 314-8和其衍生物，Icos 145-1和Icos 314-8可分别从以登录号CNCM I-4179和CNCM I-4180于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明还涉及包含以上表2的6个CDR的抗体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种选自Icos 145-1和Icos 314-8的抗体之一的衍生物抗体，所述Icos 145-1和Icos 314-8可分别从以登录号为CNCM I-4179和CNCM I-4180于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明的拮抗剂抗体的治疗用途

通过中和ICOS在Treg上的结合和取消Treg的增殖，本发明的拮抗剂抗体高度适用于治疗与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病和病症，例如癌症和慢性感染。因此，所述抗体可用于恢复抗肿瘤免疫性。

因此，本发明涉及根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物用作药物。

本发明进一步涉及根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物用于治疗与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病或病症。

在一个优选实施方案中，所述与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病或病症为选自癌症和慢性感染的疾病。

事实上，发明人已表明本发明的拮抗剂抗体适用于调节Treg数和/或活性以致取消与那些Treg相关的免疫抑制效应。因此，所述拮抗剂抗体代表了一种对于治疗与抑制免疫系统相关的疾病例如癌症和慢性感染而言非常有希望的策略。

癌症的实例包括，但不限于人恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、脑癌、前列腺癌、头颈部癌症、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、骨癌、宫颈癌、肝癌、口腔癌、食管癌、甲状腺癌、肾癌、胃癌、睾丸癌和皮肤癌。

慢性感染的实例包括，但不限于病毒性、细菌性、寄生性或真菌性感染，例如慢性肝炎、肺部感染、下呼吸道感染、支气管炎、流行性感冒、肺炎和性传播疾病。

病毒性感染的实例包括，但不限于肝炎(HAV、HBV、HCV)、单纯疱疹(HSV)、带状疱疹、HPV、流行性感冒(Flu)、AIDS和AIDS相关综合征、水痘(chickenpox)(水痘，varicella)、普通感冒、细胞巨化病毒(CMV)感染、天花(smallpox)(天花，variola)、科罗拉多壁虱热、登革热、埃博拉出血热、手口足病、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、诺如病毒、小儿麻痹症、进行性多灶性白质脑病(PML)、狂犬病、风疹、SARS、病毒性脑炎、病毒性肠胃炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病和黄热病。

细菌性感染的实例包括，但不限于肺炎、细菌性脑膜炎、霍乱、白喉、肺结核、炭疽热、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲菌病、斑疹伤寒症、淋病、李斯特氏菌病、莱姆病、风湿热、百日咳(WhoopingCough)、瘟疫、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、野兔病、伤寒、和尿路感染。

寄生性感染的实例包括，但不限于疟疾、利什曼病、锥虫病、查格斯病、隐孢子虫病、肝片吸虫病、丝虫病、变形虫感染、贾地鞭毛虫病、蛲虫感染、血吸虫病、绦虫病、弓浆虫病、旋毛虫病、和锥虫病。真菌性感染的实例包括，但不限于念珠菌病、曲霉病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病和脚癣。

在本发明一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物用于治疗癌症。优选地，所述癌症选自人恶性淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌。最优选地，所述癌症为乳腺癌。

本发明还涉及一种用于治疗与Treg介导的免疫响应抑制相关的疾病或病症的方法，所述疾病选自癌症和慢性感染，优选癌症和慢性感染，优选癌症，其中所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗ICOS的拮抗剂抗体或其衍生物的步骤。

抗ICOS的激动剂抗体

已发现ICOS结合与免疫抑制的T细胞响应相关。事实上，所述结合已被描述为降低IL-10和IFNγ的产生和降低CD4⁺ T细胞的增殖。

因而，如发明人所证实的，ICOS的激动剂抗体提供了相反效果并有益于治疗与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病。因此，本发明涉及抗ICOS的抗体或其衍生物，其：

诱导IL-10和IFNγ产生；

诱导CD4+ T细胞增殖；

降低Tconv增殖，和

增加Treg的免疫抑制功能。

对于"诱导IL-10和IFNγ生成"，其是指观察到IL-10和IFNγ产生的显著增加。

对于"诱导CD4+ T细胞增殖"，其是指与对照组织、优选非肿瘤组织、更优选血液相比较，在目标组织，优选肿瘤组织中观察到CD4+ T细胞增殖的显著增加。

对于"降低Tconv增殖″，其是指与对照组织、优选非肿瘤组织、更优选血液相比较，在目标组织，优选肿瘤组织中观察到Tconv增殖的显著降低。

对于″增加Treg的免疫抑制功能″，其是指观察到Treg抑制活性的显著增加。

在一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述抗体为人源化抗体。

本发明进一步涉及一种抗ICOS的抗体，其中所述抗体选自Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17和其衍生物，可分别从以登录号CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明还涉及一种包含抗体的6个CDR的抗体，所述抗体选自Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17和其衍生物，可分别从以登录号CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明还涉及一种包含以上表1的6个CDR的抗体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种选自Icos 53-3、Icos 88-2和Icos 92-17的抗体之一的衍生物抗体，所述Icos 53-3、Ices 88-2和Icos 92-17可分别从以登录号CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178于2009年7月2日保藏于CNCM的杂交瘤获得。

本发明的激动剂抗体的治疗用途

本发明还涉及根据本发明的抗ICOS的激动剂抗体或其衍生物用作药物。

本发明还涉及根据本发明的抗ICOS的激动剂抗体或其衍生物用于治疗与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病或病症。

本发明还涉及根据本发明的直接对抗ICOS的激动剂抗体或其衍生物用于治疗自身免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病。

在一个具体实施方案中，所述自身免疫性疾病选自风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)、多发性硬化症(MS)、克罗恩病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、寻常型天疱疮、类天疱疮、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、皮肌炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture′s syndrome)、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏病、特发性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、男性不育、混合型缔结组织病、重症肌无力、恶性贫血、致病性葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性黏液性水肿、瑞特综合征、僵人综合症、甲状腺毒症、溃疡性结肠炎、和韦氏肉芽肿病。

在另一个实施方案中，本发明还涉及根据本发明的抗ICOS的激动剂抗体或其衍生物用于治疗炎症性疾病，所述炎症性疾病选自神经系统的炎症性疾病例如多发性硬化症，黏膜炎症性疾病例如炎症性肠道疾病、哮喘或扁桃体炎，炎症性皮肤疾病例如皮炎、牛皮癣或接触性超敏反应，和自身免疫性关节炎例如类风湿性关节炎。

本发明还涉及一种用于治疗与过度免疫响应相关或由过度免疫响应引起的疾病或病症的方法，所述疾病或病症优选为自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主疾病、或炎症性疾病，其中所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗ICOS的激动剂抗体或其衍生物的步骤。

编码本发明抗体的核酸序列

本发明进一步的实施方案涉及编码选自53.3mAb、88.2mAb、92.17mAb、145.1mAb、314.8mAb的抗体之一的抗体和其衍生物的核酸序列。

在一个具体实施方案中，本发明涉及编码选自53.3mAb、88.2mAb、92.17mAb、145.1mAb、314.8mAb的抗体之一和其衍生物的VH域或VL域的核酸序列。

典型地，所述核酸为DNA或RNA分子，其可包含在任何合适的载体中，例如质粒、粘粒、游离体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。

术语″载体″、″克隆载体″和″表达载体″是指通过其可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，从而转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的媒介物。因此，本发明的又一个目的涉及一种包含本发明核酸的载体。这种载体可包含调节性成分，例如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者时引起或直接表达所述抗体。动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子、免疫球蛋白H链的启动子和增强子等。

可使用用于动物细胞的任何表达载体，只要编码人抗体C区域的基因可被插入和表达。合适的载体实例包括pAGE107、pAGE103、pHSG274、pKCR、pSGl beta d2-4-等。质粒的其它实例包括包含复制源的复制质粒，或整合型质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的其它实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可通过本领域已知技术制备，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染制备。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于制备这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可例如于WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中发现。

本发明的又一个目的涉及已被根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。术语″转化″是指将″外源″(即外来或胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，以致宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需的物质，典型地为通过引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接收并表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞被″转化″。本发明的核酸可用以在合适的表达系统中产生本发明抗体。术语″表达系统″是指在例如用于表达通过由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质的合适条件下的宿主细胞和相容载体。

常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、和哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括，但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或啤酒酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及初级或建立的哺乳动物细胞培养物(例如由成淋巴细菌、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Agl4细胞(ATCCCRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(以下称为"DHFR基因″)有缺陷的CHO细胞、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O细胞(ATCC CRL1662，以下称为"YB2/0细胞")等。

本发明还涉及一种产生表达根据本发明抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：

(i)将如上所述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞，

(ii)体外或离体培养所获得的重组宿主细胞，和

(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这种重组宿主细胞可用于产生根据本发明的抗体。

根据本发明的药物组合物

本发明还涉及包含本发明抗体的药物组合物。

因此，本发明抗体可与药学上可接受的赋形剂，和任选的持续释放基质，例如可生物降解的聚合物组合，以形成治疗组合物。

"药学上"或"药学上可接受的"是指当视情况而定施用于哺乳动物，特别是人类时，不产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和成分。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任意类型的制剂辅剂。

药物组合物的形式、施用途径、剂量和疗法无疑取决于待治疗的病症、疾病的严重性、患者的年龄、体重、和性别等。

可将本发明的药物组合物配制成用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉、皮下或眼内施用等。

优选地，该药物组合物包含对于能够注射的制剂为药学上可接受的介质。这些尤其可为等渗、无菌、盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥、尤其是冷冻干燥组合物，当添加时，取决于无菌水或生理盐水的情况，其允许构成可注射溶液。

用于施用的剂量可作为多个参数的函数而改变，并尤其作为所使用的施用方式、相关病理、或所需的治疗持续时间的函数而改变。为了制备药物组合物，可将有效量的抗体溶于或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。适用于可注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时配制无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且就存在易注射性而言必须是流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的并且必须在对抗微生物，例如细菌和真菌的污染作用下储存。

可在适当地混合有表面活性剂例如羟丙基纤维素的水中制备作为游离碱或药理学可接受盐的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇、和其混合物中和在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

本发明抗体可配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且其与无机酸，例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁，和有机碱如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体也可以是含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、和植物油的溶剂或分散体介质。

可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

可通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。

可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和凝胶来实现。

通过将活性化合物以所需量加入具有以上所列举的多种其它成分的适当溶剂中，如果需要，随后通过过滤除菌来制备无菌可注射溶液。

通常，通过将多种无菌活性成分加入含有基础分散体介质和来自以上所列举那些的所需其它成分的无菌介质中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自之前其过滤除菌溶液的活性成分和任何额外所需成分的粉末。

还可预期制备用于直接注射的更加浓缩、或高度浓缩溶液，其中预期使用DMSO作为溶剂以得到极其快速的渗透、将高浓度活性剂递送至小的肿瘤区域。

配制时，溶液将以与剂型相容的方式和以治疗有效的量施用。容易地以多种剂量形式施用制剂，例如以上所述的可注射溶液类型，但也可使用药物释放胶囊等。

对于水性溶液的肠胃外施用，例如，如果需要，该溶液应适当缓冲并且首先应使液体稀释剂与足够的盐水或葡萄糖等渗。

这些特定的水性溶液特别适用于静脉内、肌肉、皮下和腹膜内给药。在这方面，可使用的无菌水性介质将根据本公开为本领域技术人员所已知。例如，可将一剂剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中并添加至1000ml皮下输液液体或在建议输液部位注射(参见例如，"Remington′s Pharmaceutical Sciences"，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。剂量的一些变化将取决于待治疗的受试者的病症而必然存在。负责施用的人将在任何情况下决定用于个体受试者的适合剂量。

可将本发明抗体配制入治疗混合物内以包含约0.0001-1.0毫克、或约0.001-0.1毫克、或约0.1-1.0或甚至约10毫克每剂量左右。也可施用多个剂量。除了配制用于肠胃外施用，例如静脉内或肌肉注射的化合物之外，其它药学上可接受的形式包括，例如片剂或其它用于口服施用的固体；时间释放胶囊；和目前使用的任何其它形式。

在某些实施方案中，预期使用脂质体和/或纳米颗粒用于将抗体引入宿主细胞。脂质体和/或纳米颗粒的形成和用途为本领域技术人员所已知。

纳米胶囊通常可以以稳定并可重复的方式捕获化合物。为了避免归因于胞内聚合过载的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(尺寸约0.1μm)。预期将符合这些要求的生物可降解的多烷基-氰基丙烯酸盐纳米颗粒用于本发明，并且这种颗粒可为易于制备的。

脂质体由分散于水性介质中的磷脂形成并自发形成层叠薄片同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm-4μm。MLV的超声波降解导致形成小单层囊泡(SUV)，直径为200-500A，核中含有水性溶液。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

用于产生本发明抗体的方法

本发明抗体可通过本领域任何已知的技术制备，例如，不限于任何化学、生物、遗传或酶技术，单独使用或结合使用。

已知所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可容易地通过用于产生多肽的标准技术来产生所述抗体。例如，它们可使用熟知的固相方法，优选使用可商购的肽合成设备(例如Applied Biosystems，FosterCity，California所生产的设备)并按照生产商说明书来合成。或者，本发明抗体可通过本领域所熟知的重组DNA技术来合成。例如，抗体可作为在合并将抗体编码入表达载体的DNA序列并将这种载体引入适当的表达所需抗体的真核或原核宿主之后的DNA表达产物来获得，随后可使用熟知技术从所述真核或原核宿主分离抗体。

特别地，本发明进一步涉及一种产生本发明抗体的方法，该方法包括以下步骤：

(i)在适于允许表达所述抗体的条件下培养根据本发明的转化宿主细胞；和

(ii)回收所表达的抗体。

在另一个具体实施方案中，该方法包括步骤：

(i)在适于允许表达所述抗体的条件下培养以CNCM I-4176、CNCM I-4177、CNCM I-4178、CNCM I-4179、或CNCM I-4180保藏的杂交瘤；和

(ii)回收所表达的抗体。

本发明抗体通过常规的免疫球蛋白纯化过程例如，蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、或亲和色谱从培养基合适地分离。

在一个具体实施方案中，本发明的人嵌合抗体可通过以下产生：获得如前所述的编码VL和VH域的核酸序列、通过将其插入用于具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞的表达载体来构建人嵌合抗体表达载体、和通过将表达载体引入动物细胞来表达该编码序列。作为人嵌合抗体CH域，其可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但那些IgG类是合适的，并也可使用属于IgG类的亚类之一，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，作为人嵌合抗体CL，其可以是属于Ig的任意区域，并可使用kappa类lambda类的那些。用于产生包含常规重组DNA的嵌合抗体的方法和基因转染技术为本领域所熟知(参见专利文件US5,202,238；和US5,204,244)。

本发明的人源化抗体可通过以下产生：如前所述，获得编码CDR域的核酸序列、通过将其插入用于具有编码(i)与人抗体的重链恒定区相同的重链恒定区和(ii)与人抗体的轻链恒定区相同的轻链恒定区的基因的动物细胞的表达载体来构建人源化抗体表达载体、和通过将表达载体引入动物细胞来表达基因。

人源化抗体表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分开的载体上的类型或其中两种基因存在于相同载体上的类型(串联型)。就构建人源化抗体表达载体的容易度、引入动物细胞的容易度、和动物细胞中抗体H和L链表达水平之间的平衡而言，优选串联型人源化抗体表达载体。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18等。

用于产生基于常规重组DNA的人源化抗体的方法和基因转染技术为本领域所熟知。可使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR-移植法(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596)、和链替换(美国专利号5,565,332)。用于制备这种抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。

本发明Fab可通过处理特异性地与ICOS和蛋白酶、木瓜蛋白酶反应的抗体来获得。此外，Fab可通过将编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统、或用于真核表达系统的载体、和将所述载体引入原核细胞或真核细胞(视情况而定)以表达Fab来产生。

本发明F(ab′)2可通过处理特异性地与ICOS和蛋白酶、胃蛋白酶反应的抗体来获得。

此外，F(ab′)2可通过经由硫醚键或二硫键结合如下所述Fab′来产生。

本发明Fab′可通过处理特异性地与人ICOS和还原剂，二硫苏糖醇反应的F(ab′)2来获得。此外，Fab′可通过将编码抗体Fab′片段的DNA插入用于原核细胞的表达载体、或用于真核细胞的表达载体，和将所述载体引入原核细胞或真核细胞(视情况而定)以进行其表达来产生。

本发明scFv可通过以下产生：获得如前所述的编码VH和VL域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入用于原核细胞的表达载体、或用于真核细胞的表达载体，和然后将所述表达载体引入原核细胞或真核细胞(视情况而定)以表达scFv。为了生成人源化scFv片段，可使用称为CDR移植法的熟知技术，其包括从供体scFv片段选择互补决定区(CDR)、并将它们移植于已知三维结构的人scFv片段框架上(参见例如W098/45322；WO 87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。

可预期本文描述抗体的氨基酸序列的修饰。例如，可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。已知当通过仅将源自非人类动物抗体VH和VL中的CDR简单接枝入人抗体VH和VL的FR来产生人源化抗体时，与源自非人类动物的初始抗体的抗原结合活性相比较，抗原结合活性降低。据认为，非人抗体VH和VL的若干氨基酸残基(不仅在CDR中而且在FR中)直接或间接地与抗原结合活性相关。因此，用源自人抗体VH和VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基会降低结合活性。

为了解决该问题，在移植有人CDR的抗体中，已尝试在人抗体VH和VL的FR的氨基酸序列中，识别与结合抗体直接相关、或与CDR氨基酸残基相互作用、或维持抗体的三维结构和与结合抗原直接相关的氨基酸残基。可通过用源自非人类动物的初始抗体的氨基酸残基替代已识别的氨基酸来增加降低的抗原结合活性。

可在本发明抗体的结构中，和在编码它们的DNA序列中进行修饰和改变，并仍然获得编码具有所需特性的抗体的功能性分子。在进行氨基序列的改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性为本领域所公知。公认氨基酸的相对亲水特性促进所得蛋白质的二级结构，其又限定了蛋白质与其它分子，例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。

已基于它们的疏水性和电荷特性指定每种氨基酸的亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；氨基乙酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸(-3.5)；天门酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本发明的进一步的实施方案还包含本发明抗体的功能保守性变体。

″功能保守性变体"为其中蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已改变、但未改变多肽的整体构造和功能的那些，所述改变包括，但不限于用具有相似性质(例如，极性、氢键合可能性、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸替代氨基酸。

蛋白质中除了被描述为保守的那些之外的氨基酸可不同，以致功能相似的任意两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可以变化并且如根据对比方案例如通过Cluster法所测定的可以是，例如70％-99％，其中相似性基于MEGALIGN运算法则。

"功能保守性变体"还包括如通过BLAST或FASTA运算法则所测定的具有至少60％氨基酸一致性的多肽，优选至少75％，更优选至少85％，仍然优选至少90％，和甚至更优选至少95％，其具有与其所比较的天然或母蛋白质相同或基本上相似的性质或功能。当在较短序列的全长内大于80％、优选大于85％、优选大于90％的氨基酸相同时，或大于约90％、优选大于95％相似(功能相同)时，两个氨基酸序列为"基本上同源的"或"基本上相似的"。优选地，相似或同源的序列通过使用例如GCG(Genetics Computer Group，Program Manualfor the GCG Package，Version 7，Madison，Wisconsin)堆积程序对比、或任意序列比较运算法则例如BLAST、FASTA等来鉴别。

例如，某些氨基酸可被蛋白质结构中的其它氨基酸取代而不存在可感知的活性损失。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物功能活性，所以某些氨基酸取代可在蛋白质序列中、和当然地在其编码DNA的序列中进行，而仍然获得具有类似性质的蛋白质。因此预期可在本发明的抗体序列、或相应的编码所述抗体的DNA序列中进行多种改变而没有可感知的其生物活性的损失。

本领域已知某些氨基酸可被其它具有相似亲水指数或得分的氨基酸取代而仍然得到具有类似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物功能相等的蛋白质。因此，如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。

考虑了多种上述特性的取代实例为本领域技术人员所熟知，并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。本发明抗体的另一种氨基酸修饰可用于改变抗体的初始糖基化方式。

"改变"是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个抗体中不存在的糖基化位点。

抗体糖基化典型地为N-连接。"N-连接"是指将碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中任何一个这些三肽序列的存在产生了潜在的糖基化位点。向抗体添加糖基化位点通常通过改变氨基酸序列以致其含有一种或多种以上所述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)来实现。另一种的共价修饰包括将葡糖苷用化学或酶法偶合至抗体。这些过程在它们不要求在具有用于N-或O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中生成抗体方面是有利的。取决于所使用的偶合模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基例如半胱氨酸的巯基、(d)游离羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基、(e)芳族残基例如苯丙胺酸、酪氨酸、或色氨酸的芳族残基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，这种方法描述于WO87/05330中。

可用化学或酶法实现存在于抗体上的任何碳水化合物部分的去除。化学去糖基化需要使抗体暴露于化合物三氟甲烷磺酸、或等价化合物。这种处理导致大多数或全部糖(除了连接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基半乳糖))的裂解，同时保持抗体完整。

抗体上碳水化合物部分的酶裂解可通过使用多种内和外糖苷酶实现。

抗体的另一种共价修饰包括将抗体以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所记载的方式连接至多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯。还可能需要就效应物功能修饰本发明抗体，例如以增强抗体的抗原-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过将一种或多种氨基酸取代引入抗体的Fc域实现。替代地或额外地，可将半胱氨酸残基引入Fc域，从而允许该域中形成链间二硫键。因此所产生的同型二聚抗体可具有改进的内在化能力和/或增加的补体-介导的细胞杀死和/或抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)(Caron PC.等J Exp Med.1992 Oct 1；176(4)：1191-5和Shopes B.J Immunol.1992May l；148(9)：2918-22)。

诊断方法

本发明还涉及一种诊断乳腺癌患者复发或早期死亡的风险增加的方法。事实上，如实施例3所示，高ICOS⁺ Treg细胞数目的存在与乳腺癌患者的较低无进展存活率或总存活率相关。

因此，本发明涉及一种用于诊断乳腺癌患者复发或早期死亡的风险增加的方法，包括在所述患者样品中定量ICOS阳性(ICOS⁺)Treg细胞的步骤。如果所述数目高，例如当使用实施例3和图9的方法时大于1.7ICOS⁺个细胞/点，则在所述乳腺癌患者中复发或早期死亡的风险增加。

本发明还涉及一种用于选择对抗ICOS免疫疗法治疗敏感的患者的方法，包括在所述患者样品中定量ICOS阳性Treg细胞的步骤。所述免疫疗法可以是根据本发明的抗ICOS抗体。

所述样品可来自活组织检查。所述ICOS⁺ Treg细胞的定量可借助抗ICOS抗体而进行，尤其是借助以上所述抗体的任何一种。

临床前乳腺肿瘤模型中的处理

如实施例6所示，用替代中和大鼠抗小鼠ICOS抗体(17G9，IgG2b)处理已建立的小鼠乳腺肿瘤模型，降低了肿瘤进展，增强用本发明抗ICOS中和抗体处理的效力以促进在其原发性乳腺肿瘤中具有高ICOS⁺ Treg检测值的患者亚群中肿瘤的衰退。

本发明将进一步通过以下附图和实施例来阐述。

附图说明

图1：Ta-Treg强烈表达ICOS，与Ta-pDC共定位并且原位增殖但不体外增殖。

A-将肿瘤冷冻切片用抗ICOS Ab(绿色)和Ki67 Ab(棕色)染色并且将第二抗鼠Ab结合HRP并且分别用histogreen和DAB显色(插入的框为放大10x和40x)。

B-Ki67表达在原发性肿瘤(Ta-Treg，Ta-Tconv)或配对的血液(Treg，Tconv)内在Treg(CD4⁺CD127^-CD25^高)和Tconv(CD4⁺CD127⁺CD25^低/-)上通过多色流式细胞仪分析。

C-将来自原发性肿瘤或健康血液的纯化的Treg和Tconv在500UI/ml的IL-2存在下在96孔U形底板中培养。通过计算每四天量化细胞数目。

D-F肿瘤冷冻切片用抗CD3Ab(棕色)染色并且用苏木精(蓝色)复染色(在插入的框中20x和40x)(D)；CD3Ab(绿色)和BDCA2(棕色)(在插入的框中20x和40x)(E)；FoxP3Ab(棕色)和BDCA2(绿色)(在插入的框中20x和40x)(F)。

图2：ICOS和ICOS-L阻断中和了在pDC介导的T细胞激活期间IL-10的分泌而不强烈地干扰MoDC/T共培养。纯化和R848激活的pDC或MoDC与异源记忆CD4⁺ T细胞在对照Ab、抗ICOS(314.8)或抗ICOS-L(MIH12)的存在下共培养5天。在第5天，在来自pDC/T共培养(A)和MoDC/T共培养(B)的上清液中通过ELISA量化IL-10和IFNγ。

图3：在外源IL-2存在下，ICOS和CD3共刺激促进Treg和Tconv增殖以及IL-10但不是IFNγ的分泌。

A/B-将从扁桃腺流出的FACS-分选的Treg或Tconv在IL-2(n＝3)存在下单独培养5天或与包被有CD3/IgG、CD3/88.2、CD3/CD28激动剂mAb的珠一起培养5天。通过[³H]-胸腺嘧啶核苷结合(A)评价增殖。在培养上清液中通过ELISA测量IL-10和IFNγ水平(B)。

C-将从肿瘤分选的CD4⁺ TaT细胞在外源IL-2(100UI/m1)存在下与包被有抗CD3/IgG、抗CD3/88.2或抗CD3/抗CD28的珠一起培养5天。上清液中IL-10和IFNγ的浓度通过ELISA量化。

图4：ICOS结合阻断CD28-诱导的IL-2并且因此降低增殖和IFNγ分泌

A-将CFSE标记的CD4⁺记忆T细胞与不同的珠单独培养5天或在梯度浓度的外源rhIL-2(20UI/ml和100UI/ml)存在下培养5天并且通过流式细胞仪由CFSE稀释物评价增殖。

B-与不含外源IL-2的不同的珠经过5天培养之后通过ELISA检测IL-2。

C-将来自健康供体的血液CD4⁺记忆T淋巴细胞与不同的珠单独培养5天或在外源IL-2(100UI/ml)存在下培养5天。通过ELISA量化IL-10和IFNγ分泌。

图5：在乳腺肿瘤细胞系和原发性乳腺肿瘤撕裂物(dilaceration)上不存在ICOS-L的表达

A-在不存在胰蛋白酶以避免Ag降解的情况下在PBS-EDTA中收获的乳腺肿瘤上皮细胞系的悬浮液上通过流式细胞仪评价ICOS-L表达。

B-在对照Ab(虚线)或抗ICOS Ab(314.8)(连续线)的存在下经过48小时培养之后的肿瘤细胞(CD45-细胞)上评价ICOS-L表达。

图6：用替代大鼠抗-小鼠抗ICOS Ab(17G9，IgG2b)处理原发性Neu15乳腺肿瘤减缓了肿瘤生长。

图7：

A：在原发性宫颈癌内Treg细胞数目增加。

B：在原发性宫颈癌内Treg细胞ICOS+增加。

图8：在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中表达ICOS的Treg的增加

HD 霍奇金疾病

FL 滤泡性淋巴瘤

DLBCL 弥漫性大B细胞淋巴瘤

MCL 套细胞淋巴瘤

MZL 边缘区淋巴瘤

图9：在原发性乳腺肿瘤内ICOS⁺ Treg细胞的存在对存活率具有负面影响

使用商业抗ICOS兔多克隆Ab测试120种石蜡包埋的原发性肿瘤样品(具有10年临床随访)的它们的ICOS表达。在六个不同的点上评价ICOS+细胞的平均值。为了进行统计分析，中位数用作截止值以具有平衡的组。显示了根据在原发性肿瘤中ICOS存在的ICOS表达对于总存活率(A)或无进展存活率(B)的影响。

具体实施方式

实施例1：根据本发明抗体的表征

材料和方法

I.细胞生物学

1-选择/细胞纯化

*外周血单核细胞的分离

从健康志愿者(Etablissement Francais du sang，Marseille，法国)的外周血干细胞移植通过淋巴制剂梯度(Abcys)分离PBMC(外周血单核细胞)。在管中：将2/3的血液逐滴沉积在1/3的淋巴制剂上并且在20℃下以2000rpm离心20分钟，不加速以不干扰梯度。离心之后，回收单核细胞并且在20℃下以1000rpm在PBS 1％FCS(胎牛血清)+肝素中洗涤两次20分钟。

随后立即使用细胞或在-80℃下在RPMI 1640 50％FCS 10％DMSO(二甲亚砜)中冷冻至50.10⁶个细胞/ml。24小时之后，将细胞转移到氮气下保存。

*CD4的阴性选择

CD4+ T淋巴细胞由PBMC纯化。解冻之后，将细胞洗涤并且在40μL的分选缓冲液(PBS 0.5％BSA 2mM EDTA)中稀释至10.10⁶个细胞。使用试剂盒MACS人CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)：添加10μL结合生物素(第一标记)的单克隆抗体溶液并且将混合物在搅拌下在4℃下温育10分钟。随后将细胞在搅拌下在4℃下与20μL与抗生物素(第二标记)偶合的磁珠接触15分钟。在用分选缓冲液洗涤之后，将细胞分选至Automacs(Miltenyi)。随后分离在CD4+T标记的细胞中耗尽的阴性级分。这提供CD+4群体的纯度为约95％。

2-激活和细胞培养

*用珠CD3/CD28预激活并且随后用mAb刺激

在珠CD3/CD28(Dynabeads，Invitrogen)(1个细胞/1个珠)的存在下将CD4+T细胞放入10⁶个细胞/mL RPMI 10％FCS的浓度中并且在37℃下温育48小时。随后用磁铁将细胞与珠分离并且以10⁶个细胞/ml的浓度在RPMI 10％FCS中Dynal Biotech静置过夜。

另一方面，将mAb抗-CD3(OKT3)、抗-ICOS(ICOS 88-2)和对照IgG1mAb(Sigma)在4℃下包被到96平板孔上过夜。所述孔包被有50ng/ml的抗-CD3，其在其它mAb中补充有20μg/mlPBS 1X 100μL/孔。第二天，将平板用PBS洗涤，用PBS 5％FCS(200μl/孔)饱和两小时。将具有之前合并的CFSE的CD4+T细胞(参见以下)以2105个细胞/200μL的介质/孔的速率分配在包被的板上并且在37℃下温育72小时。在48小时收集上清液并且在72小时收集细胞以通过流式细胞仪分析增殖(图4)。

*人造APC的激活

将磁珠(Dynabeads M-450Epoxy，Invitrogen)在0.1M磷酸钠缓冲液中洗涤，并且随后与1mg/1.10⁷个珠的次优浓度(代表5％的mAb与珠偶合)的mAb抗-CD3(OKT3)、与mAb抗-CD28或ICOS(ICOS 88-2或CD28.2)(2μg/1.10⁷个珠，10％)温育。这些人造的APC与mAb以缓慢旋转在4℃下温育过夜。第二天，在PBS 0.1％BSA中进行两次洗涤。将人造的APC分配到一个珠上用于在96圆板孔中的细胞，在该孔上沉积了2.10⁵个淋巴细胞T CD4+/200μl/孔，并且随后在37℃下温育72小时。所述CD4+ T细胞具有之前合并的CFSE。在48小时收集上清液并且在72小时收集细胞以通过流式细胞仪分析增殖。

3-细胞增殖

淋巴细胞的增殖之后是CFSE(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯)(Molecular Probes，Invitrogen)。CFSE是细胞可渗透的并且是非荧光性的。当进入细胞时，酯酶切割乙酸基，其变得荧光性而细胞变得不可渗透。

CFSE的特性是在每一次分裂时在每一个新形成的细胞中均匀地分享。其发出绿色辐射允许同时分析细胞的数目、位置和分化阶段，每个细胞的荧光强度与CFSE的浓度成比例。为了标记具有CFSE的细胞，将细胞悬浮液在冷的1X PBS中稀释。加入CFSE：5μM至10.10⁶个细胞。随后将该细胞置于37℃的水浴中。

在8-1O分钟的搅拌之后，将细胞快速置于冰上以停止反应。随后将细胞用2ml的PBS 1X离心两次。最后，在所需体积的RPMI 10％FCS中收集它们用于培养。通过流式细胞仪测定增殖。

II-流式细胞仪

在4℃下将在96孔板中的CD4+细胞用30％BSA PBS(50μL/孔)稀释10分钟以饱和非特异性位点。随后将它们在黑暗中在4℃下温育30分钟，其中所需抗体结合荧光染料。在PBS 1X 1％BSA 0.02％叠氮化物中洗两次后(离心2100rpm，3分钟，在4℃下)，将细胞固定在200μL的PBS 2％甲醛中并且置于流式细胞仪中(FACS Canto，BD Biosciences)。结果通过FlowJo软件分析。

IIl-ELISA(酶联免疫吸附试验)

在48小时收集CD4+T细胞的培养物上清液并且在-20℃下存储用于分析IL-10、IFNγ和TNFα。

结果

1-抗-ICOS mAb的表征

发明人研发了5种抗-ICOS Ab。它们的同型通过ELISA分析。为了获得它们对于它们受体的亲和性的间接分析，使用表达ICOS的稳定的转染子测试mAb。JICOS.1细胞处于逐渐增加浓度的用偶合荧光染料的探针(PE-GAM：山羊抗小鼠-PE)标记的抗-ICOS mAb中，并且通过流式细胞仪进行分析。

因此，可以测定ED 50，即50％的位点饱和的mAb的浓度。具有最低ED50的mAb是具有最高表观亲合力的那些。

随后发明人测试了抗-ICOS mAb抑制通过JICOS.1细胞携带的ICOSL(人IgG1 Fc结构域的重组形式)的结合的能力。

他们使用了抗-ICOS mAb的浓度梯度并且他们通过偶合荧光染料的探针(PE-GAM：山羊抗人-PE)显示了与ICOS L Fc的固定。通过流式细胞仪进行分析。因此，发明人测定了ID 50，即抑制50％的ICOS L-Fc在ICOS上的结合的剂量。

ID 50越小，mAb与重组ICOS Fc的竞争越容易。

因此，发明人证实ICOS R 314-8和ICOS R 53-3对于它们的结合位点具有高度亲和力(ED 50＜0.5ug/ml)和显著的阻断潜力(ID 50＜1mg/ml)。

因此，选择抗体ICOS R 314-8与荧光染料Alexa Fluor 647偶合并且用于流式细胞仪分析。

2-抗-ICOS mAb在它们通过激活的CD4+T细胞诱导IL-10的产生的能力上的差异

发明人测试了mAb用作激动剂抗体的能力，即使用功能性测试能够与ICOS的天然配体具有相同的作用。研究的参数是IL-10的分泌，因为ICOS通过LT诱导IL-10的产生。

在CD4+T细胞上测试了抗-ICOS mAb的激动性潜力，所述CD4+T细胞用CD3/CD28珠预活化48小时并且分配到平板上，其中包被抗-CD3mAb用于与多种抗-ICOS mAb一起继续刺激。

随后测试培养物上清液的IL-10 48小时并且基于通过可商购的抗-ICOS mAb(ICOS c)诱导的IL-110的分泌比较通过不同的抗-ICOS mAb诱导的IL-10的分泌。

抗-ICOS mAb 53-3、88-2和92-17显著地增加了CD4+的IL-10分泌并且因此是激动剂抗体。关于抗-ICOS mAb 145-1和314-8，没有检测到IL-10产生的显著增加。

发明人最终表明，与可商购的抗-ICOS相比，抗-ICOS mAb 53-3、88-2和92-17是更好的激动剂。事实上，如果考虑可商购的抗-ICOS mAb作为参考，抗-ICOS mAb 88-2引起IL-10的分泌增加+61％，抗-ICOS mAb 92-17为+20％和抗-ICOS mAb 53-3为+14％。

结果在下表中总结：

实施例2：本发明拮抗剂抗体和本发明激动剂抗体的用途

材料和方法

免疫组织化学

冷冻的原发性乳腺肿瘤切片用小鼠抗-FOXP3或抗-Ki67染色并且根据供应商的说明书和DAB使用ImmPRESS抗-小鼠Ig过氧化物酶试剂盒(Abcys，巴黎，法国)显色。随后加入第二一抗(小鼠抗-ICOS(53.3)、抗-CD3、抗-BDCA2)并且随后用ImmPRESS试剂盒和Histogreen(Abcys)显色。染色的特异性使用小鼠同型对照代替第一和第二一抗来评价。

来自乳腺肿瘤、扁桃腺和健康血液的单核细胞的纯化

由EFS获得的健康外周血液或由原发性乳腺肿瘤或扁桃腺样品的酶撕裂物通过Ficoll密度梯度离心法纯化单核细胞(MNC)。

pDC和T细胞亚群的表型分析

为了进行广泛的表型分析，使用对抗CD40、CD86或ICOSL的FITC或PE抗-CD123和PE-Cy5抗-CD4和PE-偶合的抗体在全部MNC中将pDC鉴别为CD4⁺CD123⁺细胞。T细胞鉴别为CD3⁺CD4⁺细胞。通过多色表型CD4⁺CD127^-CD25^高鉴别Treg或基于FoxP3在CD3⁺CD4⁺ T细胞上的表达从而鉴别Treg。

Ta-Treg和Ta-Tconv或它们的血液配对物的增殖通过多色分析评价，允许与KI67 Ab染色相关的Treg CD4⁺(CD127^-CD25^高)和TconV(CD4⁺CD127⁺CD25^低/-)表征。在FACScan(BD Biosciences)或ADP Cyan(Beckman Coulter)上进行流式细胞仪分析并且用Cell Quest Pro软件(BD Biosciences)或FlowJo(Treestar)分析数据。

pDC的纯化

由谱系(Lin)-阴性富集的MNC通过使用CD304/BDCA-4微珠试剂盒的磁性激活的细胞分选或通过使用pDC分离试剂盒(Miltenyi Biotec)或-分选(FACSVantage SE^TMDiVa流式细胞仪，BD Biosciences)作为Lin^-CD4⁺CD11c^-细胞的阴性贫化来纯化pDC。纯度常规地大于98％。

单核细胞衍生的DC(MoDC)的体外生成

MoDC由在GM-CSF(100ng/ml)+IL-4(50UI/ml)(Schering Plough，Kenilworth USA)分化七天后的血液纯化的单核细胞获得。

CD4⁺记忆T细胞和Treg纯化

记忆CD4⁺ T细胞(＞95％的纯度)由在磁损耗之后包括抗-CD45RA Ab的MNC获得，如在Gobert等，2009中描述。CD4⁺CD25^高CD127^-Treg和CD4⁺CD25^-CD127^低/+常规CD4⁺ T细胞由纯化的记忆CD4⁺ T细胞(纯度＞98％)-分选。

为了跟踪它们的体外增殖，在第0天用CFSE染色纯化的记忆CD4⁺ T细胞。在细胞透化的情况下，通过DAPI排除或LIVE和DEAD试剂选择活细胞(分别在全部细胞群体和在纯化细胞上选通200000和5000个最低事件)。

DC-T细胞共-培养

将异源记忆CD4+ T细胞、Treg或CD4+ Tconv细胞以3x10⁴至5x10⁴个细胞在含有IL-2(100IU/ml)和高度纯化的TApDC、健康的pDC或MoDC(其在R848存在下用IL-3、GM-CSF(10ng/ml)预先激活24小时)的完全介质中培养。以1∶5的比例(DC/T细胞)一式三份地在96-孔圆底板中进行在预先激活的DC亚群上添加T淋巴细胞，并且共培养5天。或通过在分析FoxP3表达的实验中的CFSE稀释物或通过由³H-TdR吸收分析的DNA合成来评价增殖。

通过在培养物中添加对照Ab、商业的(ISA-3)或私有的(314.8)抗ICOS Ab或抗ICOSL(MIH12)来评价ICOS/ICOSL结合的影响。为了通过ELISA评价T细胞细胞因子分泌，将细胞与pDC或TapDC共培养，并且将第5天收获的上清液离心并且在-20℃下储存。

用人造珠刺激Tconv和Treg

人造APC如实施例1所描述产生。将从肿瘤纯化的扁桃腺或Ta-CD4⁺ T细胞(1x10⁵)分选的Treg(3x10⁴)或Tconv(1x10⁵)与人造珠以1∶1(人造APC∶T细胞)的比例在IL-2(100UI/ml)存在下在200μl的96U型底孔中培养5天。通过CFSE稀释物或通过由³H-TdR吸收分析的DNA合成来评价增殖。

通过ELISA在T细胞培养物上清液中检测细胞因子

根据制造商的说明书使用来自Bender Medsystems的商业试剂盒通过ELISA量化5天培养物上清液中的IL-10、IFNγ和IL-2。

结果

以下呈现的数据旨在分析由发明人研发的对抗ICOS的两种抗体(即，阻断MAb 314.8；激动剂MAb88.2)的影响以确认：

i)通过对抗性的314.8MAb阻断ICOS作为新的有希望的候选药物以中和在乳腺癌中观察到的免疫抑制响应；和

ii)通过CD4⁺ T细胞上的激动剂88.2MAb结合ICOS结合以促进在自身免疫领域中感兴趣的Treg的扩增。

高度表达ICOS的Ta-Treg在原发性乳腺肿瘤中淋巴聚集体内存在并且原位增殖

发明人之前已经证明了在原发性乳腺肿瘤中淋巴聚集体内表达CD25^高和FoxP3的肿瘤相关的调节性T细胞(Ta-Treg)的存在与差的预后和转移风险的增加相关(Gobert等，2009)。这些Ta-Treg代表了15％至25％的总CD4⁺ TaT细胞，是高度活化的，因为它们表达ICOS、CD39、GITR和HLA-DR并且抑制TaTconv增殖和细胞因子分泌(IL-2、IFNγ)。

这些Ta-Treg在原发性乳腺肿瘤环境内原位增殖(Gobert等，2009)，如通过在肿瘤冷冻切片上的共表达Ki67的ICOS⁺ Treg的存在(图1A)证实或通过与Ta-Tconv和Tconv(分别为3％和0.3％)相比，在由血液纯化的Ta-Treg和Treg内较高比例的KI67⁺细胞证实(图1B)。

与这些体内结果相比，发明人证明了相比于在来自健康供体的血液的纯化的TaTconv或纯化的Treg或Tconv中所观察到的，用膨胀珠(包被有激动剂抗CD3和抗CD28的珠)体外刺激纯化的Ta-Treg不能够促进Ta-Treg扩增(图1C)。

发明人猜测ICOS结合对于Ta-Treg增殖和功能是重要的。

A)本发明拮抗剂抗体的用途

通过拮抗剂ICOS mAb(314.8)阻断ICOS/ICOS-L相互作用

在原发性乳腺癌中淋巴聚集体内Ta-Treg与Ta-pDC原位相互作用

许多研究报道了ICOS-L(ICOS的特异性配体)在pDC上的表达(Janke等，2006)。在肿瘤冷冻切片上使用免疫组织化学，发明人观察到在包围肿瘤的淋巴聚集体内存在的Ta-CD3⁺ T细胞与Ta-pDC BDCA2⁺相互作用(图1D和1E)。用FoxP3和BDCA2 Ab双重染色表明，在这些淋巴聚集体中Ta-Treg与Ta-pDC紧密接触，提示这种相互作用将促进在肿瘤中ICOS被ICOS-L结合(图1F)。

Ta-pDC被激活但不表达ICOS-L，作为原位ICOS/ICOS-L相互作用的潜在结果

在由肿瘤分解纯化之后，Ta-pDC显示激活的表型，因为相比于健康血液和匹配的患者血液pDC，它们表达了上调水平的CD86和CD40。如通过几个小组所报道(Ito等，2007，Janke等，2006)，新鲜分离的健康血液pDC表达低水平的ICOS-L，其在IL-3暴露或TLR7/8连接之后强烈地不受控制，这在其它DC亚群(mDC，MoDC)上没有观察到。有趣的是，与它们激活的状态(CD86⁺CD40⁺)相比，Ta-pDC缺乏膜ICOS-L表达。相反，新鲜分离的配对患者的血液pDC或健康血液pDC表达ICOS-L。在IL-3中或在TLR7/8结扎上24小时的培养时期之后，分选的Ta-pDC重新获得强烈的ICOS-L表达，证明它们对于调节这种ICOS-L表达的能力(数据未示出)。在CD3⁺ TaT细胞之中，相比于TaTconv(23％MFI：83)或TaCD8⁺(2％MFI：50)，ICOS在Ta-Treg上强烈地表达(69.9％MFI：361)。这些结果表明原位ICOS/ICOS-L相互作用导致ICOS-L在Ta-pDC膜上的下调。

通过对抗性的抗-ICOS MAb(314.8)阻断ICOS/ICOS-L的相互作用中和ICOS-L在pDC上的下调

为了测试这种假设，将健康血液T细胞与由扁桃腺纯化的TLR7-激活的pDC一起培养。发明人观察到在T∶pDC比例增加的24小时培养时期之后，在pDC上剂量依赖性的ICOS-L下调。有趣的是，添加我们的对抗ICOS(314.8)拮抗剂MAb在pDC上完全中和了这种ICOS-L下调，使用商业抗ICOS抗体(ISA-3)不能再现这种结果(数据未示出)。

结果证明了通过ICOS/ICOS-L的Ta-pDC和Ta-Treg相互作用，并且表明ICOS结扎可以参与Ta-Treg活化并且增殖。

CD4⁺ T细胞以及用激活的pDC但不是MoDC纯化的Treg的共培养诱导用314.8阻断的Treg增殖

为了测试ICOS/ICOS-L相互作用诱导Treg扩增的能力，发明人用健康血液纯化的异源TLR7/8(R848)-激活的pDC或mDC培养全记忆CD4⁺ T细胞。在纯化的CD4⁺ T细胞当中，3.5％表达FoxP3(数据未示出)。在用pDC共培养5天后，对应于treg的FoxP3^高表达细胞的比例升高到12.3％并且添加314.8Ab在FoxP3^高细胞中阻断80％的这种富集。相反，CD4⁺ T细胞与激活的mDC的共培养不能够促进在CD4⁺ T细胞中不同的FoxP3^高亚群体，并且添加314.8没有显著的效果(6.3％对8％)。

对于由肿瘤纯化的CD4⁺ T细胞获得了类似的结果。Ta-Treg Foxp3⁺代表9％的新鲜纯化的CD4⁺ TaT细胞(数据未示出)。它们与R848激活的pDC的共培养将Ta-Treg的比例增加至14.5％，而添加314.8导致Ta-Treg比例减少至4.5％，低于起始水平。

用CFSE染色的FACS分选纯化的Treg或Tconv群体与R848-激活的pDC或LPS-激活的MoDC一起培养以通过流式细胞仪分析它们的增殖能力(CFSE表达的稀释)。首先，发明人观察到，在不存在外源IL-2下，激活的MoDC不诱导纯化的Treg增殖，而Tconv强烈地增殖。相反，用激活pDC共培养能够诱导纯化的Treg和Tconv均强烈地增殖。

当pDC用作APC时，添加抗-ICOS314.8MAb强烈地降低了Treg和Tconv增殖，而Tconv增殖在与MoDC的共培养中没有改变。在该实验中，用商业抗体(ISA-3mAb或MIH-12MAb)阻断的ICOS或ICOS-L不影响在pDC/T共培养中Treg或Tconv的增殖。

这些数据表明抗-ICOS 314.8MAb中和了ICOS在Treg上的结合并且中和取消了它们通过pDC诱导的扩增。

ICOS和ICOS-L阻断取消了在pDC介导的T细胞激活期间的IL-10分泌而不强烈地干扰MoDC/T共培养

314.8MAb还降低了响应激活的pDC刺激的Tconv增殖。发明人通过Elisa确定了在Tconv和异源R848激活的pDC(图2A)或和LPS激活的MoDC(图2B)共培养期间314.8对IFNγ和IL-10分泌的影响。在这些设置中，IL-10分泌完全被314.8mAb取消(在对照中为217+/-31pg/ml和用314.8时为13+/-6pg/ml)。然而，在将314.8MAb添加到与pDC的共培养物上时IFNγ分泌略有降低(在对照条件下32％降低507+/-53pg/ml和用314.8时为341+/-73pg/ml)(图2A)。在Tconv/MoDC共培养物中，ICOS抑制导致IL-10和IFNγ分泌略微增加(图2B)。

B)根据本发明激动剂抗体的用途

使用激动剂抗ICOS MAb(88.2)来模拟ICOS结合

为了完美的理解ICOS对Treg和Tconv的功能，发明人使用用包被有激动剂MAb的珠建立了人造APC的模型，导致在纯化的T细胞上发出CD3(OKT3)、CD28(CD28.2)和/或ICOS(88.2，表1)的信号。

ICOS与激动剂MAb(88.2)在Treg上的结合诱导的它们的增殖和分泌大量IL-10的能力

首先，发明人观察到来自健康供体的Treg在外源IL-2存在下响应抗CD3/88.2珠而增殖(图3A)。如之前所报道(Simpson等，2010；Ito等，2008)在IL-2存在下通过TCR和ICOS结合激活时，纯化的Tconv和Treg亚群二者均分泌大量的IL-10(分别为311+/-22pg/ml和426+/-48pg/ml)和低水平的IFNγ(205+/-8pg/ml和381+/-12pg/ml)。该结果与使用抗CD3/抗CD28珠获得的数据不同。在该模型中，Tconv分泌大量的IFNγ(1213+/-72pg/ml)和低水平的IL-10(69+/-58pg/ml)，而Treg分泌IL-10和低水平的IFNγ(分别为422+/-36pg/ml和305+/-31pg/ml)(图3B)。

由肿瘤纯化的T细胞的类似实验表明CD4⁺ TaT细胞响应ICOS和CD28产生了类似水平的IL-10，而与CD28结合相比，响应于ICOS的IFNγ的水平较低(图3C)。

ICOS结合阻断CCD28-诱导的IL-2并且因此降低增殖和IFNγ分泌

然而，CD4⁺记忆T细胞响应独立于外源IL-2的抗CD3/抗CD28刺激而增殖，没有观察到响应抗CD3/88.2刺激的增殖(图4A)。hIL-2的添加以剂量依赖性方式救济了这种增殖。有趣的是，与仅CD28结合比较，在不存在IL-2的ICOS和CD28共结合显著降低了CD4⁺记忆T细胞的增殖，并且在100UI/ml IL-2存在下完全被救济。有趣的是，通过88.2mAb的ICOS连接(ligation)取消了用抗CD3/抗CD28刺激检测的IL-2分泌(图4B)。总而言之，与仅CD28结合相比较，这表明促进当ICOS和CD28共结合时自发的IL-2分泌的降低，提示ICOS对CD28-诱导的IL-2分泌的抑制功能。

此外，甚至在外源IL-2存在下，发明人观察到当触发ICOS和CD28时，与抗CD3/抗CD28珠相比，由Tconv产生的IFNγ降低了50％(图4C)。

相反，当细胞在ICOS触发下激活时IL-10分泌是严格地IL-2依赖性的，如之前所述(Ito 2008，Paulos 2010)，添加ICOS信号不影响通过抗CD3/抗CD28诱导的IL-10分泌(图4C)。

总而言之，这些结果表明ICOS连接降低了抗CD3/CD28促进Th1极化的能力(通过降低的IFNγ产生)，但维持IL-10产生，促进免疫抑制环境的发展。

ICOS通过88.2MAb结合增加Treg抑制功能

为了评价ICOS结合可以与免疫抑制T细胞响应相关，发明人在不存在外源IL-2的情况下设置了抑制试验以比较抗CD3/抗CD28/IgG和抗CD3/抗CD28/88.2珠的效率。与抗CD3/抗CD28/IgG1相比，ICOS信号(88.2)的添加强烈地增加了Treg的抑制功能(与抗CD3/抗CD28/IgG1的21％的抑制相比，在一个Treg用于4个Tconv抗CD3/抗CD28/88.2的情况下为51％的抑制)。全部这些结果表明ICOS结合促进免疫抑制T细胞响应，这可以由Tconv对抑制的敏感性增加或更强的Treg抑制能力引起。

实施例3：在原发性乳腺肿瘤内ICOS⁺ Treg细胞的检测的预后影响的分析

使用商业抗ICOS兔多克隆Ab(Spring Biosciences)测试120种石蜡包埋的原发性肿瘤样品(具有10年临床随访)的它们的ICOS表达。对于每一种肿瘤在六种不同的复制品上以双盲的方式将ICOS⁺细胞量化并且汇集结果的平均值(数据未显示)。为了进行统计分析，发明人使用了中位数作为截止值以具有平衡的组。

在单因素分析中，发明人表明ICOS⁺细胞的存在(＞1.66ICOS⁺个细胞/点)与高的肿瘤等级(p＝0.007)、肿瘤细胞的雌激素受体的表达(p＝0.018)、细胞腔A/B分子亚型(p＜0.001)和不存在Her2/neu过度表达(p＝0.035)相关。

研究了在原发性乳腺肿瘤内的ICOS⁺细胞检测对总存活率(OS)或无进展存活率(PFS)的影响。

而在ICOS-组中观察到6/59死亡，在ICOS⁺中14/61患者死亡，表明在OS上显著的ICOS⁺检测预后值(Log Rank测试p值＝0.0465)(图9A)。在PFS上进行的类似分析表明ICOS⁺细胞与较差的总存活率相关，在ICOS^-组中进展为11/59，而在ICOS⁺组中进展了20/61患者(p＝0.0285)(图9B)。

实施例4：在肿瘤环境中pDC与ICOS⁺ Treg的原位相互作用的存在的确认

肿瘤细胞撕裂物在抗ICOS 314.8MAb或对照Ab的存在下在IL-3(20ng/ml)的存在下体外共培养48小时。在培养时期结束时，仅在抗ICOS 314.8MA的存在下观察到ICOS-L在pDC上的表达，并且在对照Ab中未观察到，表明ICOS-L在pDC上的下调通过与ICOS⁺细胞的相互作用介导(数据未显示)。

实施例5：对比黑色素瘤或神经胶质瘤肿瘤细胞，来自建株的细胞系或新鲜肿瘤样品的上皮乳腺肿瘤细胞不表达ICOS-L，甚至在用抗ICOS抗体314.8体外培养之后。

在PBS EDTA中收获乳腺上皮肿瘤细胞系以避免胰蛋白酶相关的Ag降解，并且用抗ICOS-L抗体染色细胞以通过流式细胞仪评价细胞表面的表达。对于ICOS-L，没有一个测试的细胞系发现为阳性(图5A)。类似的分析在抗ICOS Ab(314.8)或对照Ab加IL-3(20ng/ml)的存在下在培养48小时的原发性肿瘤分解物上进行。(图5B)

实施例6：代大鼠抗小鼠抗ICOS Ab(17G9，IgG2b)对同基因乳腺肿瘤模型中乳腺肿瘤的生长的影响

小鼠乳腺肿瘤模型在原位注射Neu 15细胞系之后28-35天的雌性FVB小鼠中获得。产生的肿瘤明显被激活的Ta-pDC、ICOS^高TATreg和休眠的TATconv渗透。

从肿瘤植入后第11天开始每周三次腹膜内注射17G9抗体(50μg/ml)，与注射对照Ab(LTF2，IgG2b)相比，在晚的时间点导致Neu15肿瘤尺寸缩小(p＝0.053)(图6)。

实施例7：A：Treg细胞数目在原发性宫颈癌内增加

宫颈样品从患有发育不良(CIN2/3，n＝18)或癌症(n＝14)的患者获得。使用正常宫颈组织作为对照(n＝11)。通过酶法和物理法分离获得样品。在洗涤之后，用标记的mAb和枚举为CD127^低CD25^亮CD4⁺ T细胞的Treg温育单核细胞。描述了CD4⁺亚群内的Treg百分数。对比正常组织和发育不良，Treg在宫颈癌样品中增加。因此，这种增加与癌症发展相关(图7A)。

B：Treg细胞ICOS⁺在原发性宫颈癌内增加

宫颈样品从患有发育不良(CIN2/3，n＝5)或癌症(n＝12)的患者获得。使用正常宫颈组织作为对照(n＝5)。通过酶法和物理法分离获得样品。在洗涤之后，用使用ICOS标记的mAb和枚举的Treg温育单核细胞。描述了CD4⁺亚群内的Treg ICOS的百分数。由于所分析样品的限制数目，在组织内存在ICOS⁺ Treg，其中仅在宫颈癌中表现出它们增加的趋势(图7B)。

实施例8：在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中表达ICOS的Treg的增加

发明人已经分析了在LNH样品中的Teg数目和ICOS在Treg上的表达。在知情同意下从45名患者收集从淋巴结取出的新鲜淋巴瘤细胞。淋巴瘤样品对应于霍奇金疾病(HD，n＝11)、滤泡性淋巴瘤(FL，n＝13)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL，n＝10)、套细胞淋巴瘤(MCL，n＝5)和边缘区淋巴瘤(MZL，n＝6)。通过在4℃下用抗-ICOS-PE(Becton Dickinson^TM)、抗-CD3-ECD、抗-CD4-Pacific Blue(Beckman)、抗-CD127FITC，抗-CD25 APC-Cy7和可固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen^TM)温育20分钟进行Treg细胞的检测。染色后，将每一个细胞制剂在PBS中洗涤两次，用2％的多聚甲醛固定并且在FACS LSR2流式细胞仪(Becton Dickinson^TM)上分析。使用FlowJo软件(TreeStar^TM)分析数据。除了HD，Treg在所有的淋巴瘤样品中增加。对比对照淋巴结，大多数Treg显示ICOS表达增加。(图8)

实施例9：Icos 314.8(CNCM I-4180)的测序

总RNA从提供的冷冻的杂交瘤细胞提取并且合成了cDNA。随后，进行RT-PCR以扩增MAb的可变区(重链和轻链)。分别将重链和轻链的MAb可变区克隆到克隆载体中，随后分析获得的序列以推断MAb的序列。

材料

杂交瘤细胞ICOS 314.8(CNCM I-4180)；Plus RNA纯化系统(Invitrogen，Cat.No：15596-026)；SuperScript^TM III第一链合成系统(Invitrogen，Cat.No：18080-051)。

方法

总RNA提取

根据Plus RNA纯化系统的技术手册从杂交瘤细胞分离总RNA。通过凝胶电泳检查总RNA。

RT-PCR

使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA反转录成cDNA，并且整个过程根据SuperScript^TM III第一链合成系统的技术手册进行。抗体片段将根据GenScript的RACE方法的标准操作草案来扩增。

抗体基因的克隆

根据标准分子克隆过程，单独地将抗体基因的目标PCR产物克隆到克隆载体中。

筛选和测序

采用群体筛查来筛选具有正确尺寸的插入的克隆，并且对于每一个抗体片段测序不少于10个独立的阳性群体。

结果和分析

总RNA提取

样品的总RNA在1.5％琼脂/GelRed TM凝胶电泳上与DL3000DNA标志物一起运行。

抗体基因的PCR产物

4μl的各个样品的PCR产物在1.5％琼脂/GelRed TM凝胶电泳上与DL3000 DNA标志物一起运行。

测序结果和分析

测序结果如下。共有DNA序列和相应的氨基酸序列在以下列出：

重链：DNA序列(426bp)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

重链：氨基酸序列(142AA)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

轻链：DNA序列(396bp)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

轻链：氨基酸序列(132AA)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

因此，ICOS 314.8(CNCM I-4180)的序列可以概述如下：

实施例10：Icos 88.2(CNCM I-4177)的测序

总RNA从提供的冷冻的杂交瘤细胞提取并且合成了cDNA。随后，进行RT-PCR以扩增MAb的可变区(重链和轻链)。分别将重链和轻链的MAb可变区克隆到克隆载体中，随后分析获得的序列以推断MAb的序列。

材料

杂交瘤细胞ICOS 88.2(CNCM I-4177)；Plus RNA纯化系统(Invitrogen，Cat.No：15596-026)；SuperScript^TM III第一链合成系统(Invitrogen，Cat.No：18080-051)。

方法

总RNA提取

根据Plus RNA纯化系统的技术手册从杂交瘤细胞分离总RNA。通过凝胶电泳检查总RNA。

RT-PCR

使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA反转录成cDNA，并且整个过程根据SuperScript^TM III第一链合成系统的技术手册进行。抗体片段将根据GenScript的RACE方法的标准操作草案扩增。

抗体基因的克隆

根据标准分子克隆过程，单独地将抗体基因的目标PCR产物克隆到克隆载体中。

筛选和测序

采用群体筛查来筛选具有正确尺寸的插入的克隆，并且对于每一个抗体片段测序不少于10个独立的阳性群体。

结果和分析

总RNA提取

样品的总RNA在1.5％琼脂/GelRed TM凝胶电泳上与DL3000 DNA标志物一起运行。

抗体基因的PCR产物

4μl的各个样品的PCR产物在1.5％琼脂/GelRed TM凝胶电泳上与DL3000 DNA标志物一起运行。

测序结果和分析

测序结果如下。共有DNA序列和相应的氨基酸序列在以下列出：

重链：DNA序列(429bp)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACCAGCTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAATGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCACCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATGGAATCTTTCTTATTACTTCGATAATAACTACTACTTGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO：29)

重链：氨基酸序列(143AA)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQMFKDKATLTVDKSSNTAYMQLTSPTSEDSAVYYCTRWNLSYYFDNNYYLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：30)

轻链：DNA序列(396bp)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

ATGAGGTGCCTAGCTGAGTTCCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGAGCCATTGGGGATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAACTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：31)

轻链：氨基酸序列(132AA)：前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：32)

因此，ICOS 88.2(CNCM I-4177)的序列可以概述如下：