单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其应用的制作方法

本发明涉及口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位，本发明还涉及所述口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫诊断或防治中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术：

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的，严重危害偶蹄动物的重要传染病之一。该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，而且具有极强的传染性，可形成大范围流行，造成巨大的经济损失。预防和控制口蹄疫的关键是免疫接种和准确的诊断方法的应用。

口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8.5kb。根据免疫原性，口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial共7个血清型及65个以上的亚型，各血清型之间无交叉免疫保护。目前中国主要流行O型、A型和Asial型FMD。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同，存在广泛的抗原变异。利用单抗逃逸突变株序列分析和交叉中和试验，已鉴定了一些不同血清型FMDV的抗原位点，相关的研究主要来自O、A、C和Asia1型FMDV，而某些相对保守的免疫显性表位可诱导机体产生血清型共享型单抗，对于FMDV感染的诊断具有重要价值。因此，研究口蹄疫病毒共享型单克隆抗体以及鉴定该单克隆抗体所识别的口蹄疫病毒血清共享型表位，对于口蹄疫的诊断和防治等均具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位；

本发明所要解决的第二个技术问题是将上述口蹄疫病毒血清型共享性表位应用于口蹄疫的诊断或防治。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一株分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9的杂交瘤细胞系以及由所述杂交瘤细胞系分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9。

本发明将分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9的杂交瘤细胞系提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13293；分类命名为：分泌FMDV共享型单克隆抗体的杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年11月25日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

经IFA特异性鉴定表明，由所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体3D9为一株血清型共享性单抗，其与O型、A型和Asia1型口蹄疫病毒抗原均有反应。

本发明以单克隆抗体3D9作为固相筛选分子，生物淘选噬菌体随机12肽库，经3轮淘选后，特异性噬菌体得到富集。随机挑取40个噬菌体，通过噬菌体ELISA和抗原竞争抑制试验，发现有7个噬菌体克隆可与单抗3D9特异性结合。提取阳性噬菌体克隆的DNA进行测序，发现阳性噬菌体克隆展示一个共有基序GVYxxAYxW(SEQ ID NO：1)；其中，X为任意一种氨基酸残基。该共有基序与所有7个血清型FMDV毒株VP2蛋白的第89-105氨基酸区域具有较高的相似性。

本发明为进一步验证单抗3D9识别的抗原表位，利用反向遗传系统拯救了VP2蛋白该表位定点诱变的重组病毒V90A，通过间接ELISA检测显示，与亲本株相比较，突变株与单抗3D9结合能力下降了50％。由此，本发明确定VP2的⁸⁹GVY X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 AY X8 X9 X10 X11 W¹⁰⁵序列(SEQ ID NO：2所示)是单抗3D9所针对的抗原表位，其中X1-X11可选择任何一种氨基酸残基；优选的X1为甘氨酸；X2为丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸或组氨酸；X3为亮氨酸或甲硫氨酸；X4为苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；X5为天冬氨酸、赖氨酸或丙氨酸；X6为丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸；X7为酪氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；X8为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；X9为精氨酸；X10天冬酰胺；X11为甘氨酸。

对FMDV毒株该表位肽序列进行比对分析发现，单抗3D9识别的表位在GenBank公示的O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3所有7个血清型FMDV毒株的VP2蛋白上是高度保守的，表明它是各血清型FMDV毒株的共享型表位。

为了进一步验证单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断中的应用潜力，本发明利用筛选得到的噬菌体克隆9和14作为模拟抗原，建立了检测口蹄疫病毒血清抗体的间接ELISA方法，其中噬菌体的最佳包被浓度为1.56xl0⁷pfu/ml，结果证明用噬菌体克隆9和14作为模拟抗原建立的方法能够特异性的检测出FMDV阳性血清。上述结果表明，单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断中具有应用价值。

本发明所述口蹄疫病毒血清型共享性表位是O型、A型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型七个血清型口蹄疫病毒的共享性表位。

本发明进一步公开了所述的共有基序或口蹄疫病毒血清型共享性表位在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的应用，以及在制备口蹄疫病毒抗体检测的试剂中的应用。

本发明还公开了一种用于诊断口蹄疫病毒的间接ELISA试剂盒，包括：包被抗原的固相载体、洗涤液、封闭液、HRP标记的羊抗牛IgG抗体、显色液、终止液；其中，所述抗原为单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位或单克隆抗体3D9表位模拟肽的共有基序。所述洗涤液为pH7.4的PBST溶液，所述封闭液为5％脱脂乳，所述显色液为TMB显色液。所述口蹄疫病毒包括：O型、A型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型或SAT3型口蹄疫病毒。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明对单克隆抗体3D9识别的共享性表位进行鉴定，确定FMDV毒株VP2蛋白的第89-105氨基酸区域是单抗3D9所针对的抗原表位，该表位是七个血清型FMDV毒株的共享型表位。本发明所述单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断或防治中具有重要应用价值。

附图说明

图1为ELISA方法筛选与单抗3D9特异性结合的噬菌体；其中，PL为野生型噬菌体(wild-type M13phage)，未插入随机肽，作为阴性对照；

图2为抗原竞争抑制试验；

图3为FMDV毒株3D9表位的保守性分析；

图4为ELISA分析表位突变病毒株与单抗3D9的结合力；

图5为ELISA分析单抗3D9识别抗原表位与口蹄疫病毒抗体阳性血清的特异性反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清共享型表位的鉴定

1、材料和方法

1.1病毒、细胞和菌株

口蹄疫病毒O/YS/CHA/05株属于O型泛亚谱系；乳仓鼠肾细胞BHK-21为本发明人实验室保存；FMDV O/YS/CHA/05株感染性质粒PYS均由本发明人实验室保存。

分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9的杂交瘤细胞系，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13293。

1.2主要试剂

PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司；Ph.D.-12^TM肽库试剂盒、DpnI和T4DNA连接酶购自New England Biolabs公司；HRP或FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司；HRP标记抗的M13噬菌体抗体购自于GE Healthcare公司；NAb^TM Protein G Spin Purification Kit购自PIERCE公司；Transfection Reagent转染试剂盒购自QIANGE公司。

1.3生物淘洗

将制备的单抗3D9腹水先经辛酸-硫酸铵法粗提，然后用NAb^TM Protein G Spin Purification Kit(PIERCE)进行亲和层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度后用于生物淘洗，用M13噬菌体展示随机线性十二肽库对单抗进行表位作图。生物淘洗参照试剂盒说明书进行：第1轮淘洗于微孔板中包被10ug单抗，第2、3轮分别包被5ug、1ug，4℃过夜；0.05％TBST洗涤后，用10g/L BSA封闭，加入1.5×10¹¹pfu/100μl展示十二肽的M13噬菌体，室温轻摇1h，TBST洗涤10次后，用洗脱缓冲液将结合的噬菌体于室温轻摇10min洗脱下来，加入缓冲液中和洗脱的噬菌体，接种大肠杆菌ER2738进行扩增。对扩增后的噬菌体进行回收并测定滴度，取1.5×10¹¹pfu噬菌体进入下一轮淘洗。挑取单个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其活性，最后对阳性噬菌体的单链DNA进行序列分析。

1.4噬菌体亲和捕获ELISA

将96孔聚乙烯酶标板包被100ng单抗(每孔100uL，0.1M碳酸氢钠pH9.6)，4℃过夜，设立重复孔，同时设立识别不同表位的来源于同一只小鼠制备的单克隆抗体作为对照，1％BSA封闭液作为对照。室温封闭2h后，用0.1％TBST稀释噬菌体克隆至10¹⁰pfu/100uL，加入每孔，室温轻摇反应1h，用0.1％TBST洗六次后，加入1:5000稀释的HRP标记的鼠抗M13噬菌体抗体，用底物TMB显色后于450nm测吸光度，以P/N>2.1作为待检样品的阳性结果判定标准。

1.5FMDV抗原竞争抑制ELISA

将纯化的单抗3D9用包被液(0.1M碳酸氢钠，pH8.6)稀释后包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜，甩洗涤3次后，加封闭液(0.5mg/ml BSA，pH7.4)，4℃封闭2h；将噬菌体ELISA检测结果为阳性的噬菌体稀释为10¹²pfu/ml，加入到封闭好的酶标板中，50uL每孔，然后再加入TBS稀释的口蹄疫病毒抗原，50μl每孔，同时设立阴性对照孔：50μl噬菌体+50μl TBS；空白对照孔，100μl TBS。37℃孵育作用lh，洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记的抗噬菌体M13二抗，100μl每孔，室温振荡作用lh；用TBST洗涤后加入TMB底物显色15min，用2M H₂SO₄终止显色，用酶标检测仪测定OD_450nm值。

1.6噬菌体单链DNA模板的制备与序列测定分析

第三轮洗脱的噬菌体被测定滴度后，随机挑选噬菌体克隆，分别接种到含1ml按1∶100稀释的ER2738对数中期培养物，于37℃震荡培养4.5h。12 000rpm离心10min，各取500μl上清到新管中，每管加入200μl PEG/NaCl，混匀后，静置10min，12 000rpm离心10min，沉淀溶于100μl碘化钠缓冲液中，再加入250μl无水乙醇，室温静置10min，12 000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，自然干燥后，用30μl纯水溶解，即可作为测序模板。测序由上海生物工程有限公司完成，测序引物为-96gIII，序列为：5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。测序后按照噬菌体随机展示肽库说明书中的遗传密码表，将DNA序列翻译为氨基酸序列。将测序所得氨基酸序列与各血清型口蹄疫病毒株VP2蛋白氨基酸序列进行比对分析。

1.7定点突变

以重组质粒pOK-VP2作模板，用PrimeSTAR DNA Polymerase通过定点突变PCR的方法，利用突变引物(表1)在基因组VP2片段上分别引入点突变。PCR反应程序是：94℃4min；94℃1min，55℃45s，68℃9min，18个循环；68℃10min；4℃20min。纯化回收PCR产物后用DpnI降解PCR产物中被甲基化的模板pOK-VP2(37℃，1h)，将处理过的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，提取并鉴定阳性质粒。每个样品挑取三个阳性克隆送吉林库美生物技术有限公司测序。

表1定点突变所用的引物及其序列

1.8病毒拯救

BHK-21细胞在6孔板中生长至70％-90％单层时，用PBS洗2遍细胞，加1.5mL正常细胞培养液。将纯化的含有点突变的pYS质粒线性化后与pT7RNAP质粒等比例混合后转染BHK-21细胞，在细胞内进行转录及病毒拯救。转染按QIANGE公司的Transfection Reagent转染试剂盒说明书进行，转染的细胞在5％CO₂于37℃培养4h，用含2％胎牛血清的DMEM更换培养基继续培养，观察细胞病变，大约3天左右收获病毒，反复冻融3次后传代接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定产生CPE。成功拯救病毒后，对拯救的突变病毒全基因组进行测序，验证突变是否正确。

1.9间接ELISA试验

于96孔聚乙烯酶标板每孔包被100ng 3D9单抗(每孔100μl，0.1M碳酸氢钠pH9.6)，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4PBST洗板5次，甩干，5％脱脂乳37℃封闭2h。将已灭活的FMDV O/YS/CHA/05亲本株和突变株分别自10⁵TCID₅₀、10⁴TCID₅₀、10³TCID₅₀、10²TCID₅₀稀释，每孔加入100μl，37℃作用1h，用PBST洗涤5次。在ELISA板中加入1:4000倍稀释的HRP-4B2，每孔100μl。同上洗板5次，TMB显色15min后，终止液终止反应，读取OD_450nm值。

1.10应用噬菌体克隆初步建立ELISA方法

应用展示3D9抗原表位多肽的噬菌体克隆9和14包被96孔板，检测其与口蹄疫病毒A、O和Asia1阳性血清的结合情况。于96孔聚乙烯酶标板每孔包被1.56xl0⁷pfu/ml噬菌体克隆(每孔100μl，0.1M碳酸氢钠pH9.6)，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4PBST洗板5次，甩干，5％脱脂乳37℃封闭2h。加入梯度稀释的口蹄疫病毒A、O和Asia1阳性血清，每孔加入100μl，37℃作用1h，用PBST洗涤5次。在ELISA板中加入1:8000倍稀释的HRP标记的羊抗牛IgG抗体，每孔100μl，37℃作用1h，同上洗板5次，TMB显色15min后，终止液终止反应，读取OD_450nm值。

2、实验结果

2.1淘选产率

在筛选过程中，对每一轮洗脱回收的噬菌体和扩增的噬菌体培养物上清进行滴度测定，以计算每一轮生物淘选后噬菌体的产率。以每一轮淘选时加入噬菌体的量记作投入量(Input)、洗脱后的噬菌体的量记作产出量(Output)，产率(Yield)＝产出量(Output)/投入量(Input)×100％。经过3轮淘选，噬菌体的产率逐渐升高，从第一轮的7.3×10^-5到第三轮的9×10^-1，上升了4个数量级(表2)，表明在淘选过程中与单抗特异性结合的噬菌体的比例有明显的升高，即发生了特异性噬菌体的富集。

表2噬菌体肽库淘选结果

注：三轮淘选中单抗的包被量逐渐降低，依次为10ug/孔、5ug/孔、1ug/孔；而洗涤液中Tween-20的浓度逐渐升高，依次为0.1％、0.3％、0.5％。

2.2噬菌体ELISA

经过3轮生物淘选后，随机挑取40个蓝色噬菌斑进行扩增。然后与单克隆抗体3D9和另一单抗5D12(对照)进行ELISA检测，结果显示，有7个噬菌体多肽与3D9特异性结合，而与无关单抗5D12对照孔不发生反应(图1)。由此表明，筛选到的7个噬菌体展示多肽是与3D9抗体的可变区特异性结合(单抗3D9和5D12的差异在抗体的可变区)，可能是阳性噬菌体克隆；而其余的噬菌体展示多肽结合的是鼠抗体IgG的恒定区，不能区别单抗3D9和5D12(单抗3D9和5D12有相同的恒定区)。

2.3抗原竞争抑制ELISA

选取噬菌体ELISA检测为阳性的7个噬菌体克隆进一步开展抗原竞争抑制试验。结果表明，抗原能不同程度地抑制这7个噬菌体克隆与单克隆抗体3D9的结合，其中抑制率最高的是噬菌体克隆9、11、12和14，抑制率达50％以上(图2)。这进一步说明，筛选到的阳性噬菌体展示多肽形成的表位，与单抗3D9所识别的口蹄疫病毒抗原表位相同或相近。

2.4阳性噬菌体测序及氨基酸序列分析

将制备的噬菌体单链DNA模板进行测序，测序结果表明，带有氨基酸残基G、V、Y、A、Y和W的阳性噬菌体克隆得到了富集，将这些噬菌体的外源插入片段序列进行序列比对，推导出3D9表位模拟肽的共有基序为GVYxxAYxW(表3)。

继而，将上述的共有基序与GenBank中O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3等7个血清型FMDV结构蛋白P1的氨基酸序列进行比对，结果显示，该共有基序GVYxxAYxW与所有7个血清型FMDV毒株VP2蛋白的第89～105氨基酸区域具有较高的相似性(图3)。这表明，单抗3D9识别的抗原表位位于FMDV VP2蛋白的第89～105氨基酸区域，是针对FMDV七个血清型毒株的一个高度保守性表位。

表3阳性噬菌体模拟表位肽的氨基酸序列

^a基序氨基酸残基用加粗和下划线标出。

2.5单抗3D9识别抗原表位的体内验证

通过序列比对分析，单抗3D9识别的抗原表位初步定位于FMDV VP2蛋白上。为了进一步验证单抗3D9识别的抗原表位，本发明通过反向遗传操作系统构建了一系列突变株(G89A、V90A、Y91A、Y100A、W105A)。经多次拯救，V90A突变株被成功拯救。通过间接ELISA检测突变株与单抗3D9的结合能力试验表明，与亲本株相比较，突变株与单抗3D9的结合能力下降约50％左右(图4)。此结果进一步验证了本发明鉴定的单抗3D9识别表位。

2.6单抗3D9识别抗原表位与口蹄疫病毒抗体阳性血清的特异性反应

分别用噬菌体克隆9和14包被酶标板，并设立噬菌体阴性克隆对照，检测A、O和Asia1型口蹄疫病毒阳性血清的抗体水平。以抗体的稀释倍数为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标，绘制曲线(图5)。从图5可以看出，噬菌体克隆9和14均可以检测出血清中的口蹄疫病毒抗体，而且它们之间的结合活性在1:100稀释时也比较高，OD₄₅₀值可以达到0.8至1.2。因此，噬菌体克隆可以与血清中的抗口蹄疫病毒多抗发生特异性结合。

上述研究结果确定，单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其氨基酸序列在口蹄疫病毒诊断中具有应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其应用

<130> HLJ-2001-161104A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> artifical sequence

<400> 1

Gly Val Tyr X X Ala Tyr X Trp

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Foot-and-mouth disease virus

<400> 2

Gly Val Tyr X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 Ala Tyr X8 X9 X10 X11

1 5 10 15

Trp