本发明涉及一种新型的抗体信号肽及其在缺少信号肽蛋白在真核细胞内进行分泌表达中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
信号肽是一类具有介导蛋白穿越细胞脂质膜的蛋白短肽序列，它一般存在于分泌型蛋白或膜蛋白的末端，可以将目的蛋白定位于细胞外或者细胞膜上。信号肽的长度一般在30个氨基酸左右，位于蛋白序列的末端。如果将分泌型蛋白或膜蛋白的信号肽进行缺失，该蛋白将会滞留于细胞内，不能穿越细胞膜到达细胞外或者细胞膜上。因此，蛋白质穿越细胞膜需要一个完整的信号肽序列才能完成。信号肽的这一功能在真核表达中具有广泛的应用前景，如将细胞内表达的蛋白加入信号肽后，该蛋白就可以进行分泌表达，这样有利于该蛋白的纯化。抗体是哺乳动物的一类分泌型蛋白，由免疫系统中的B细胞分泌，由于抗体具有高度的多态性，每一个抗体分子的序列均不一样，因此，每种抗体的信号肽序列也不同。我们在一株鼠抗猪B3-H7的抗体轻链中鉴定了一段包含18-21个氨基酸的短肽信号肽序列，该序列能指导缺乏信号肽的蛋白获得分泌功能。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的抗体信号肽，该信号肽可以实现缺少信号肽的蛋白在真核细胞内的分泌表达。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
1.克隆小鼠重链的恒定区编码基因(mFc)，并且使该克隆基因5’加上ATG起始密码子，3’端带上TAA终止密码子，然后将该基因插入到真核表达载体pcDNA 3.1(+)BamHI和XhoI之间，构成真核重组表达载体pcDNA-mFc。
2.克隆小鼠mFc(不带起始密码子，只带终止密码子)，并将其克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(+)BamHI和XhoI之间，合成抗猪B7-H3抗体轻链5’端17-21位氨基酸的编码基因片段，将这些基因片段分别连接于mFc前的HindIII与BamHI之间，分别构成真核重组表达载体pcDNA-S 21-mFc(包含21个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 20-mFc(包含20个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 19-mFc(包含19个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 18-mFc(包含18个氨基酸的短肽)和pcDNA-S 17-mFc(包含17个氨基酸的短肽)。
3.将构建的各种真核重组载体(包括pcDNA-mFc、pcDNA-S 21-mFc、pcDNA-S 20-mFc、pcDNA-S 19-mFc、pcDNA-S 18-mFc和pcDNA-S 17-mFc)转染293T细胞，48h后收集上清或细胞，收集的转染细胞进一步进行裂解，上清或裂解的细胞用protein G进行纯化，纯化的产物进行western Blot分析。
结果表明，本发明人在一株鼠抗猪B7-H3的抗体轻链中鉴定的一段包含18-21个氨基酸的短肽信号肽序列，该序列能指导缺乏信号肽的蛋白获得分泌功能。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种新型的抗体信号肽，其是从一株鼠抗猪B7-H3的抗体轻链中鉴定出的一段包含18-21个氨基酸的短肽信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2-5所示。
编码所述的抗体信号肽的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-10所示。
进一步的，本发明还提出了所述的抗体信号肽在缺少信号肽的蛋白在真核细胞内进行分泌表达中的应用。
其中，优选的，所述的蛋白为单链抗体。
附图说明
图1为mFc蛋白的Western blot检测结果；
A)不带信号肽的mFc转染293T细胞，48h后收集细胞进行裂解，其中的mFc用protein G纯化后进行western Blot分析:1.蛋白质marker；2.转染细胞的裂解产物经protein G纯化后进行western Blot分析；3.转染细胞上清经protein G纯化后进行western Blot分析；
B)带不同长度信号肽的mFc基因转染293T细胞，48h后取上清，上清中的mFc用protein G纯化后进行western Blot分析：1.蛋白质marker；2.N端带21个氨基酸的信号肽的mFc基因转染293T细胞的分析结果；3.N端带20个氨基酸的信号肽的mFc基因转染293T细胞的分析结果；4.N端带19个氨基酸的信号肽的mFc基因转染293T细胞的分析结果；5.N端带18个氨基酸的信号肽的mFc基因转染293T细胞的分析结果；6.N端带17个氨基酸的信号肽的mFc基因转染293T细胞的分析结果；7.培养基上清对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1本发明的抗体信号肽及其在蛋白分泌表达中的应用
1、小鼠重链的恒定区编码基因(mFc)的扩增及其表达载体的构建
根据小鼠重链的恒定区编码基因(mFc)设计克隆引物对如下：
mFc-F 1:5’GAGAGGATCCATGGAGCCCAGCGGGCCCATTTC3’和
mFc-R:5’GAGACTCGAGCCGGGTAAAGGTAAATGA3’
其中在上游引物(mFc-F 1)的5’端加入B amHI酶切位点(GGATCC)和起始密码子(ATG)，下游引物(mFc-R)的5’端加入XhoI酶切位点(CTCGAG)。用该引物对从抗猪B7-H3杂交瘤细胞制备的cDNA中扩增mFc片段(SEQ ID NO.11所示)，纯化PCR产物后用B amHI和XhoI进行酶切，酶切产物进一步进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收的mFc产物连接到用B amHI和XhoI酶切和纯化的真核表达载体pcDNA 3.1(+)上，获得真核重组表达载体pcDNA-mFc，该重组载体中不带任何信号肽序列。
2、含有信号肽的小鼠mFc表达载体的构建
根据克隆小鼠mFc设计克隆引物对如下：
mFc-F 2:5’GAGAGGATCCGAGCCCAGCGGGCCCATTTC3’(不带起始密码子)，用该引物与mFc-R一起配对扩增mFc片段，该片段纯化后用B amHI和XhoI进行酶切，酶切产物进一步进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收的mFc产物连接到用B amHI和XhoI酶切和纯化的真核表达载体pcDNA 3.1(+)上，获得真核重组表达载体pcDNA-mFc 2(该重组载体中的mFc不含起始密码子)。合成含有抗猪B7-H3抗体轻链5’端17-21个氨基酸的编码基因片段，如下表1所示，将这些基因片段分别连接与mFc前的HindIII与BamHI之间，分别构成真核重组表达载体pcDNA-S 21-mFc(包含21个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 20-mFc(包含20个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 19-mFc(包含19个氨基酸的短肽)、pcDNA-S 18-mFc(包含18个氨基酸的短肽)和pcDNA-S 17-mFc(包含17个氨基酸的短肽)。
表1
3、western Blot分析
将构建的各种真核重组载体(包括pcDNA-mFc、pcDNA-S 21-mFc、pcDNA-S 20-mFc、pcDNA-S 19-mFc、pcDNA-S 18-mFc和pcDNA-S 17-mFc)转染293T细胞，48h后收集上清或同时收集上清和细胞(pcDNA-mFc转染的样品)，收集的转染细胞进一步进行裂解，上清和裂解的细胞用protein G进行纯化，纯化的产物进行western Blot分析，结果如图1所示。
从图1可以看出，本发明从一株鼠抗猪B7-H3的抗体轻链中鉴定出的包含18-21个氨基酸的短肽信号肽序列都可以指导缺乏信号肽的蛋白获得分泌功能。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 一种抗体信号肽及其应用
<130> KLPI161220
<160> 11
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<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 信号肽
<400> 1
1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro
16 Ala Ser
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 短肽
1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro
16 Ala Ser Asn
<400> 3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 短肽
<400> 1
1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro
16 Ala Ser Asn Ser
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 短肽
<400> 4
1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro
16 Ala Ser Asn Ser Asp
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 短肽
<400> 5
1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro
16 Ala Ser Asn Ser Asp Val
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 短肽编码序列
<400> 6
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc c 51
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 短肽编码序列
<400> 7
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caac 54
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 短肽编码序列
<400> 8
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagt 57
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 短肽编码序列
<400> 9
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagtgat 60
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 短肽编码序列
<400> 10
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagtgat 60
gtt 63
<210> 11
<211> 726
<212> DNA
<213> mFc
<400> 11
gagcccagcg ggcccatttc aacaatcaac ccctgtcctc catgcaagga gtgtcacaaa 60
tgcccagctc ctaaccttga gggtggacca tccgtcttca tcttccctcc aaatatcaag 120
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