本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法。
背景技术：
无乳链球菌(S.agalactiae)是引起奶牛乳房炎的主要病原体之一，具有高传染性，常存在于奶牛的皮肤、乳头及乳房内，通过挤乳人员的手或挤乳机械以及蝇类的机械携带而传播，附着在乳腺管壁并将其破坏，引起慢性乳房炎，潜伏期可达数周或数月，不易发现。同时，无乳链球菌还是造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因。它寄生在产妇生殖道，可致婴儿感染的发生。也可引起产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染及骨髓炎。
无乳链球菌以荚膜分型，共有10个血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型)，各个血清型之间无交叉保护力。血清型的鉴定对于无乳链球菌性奶牛乳房炎流行病学调查和疫苗的研制至关重要。但目前国内并没有商品化的无乳链球菌型特异性抗血清供应，虽然国外有B组链球菌的阳性参考血清，但多分离自人，且价格昂贵、供货周期期长，远远不能满足需要。
荚膜分型血清的制备的关键在于保证荚膜的完整性，否则抗体滴度会显著不同。因此，菌液培养的方法也尤为重要。传统制备分型血清的方法为采用无佐剂法耳静脉免疫家兔制备，其产生的抗体低，不能满足规模化生产的要求；近年来，有报道采用弗氏佐剂免疫家兔制备分型血清，但其价格较高，副反应大，易造成兔子背部出现破溃等副反应，且使用活菌攻毒的方法制备阳性血清，易造成免疫动物发病死亡，且短期多次免疫注射，需要不断制备新鲜的菌液，费时费力。
因此，有必要建立一种安全、实用、产生效价高的制备无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，以解决目前国内缺少分型血清的问题。目前尚未见有采用无乳链球菌灭活疫苗制备型特异性抗血清的报道。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种添加新型佐剂制备无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，以解决现有技术中缺乏相关方法的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是无乳链球菌型特异性抗血清的制备抗体效价较低和需要活菌多次注射的问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，包括以下步骤：
1)制备无乳链球菌菌液；
2)取步骤1)所得的菌液分别制备无乳链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活抗原；
3)取步骤2)所述疫苗和抗原对家兔进行免疫接种；
4)从步骤3)免疫接种后的家兔体内收获血清。
作为优选，步骤3)所述的家兔是2.0～4.0kg清洁级，日本大耳白兔或新西兰大白兔。
作为优选，步骤3)所述的免疫接种包括以下步骤：
A)基础免疫：取步骤2)制备的无乳链球菌灭活疫苗，每次以2～4ml的剂量皮下多点注射2次，2次的时间间隔为10～15d；
B)灭活疫苗强化免疫：步骤A)完成7～10d后，取步骤2)制备的无乳链球菌灭活疫苗皮下和腿部肌肉多点注射2次，第1次剂量为4～6ml，第2次剂量为第1次剂量的1～2倍，2次的时间间隔为5～7d；
C)灭活抗原强化免疫：步骤B)完成5～8d后，取步骤2)制备的无乳链球菌灭活抗原皮下注射1～2次，第1次剂量为10～20ml，第2次剂量为第1次剂量的1～2倍。
作为优选，步骤A)中所述无乳链球菌灭活疫苗中活菌浓度为0.5×1010～1×1010CFU。
作为优选，步骤4)中所述血清的抗体效价不低于1:320。
作为优选，步骤1)所述菌液是通过以下方法制备的：将冻干菌种用营养肉汤培养12h～18h后，以划线方法接种至含5％～10％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板上纯化培养，而后挑去单菌落接种于含有2％～10％新生牛血清、0～8g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代培养3～5次，每次培养的时间为4～8小时。
作为优选，步骤2)所述的无乳链球菌灭活抗原是通过以下方法制备的：取步骤1)所得的无乳链球菌菌液，浓缩后于56℃热灭活30min。
作为优选，所述浓缩是通过离心方式实现的，离心转速为4000～8000rpm，离心时间为15～30min。
作为优选，所述浓缩是通过超滤方式实现的，滤膜的孔径为0.22μm，浓缩倍数为5～20倍体积。
作为优选，步骤2)所述无乳链球菌灭活疫苗是通过以下方法制备的：取步骤1)所得的无乳链球菌菌液，以4000～8000rpm的转速离心15～30min或以0.22μm孔径的滤膜超滤浓缩5～20倍体积，而后1:100～1:500(w/w)的比例向其中加入甲醛溶液，于37℃灭活16～96h，得到灭活产物；以灭活产物与ISA201佐剂按1:1～4:5的体积比将二者混合，乳化5～10min，而后以灭活产物与氢氧化铝胶佐剂按3:1～3:5的体积比向乳化产物中加入氢氧化铝胶佐剂，混合均匀。
作为优选，步骤4)中在收获血清之前，先使用玻片凝集试验测定血清效价；在此基础上进一步优选的，上述效价的测定时间是步骤2)最后一次免疫接种后第5～10d。
作为优选，步骤3)中是通过心脏采血的方式收获血清的。
在以上技术方案中，所述无乳链球菌标准菌株，购自丹麦SSI；ISA201为由法国SEPPIC公司出品的佐剂产品，可自市面购得。铝胶为本公司自行配制。
本发明方法所制备的无乳链球菌型特异性抗血清主要应用于无乳链球菌的血清学鉴定。无乳链球菌在实验动物中以小鼠最为敏感，其次为家兔，然而使用小鼠制备阳性血清，收获的血清量较少，不适合大规模应用。使用家兔制备阳性血清较小鼠收获的血清量大，相对成本较低，具有突出的规模化应用前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1(无乳链球菌性特异性抗血清的制备)
1 抗原的制备
1.1 灭活疫苗制备
1.1.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养18h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加2％新生牛血清和8g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代5次，每次培养的时间为6小时。
1.1.2 灭活疫苗的制备 1.1.1节中制备的菌液经离心进行浓缩，其中离心转速为4000rpm，离心时间为30min，浓缩倍数为5倍。将浓缩后的菌液以1:500(w/w)的比例向浓缩后的无乳链球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃灭活96h。经检验灭活完全后采用PBS洗涤2次并重悬，调整活菌数为1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐剂，以1:1的比例采用磁力搅拌器搅拌配苗，搅拌时间为5min。b)添加氢氧化铝胶佐剂，以1:3的比例充分混匀配苗。
1.1.3 灭活疫苗检验 将1.1.2制成的无乳链球菌灭活疫苗进行性状、无菌检验等，结果全部合格。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为4.0×108CFU/ml。
1.2 灭活抗原的制备
1.2.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加2％新生牛血清和10g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代3次，每次培养的时间为5小时。
1.2.2 灭活抗原的制备 将1.2.1制备的菌液经0.22μm的滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数为10倍，56℃水浴30min进行热灭活，灭活检验为阴性后放于2～8℃备用，存放时间不超过1周。
1.2.3 灭活抗原检验 将1.2.1制成的无乳链球菌灭活抗原进行无菌检验，结果无菌生长。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为1×108CFU/ml。
2 家兔筛选 选择体重为3.0～4.0kg的清洁级日本大耳白兔2只，转入试验用兔舍隔离饲养观察5d，结果试验兔营养状况良好，未发现应激和其他疾病的发生。
3 免疫接种
3.1 基础免疫(灭活疫苗)：共2次。将制备的1.1项a)制备的无乳链球菌灭活疫苗经背部皮下多点注射，每只兔子注射2ml，间隔10d，以同等剂量进行加强免疫1次。
3.2 强化免疫(灭活疫苗)：共2次。基础免疫7d后，将1.1项b)制备的灭活疫苗经背部皮下和腿部肌肉多点注射，每只兔子注射4ml，间隔7d，每只兔子注射8ml加强免疫1次。
3.3 强化免疫(灭活抗原)：共2次。灭活抗原免疫后7d后，将1.2项制备的灭活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射10ml，间隔为5d，每只兔子注射20ml加强免疫1次。
4 家兔安全性观察家兔免疫后注射部位均未出现脓肿破溃等局部不良反应。
5 阳性血清收获及鉴定
5.1 阳性血清效价测定 最后1次免疫接种后10d采集少量兔血清，使用玻片凝集试验测定血清中和效价，确认阳性血清的中和抗体为1:640。
5.2 阳性血清的收获 于最后一次加强免疫后15d采用心脏采血的方式收获阳性血清100ml。
5.3 阳性血清的应用效果 将有交叉反应的血清进行吸附后采用玻片凝集的方法进行试验，结果制备的阳性血清仅与本型菌体抗原发生凝集反应。将收获的阳性血清进行无菌检验、支原体检验及外源病毒检验，结果各项检验全部合格。表明我们自行制备的阳性确定可满足鉴定需要。
实施例2(无乳链球菌性特异性抗血清的制备)
1 抗原的制备
1.1 灭活疫苗制备
1.1.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加3％新生牛血清和4g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代5次，每次培养的时间为5小时。
1.1.2 灭活疫苗的制备 制备1.1.1制备的菌液经离心进行浓缩，其中离心转速为6000rpm，离心时间为20min，浓缩倍数为7倍。将浓缩后的菌液以1:200(w/w)的比例向浓缩后的无乳链球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃灭活24h。经检验灭活完全后采用PBS洗涤2次并重悬，调整活菌数为1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐剂，以1:1的比例采用磁力搅拌器搅拌配苗，搅拌时间为5min。b)添加氢氧化铝胶佐剂，以2:3的比例充分混匀配苗。
1.1.3 灭活疫苗检验 将1.1.2制成的无乳链球菌灭活疫苗进行性状、无菌检验等，结果全部合格。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为2×108CFU/ml。
1.2 灭活抗原的制备
1.2.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加3％新生牛血清和4g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代4次，每次培养的时间为4小时。
1.2.2 灭活抗原的制备 将1.2.1制备的菌液经0.22μm的滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数为10倍，56℃水浴30min进行热灭活，灭活检验为阴性后放于2～8℃备用，存放时间不超过1周。
1.2.3 灭活抗原检验 将1.2.1制成的无乳链球菌灭活抗原进行无菌检验，结果无菌生长。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为1×108CFU/ml。
2 家兔筛选 选择体重为2.0-2.5kg的清洁级日本大耳白兔2只，转入试验用兔舍隔离饲养观察7d，结果试验兔营养状况良好，未发现应激和其他疾病的发生。
3 免疫接种
3.1 基础免疫(灭活疫苗)：共2次。将制备的1.1项a)制备的无乳链球菌灭活疫苗经背部皮下多点注射，每只兔子注射4ml，间隔14d，以同等剂量进行加强免疫1次。
3.2 强化免疫(灭活疫苗)：共2次。基础免疫10d后，将1.1项b)制备的灭活疫苗经背部皮下多点注射，每只兔子注射6ml，间隔7d，每只兔子注射9ml加强免疫1次。
3.3 强化免疫(灭活抗原)：共2次。灭活抗原免疫后8d后，将1.2项制备的灭活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射20ml，间隔为5d，每只兔子注射40ml加强免疫1次。
4 家兔安全性观察 家兔免疫后注射部位均未出现脓肿破溃等局部不良反应。
5 阳性血清收获及鉴定
5.1 阳性血清效价测定 最后1次免疫接种后7d采集少量兔血清，使用玻片凝集试验测定血清中和效价，确认阳性血清的中和抗体为1:640。
5.2 阳性血清的收获 于最后一次加强免疫后14d采用心脏采血的方式收获特阳性血清80ml。
5.3 阳性血清的应用效果 将有交叉反应的血清进行吸附后采用玻片凝集的方法进行试验，结果制备的阳性血清仅与本型血清发生凝集反应。将收获的阳性血清进行无菌检验、支原体检验及外源病毒检验，结果各项检验全部合格。表明我们自行制备的阳性确定可满足鉴定需要。
实施例3(无乳链球菌性特异性抗血清的制备)
1 抗原的制备
1.1 灭活疫苗制备
1.1.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加5％新生牛血清和10g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代5次，每次培养的时间为8小时。
1.1.2 灭活疫苗的制备 制备1.1.1制备的菌液经离心进行浓缩，其中离心转速为8000rpm，离心时间为15min，浓缩倍数为10倍。将浓缩后的菌液以1:100(w/w)的比例向浓缩后的无乳链球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃灭活16h。经检验灭活完全后采用PBS洗涤2次并重悬，调整活菌数为1×1010CFU/ml。a)添加ISA201佐剂，以2:3的比例采用磁力搅拌器搅拌配苗，搅拌时间为10min。b)添加氢氧化铝胶佐剂，以1:3的比例充分混匀配苗。
1.1.3 灭活疫苗检验 将1.1.2制成的无乳链球菌灭活疫苗进行性状、无菌检验等，结果全部合格。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为1×109CFU/ml。
1.2 灭活抗原的制备
1.2.1 菌液的制备 将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线进行纯化培养后挑去典型的单菌落接种于添加5％新生牛血清和5g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代4次，每次培养的时间为8小时。
1.2.2 灭活抗原的制备 将1.2.1制备的菌液经0.22μm的滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数为20倍，56℃水浴30min进行热灭活，灭活检验为阴性后放于2～8℃备用，存放时间不超过1周。
1.2.3 灭活抗原检验 将1.2.1制成的无乳链球菌灭活抗原进行无菌检验，结果无菌生长。其中配苗用新鲜菌液经活菌计数，其活菌数为1×108CFU/ml。
2 家兔筛选 选择体重为2.5-3.0kg的清洁级新西兰大白兔2只，转入试验用兔舍隔离饲养观察7d，结果试验兔营养状况良好，未发现应激和其他疾病的发生。
3 免疫接种
3.1 基础免疫(灭活疫苗)：共2次。将制备的1.1项a)制备的无乳链球菌灭活疫苗经背部皮下多点注射，每只兔子注射4ml，间隔10d，以同等剂量进行加强免疫1次。
3.2 强化免疫(灭活疫苗)：共2次。基础免疫7d后，将1.1项b)制备的灭活疫苗经背部皮下多点注射，每只兔子注射5ml，间隔5d，每只兔子注射10ml加强免疫1次。
3.3 强化免疫(灭活抗原)：共1次。灭活抗原免疫后5d后，将1.2项制备的灭活抗原，以背部皮下注射，每只兔子注射20ml。
4 家兔安全性观察 家兔免疫后注射部位均未出现脓肿破溃等局部不良反应。
5 阳性血清收获及鉴定
5.1 阳性血清效价测定 最后1次免疫接种后5d采集少量兔血清，使用玻片凝集试验测定血清中和效价，确认阳性血清的中和抗体为1:320。
5.2 阳性血清的收获 于最后一次加强免疫后10d采用心脏采血的方式收获特阳性血清90ml。
5.3 阳性血清的应用效果 将有交叉反应的血清进行吸附后采用玻片凝集的方法进行试验，结果制备的阳性血清仅与本型血清发生凝集反应。将收获的阳性血清进行无菌检验、支原体检验及外源病毒检验，结果各项检验全部合格。表明我们自行制备的阳性确定可满足鉴定需要。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。