本发明涉及一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
昆虫病原线虫是一类在世界范围被广泛认可的高效安全的生物农药[1屯]。昆虫病原发光杆菌属(Photorhabdus)细菌定殖于异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫肠道，与线虫互惠共生。细菌产生丰富的代谢产物，实现对昆虫的毒性，并为线虫的生长繁殖提供营养。Cip蛋白(crystallineinclusionproteins)，包括CipA和CipB，分子量分别为11.6kD、11．3kD，是Photorhabdus细菌胞内产生的2种晶体蛋白。该类蛋白富含疏水氨基酸，且其氨基酸含量和组成与共生线虫的营养需求一致。在富含Cip蛋白的环境中，线虫的死亡率较低，大多能完成世代发育并得到具有高侵染力的感染期线虫(infec—tivejuvenile，U)，而感染期线虫的得率是衡量这种生物农药产品质量的指标之一。因此，对Cip蛋白的研究，有助于阐明“线虫一细菌”的共生机制，并促进这种生物农药的产业化。
技术实现要素：
本发明提出一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体的制备方法。
一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取菌株及试验动物重组大肠杆菌，胰蛋白胨、酵母浸出粉；羧苄青霉紊、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG；蛋白质宽分子量标准(10～225kD)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG；TMB(3，3，5，5-Tetramebenaidine)；NBT、BCIP、Tween一20；牛血清白蛋白(BSA)；
（2）在LB抗性平板上挑取单菌落，接种于3mLLB培养基中，37℃活化培养2.5h，按3％接种量转接并摇瓶培养至对数生长期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG溶液诱导培养8h；
（3）将收获的菌体经PBS缓冲液洗涤2次后，重悬于适量PBS中，超声破碎，离心，每克沉淀加入4mLBugBuster试剂充分重悬，加入适量Benzonase核酸酶、rLysozyme稀释液，室温下温和振荡培养20min；
（4）然后再次离心，将沉淀充分悬浮于等体积的BugBuster试剂中，加入1kU/mLrLysozyme溶液，温和振摇10min，加入6倍体积的BugBuster稀释液，温和振摇3min，离心15分钟，在4℃，5000g，沉淀用BugBuster稀释液洗涤2次，离心15分钟，在4℃，16000g，后将淀冻存于零下20℃；
（5）取上述提取的目的蛋白粗品，进行15％SDS—PAGE电泳分析，用Ge卜Pro(MediaCybernetics)软件分析目的蛋白表达水平；
（6）凝胶经蒸馏水洗涤数次，浸泡在4℃、0.25mol/L的KCl溶液中，待显色后用洁净的手术刀割取目的蛋白条带，剪碎，匀浆器研磨，无菌PBS缓冲液调整凝胶悬液体积，分装后冻存于零下20℃中即可。
优选地，所述步骤（2）中LB的成份为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/LNaCI，含有50t-tg/mLCar。
优选地，所述步骤（3）离心环境为4℃，10000g，10min。
优选地，所述步骤（4）离心环境为4℃，16000g，20 min。
本发明所述方法制备的一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体，获得了稳定表达的重组Cip蛋白，纯化后分别制备CipA及CipB的多克隆抗体，为Cip蛋白免疫学检测方法的建立奠定基础为昆虫病原Photorhabuds细菌胞内晶体蛋白及其相互作用蛋白的进一步研究提供了工具。
具体实施方式
实施例1。
一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取菌株及试验动物重组大肠杆菌，胰蛋白胨、酵母浸出粉；羧苄青霉紊、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG；蛋白质宽分子量标准(10～225kD)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG；TMB(3，3，5，5-Tetramebenaidine)；NBT、BCIP、Tween一20；牛血清白蛋白(BSA)；
（2）在LB抗性平板上挑取单菌落，接种于3mLLB培养基中，37℃活化培养2.5h，按3％接种量转接并摇瓶培养至对数生长期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG溶液诱导培养8h；
（3）将收获的菌体经PBS缓冲液洗涤2次后，重悬于适量PBS中，超声破碎，离心，每克沉淀加入4mLBugBuster试剂充分重悬，加入适量Benzonase核酸酶、rLysozyme稀释液，室温下温和振荡培养20min；
（4）然后再次离心，将沉淀充分悬浮于等体积的BugBuster试剂中，加入1kU/mLrLysozyme溶液，温和振摇10min，加入6倍体积的BugBuster稀释液，温和振摇3min，离心15分钟，在4℃，5000g，沉淀用BugBuster稀释液洗涤2次，离心15分钟，在4℃，16000g，后将淀冻存于零下20℃；
（5）取上述提取的目的蛋白粗品，进行15％SDS—PAGE电泳分析，用Ge卜Pro(MediaCybernetics)软件分析目的蛋白表达水平；
（6）凝胶经蒸馏水洗涤数次，浸泡在4℃、0.25mol/L的KCl溶液中，待显色后用洁净的手术刀割取目的蛋白条带，剪碎，匀浆器研磨，无菌PBS缓冲液调整凝胶悬液体积，分装后冻存于零下20℃中即可。
优选地，所述步骤（3）离心环境为4℃，10000g，10min。
优选地，所述步骤（4）离心环境为4℃，16000g，20 min。
实施例2。
一种昆虫病原细菌Cip蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取菌株及试验动物重组大肠杆菌，胰蛋白胨、酵母浸出粉；羧苄青霉紊、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG；蛋白质宽分子量标准(10～225kD)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG；TMB(3，3，5，5-Tetramebenaidine)；NBT、BCIP、Tween一20；牛血清白蛋白(BSA)；
（2）在LB抗性平板上挑取单菌落，接种于3mLLB培养基中，37℃活化培养2.5h，按3％接种量转接并摇瓶培养至对数生长期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG溶液诱导培养8h；
（3）将收获的菌体经PBS缓冲液洗涤2次后，重悬于适量PBS中，超声破碎，离心4℃，10000g，10min，每克沉淀加入4mLBugBuster试剂充分重悬，加入适量Benzonase核酸酶、rLysozyme稀释液，室温下温和振荡培养20min；
（4）然后再次离心4℃，16000g，20 min，将沉淀充分悬浮于等体积的BugBuster试剂中，加入1kU/mLrLysozyme溶液，温和振摇10min，加入6倍体积的BugBuster稀释液，温和振摇3min，离心15分钟，在4℃，5000g，沉淀用BugBuster稀释液洗涤2次，离心15分钟，在4℃，16000g，后将淀冻存于零下20℃；
（5）取上述提取的目的蛋白粗品，进行15％SDS—PAGE电泳分析，用Ge卜Pro(MediaCybernetics)软件分析目的蛋白表达水平；
（6）凝胶经蒸馏水洗涤数次，浸泡在4℃、0.25mol/L的KCl溶液中，待显色后用洁净的手术刀割取目的蛋白条带，剪碎，匀浆器研磨，无菌PBS缓冲液调整凝胶悬液体积，分装后冻存于零下20℃中即可。
所述步骤（2）中LB的成份为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/LNaCI，含有50t-tg/mLCar。