发明领域
本发明涉及一种肽组合，其可用于治疗或预防1型糖尿病(t1d)。
发明背景
1型糖尿病(t1d)是自身免疫性疾病，其特征在于代谢功能障碍、最为显著地葡萄糖代谢失调，伴有特征性长期血管和神经并发症。t1d是最常见的自身免疫性疾病之一，影响美国的250名个体中的一名，在美国每年报道大约10,000至15,000个新病例，并且发病率上升。t1d的最高患病率见于北欧。
t1d的特征在于绝对胰岛素缺乏，从而使得患者依赖于外源性胰岛素而生存。在具有高血糖症的症状的t1d急性临床发作之前，存在长久无症状临床前时期，在所述时期期间产生胰岛素的β细胞进行性地毁坏。
β细胞自身抗原、巨噬细胞、树突细胞、b淋巴细胞以及t淋巴细胞已经显示牵涉于自身免疫性糖尿病的发病机理中。β细胞自身抗原被视为自β细胞释放且由抗原呈递细胞加工并呈递至t辅助细胞(cd4+细胞)。原始cd4+t细胞可通过自抗原呈递细胞释放的白细胞介素(il)-12活化。β细胞抗原特异性cd8+t细胞通过由活化的cd4+t细胞产生的il-2活化，分化至细胞毒性t细胞中，且募集至胰岛中。这些活化的th1cd4+t细胞以及cd8+细胞毒性t细胞牵涉于β细胞的破坏中。il-2还活化b淋巴细胞以分泌胰岛细胞自身抗体。
近年来，已鉴别胰岛细胞自身抗体所针对的若干自身抗原。这些自身抗原包括酪氨酸磷酸酶相关胰岛抗原2(ia-2)以及胰岛素、胰岛素原(pi)和前胰岛素原。
一旦开始，就需要终身通过注射合成胰岛素来治疗，因为β细胞无法再生。一旦确定，糖尿病就对患者、患者家庭以及社会为重大负担。尽管胰岛素的现代配药、制剂和递送系统可将血糖维持在合理界限内，但经过若干年，疾病的并发症不可避免地出现。糖尿病的最常见严重并发症是肾衰竭、失明和神经功能丧失。糖尿病患者的寿命减少平均10岁。鉴于此背景，重要的是考虑治疗或预防t1d的新方式。t细胞ia-2表位已鉴别于honeymanm等人(honeymanm等人molecularmedicine1998；4:231-239)；lohmannt等人(lohmannt等人expclinendocrinoldiabetes1999；107(3):166-71)；mclaughlinka等人(mclaughlinka等人jimmunol2014；193:4448-56)；以及weeninksm等人(weeninksm等人,jautoimmun2009；33:147-54)中。pi和/或ia-2肽也公开于us7049292、wo2005/073248、wo00/63702和wo2009/004315中。然而，本发明利用来自pi和ia-2两者的关键表位的新颖组合；和/或特定施用方案，其展现抗原特异性免疫疗法的优异效能以便限制为t1d的特征的pi/ia-2自身免疫性。
发明概述
在本发明的第一方面，提供一种肽组合，其包含：
具有seqidno:1的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:2的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:3的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:4的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:5的氨基酸序列的肽；以及
具有seqidno:6的氨基酸序列的肽。
seqidno:1是ia-2的片段，其包含残基718-736。
seqidno:2是ia-2的片段，其包含残基752-775。
seqidno:3是ia-2的片段，其包含残基855-867。
seqidno:4是pi的片段，其包含残基c13-c32。
seqidno:5是pi的片段，其包含残基c19-a3。
seqidno:6是pi的片段，其包含残基c22-a5。
本发明人已出人意料地发现，与更小数目的肽和替代性肽组合相比，此肽组合在限制抗pi和抗ia-2自身免疫性方面是优异的。出人意料地，还已证明，ia-2肽的不同组合在限制pi自身免疫性方面提供不同作用。当与其他肽组合相比时，本发明要求保护的肽组合具有优异效能。具体地说，本发明的肽组合展现跨抗原连锁性抑制，其在治疗利用时对于患者可具有显著益处。其允许来自有限数目的自身抗原的有限数目的肽用于靶向多种不同的自身免疫应答，所述应答在t1d中起一定作用。
如本文所述，术语“肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键(即，肽等排体)连接至彼此的氨基酸的任何肽。肽通常将含有天然存在的氨基酸，但可包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中熟知的化学修饰技术而修饰的氨基酸序列。此类修饰充分描述于基本文本中。修饰可存在于肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应了解，同一类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定肽中的若干位点。此外，给定肽可含有许多类型的修饰。
在一个优选实施方案中，肽组合不包含来自ia-2或pi的其他肽。
优选地，所要求保护的肽组合包含本发明的确切序列且不包含ia-2或pi的较长片段或全长ia-2或pi。
对本领域的技术人员将显而易见，本发明的肽组合可包含非肽组分，诸如如下文进一步论述的赋形剂，但其可能不包含任何额外肽、特别是来自ia-2或pi的肽。
优选地，补足肽组合的肽是分离的肽。术语“分离的”是指肽自其原始环境移除。例如，存在于活动物中的肽未经分离，但自天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同肽或这种肽的片段是分离的。此类肽可以是载体的一部分和/或肽可以是组合物的一部分，且仍经分离，因为这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。
在一个优选实施方案中，肽组合由以下各项组成：
具有seqidno:1的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:2的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:3的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:4的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:5的氨基酸序列的肽；以及
具有seqidno:6的氨基酸序列的肽。
在此优选实施方案中，肽组合仅包含具有特定所叙述序列的所叙述肽。
本发明的第二方面涉及一种药学上可接受的组合物，其包含本发明的肽组合和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
优选地，药物组合物包含半胱氨酸。所述组合物内游离半胱氨酸的存在稳定化肽组合的肽形成链间二硫键且因此沉淀的任何趋势。所述药物组合物可包含1至5mgl-半胱氨酸/2mg肽组合，优选2至4mgl-半胱氨酸/2mg肽组合，且最优选2.5mgl-半胱氨酸/2mg肽组合。
所述药物组合物可用于人或动物用途用于人和兽药物物中且通常将包含一种或多种合适的赋形剂。用于治疗用途的可接受赋形剂是药物领域中熟知的，且描述于例如remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.(a.r.gennaro编1985)中。药物赋形剂的选择可关于预期施用途径和标准药物实践来选择。作为赋形剂或除赋形剂之外，药物组合物可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。
防腐剂、稳定剂和染料可提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。
可存在取决于不同递送系统的不同组合物/制剂需求。例如，本发明的药物组合物可被配制为胃肠外递送，其中组合物以可注射形式配制，以用于通过例如静脉内、皮内、肌肉内、皮下或腹膜内途径递送。对于胃肠外施用，组合物可最优选以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可含有其他物质，例如充足的盐或单糖以使溶液与血液等张。组合物还可被配制为通过经口或局部途径施用，所述途径包括经鼻、经口或经表皮地。优选地，组合物被配制为通过皮内途径递送。
皮内施用途径包括任何皮肤进入方式，例如使用基于微针的注射和输注系统(或准确靶向皮内空间的其他方式)；将液体或粉末无针或不用针弹道注射至皮内空间中；芒图型皮内注射；通过微型装置的增强的离子电渗疗法；以及使流体、固体或其他给药形式直接沉积至皮肤中，包括使用贴片以将组合物沉积到皮肤上。
通常，医师将确定将最适用于个别受试者的实际剂量，且其将随特定患者的疾病、年龄、体重和应答而变化。对于人适当的剂量可由本领域的技术人员例如使用体表面积(bsa)标准化来确定。例如，药物组合物可包含约0.1μg至15mg总肽/单次剂量、优选1μg至12mg总肽/单次剂量。在一个优选实施方案中，施用240μg(针对60kg成年人bsa标准化的1μg剂量)总肽/单次剂量，肽以等摩尔比率存在。在另一个优选实施方案中，施用12mg总肽/单次剂量，肽以等摩尔比率存在。
在一个优选实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每1至4周一次施用，持续四次施用。
在一个实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每2至4周一次施用，持续四次施用。
在另一实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每周一次施用，持续四周。
药物组合物还可包含促进耐受性的佐剂和/或促进耐受性的细胞。促进耐受性的佐剂包括il-10、重组霍乱毒素b亚单位(rctb)、toll样受体2的配体以及调节免疫应答的生物制剂和单克隆抗体，诸如抗cd3和共刺激阻断剂，其可与肽组合共同施用。促进耐受性的细胞包括不成熟的树突细胞和用维生素d3(1α,25-二羟基维生素d3)或其类似物处理的树突细胞。优选地，本发明的肽组合中的一种或多种肽缀合至用维生素d3或其类似物处理的树突细胞的表面。优选地，本发明的肽组合中的全部肽缀合至用维生素d3或其类似物处理的树突细胞的表面。
本发明的第三方面涉及本发明的药学上可接受的组合物，其用于治疗。
本发明的第四方面涉及本发明的药学上可接受的组合物，其用于治疗或预防1型糖尿病(t1d)。
当t1d“经治疗”时，这是指t1d的一种或多种临床表现得到改善。其不是指t1d的症状得到完全治疗以使得其不再存在于患者中，但在一些方法中，可能是此情况。“治疗”导致t1d的一种或多种症状比在治疗之前严重程度更小。
本发明的第五方面涉及本发明的药学上可接受的组合物，其用于制造用于治疗或预防1型糖尿病(t1d)的药剂。
本发明的第六方面涉及一种治疗或预防1型糖尿病(t1d)的方法，其中向t1d患者或被鉴别为处于t1d高风险下的非糖尿病个体施用本发明的药学上可接受的组合物。
优选地，向具有β细胞质量剩余的患者施用本发明的药学上可接受的组合物。
本发明的第七方面涉及一种用于治疗或预防1型糖尿病(t1d)的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的肽组合。
本发明的第八方面涉及一种诊断或确定治疗功效的方法，其包括：(a)提供来自疑似患有或易患t1d的个体的cd4淋巴细胞；(b)提供抗原呈递细胞(apc)群体，所述细胞在其表面上携带具有与由所述个体表达的等位基因相同的等位基因的ii类mhc分子，所述apc群体已与本发明的肽组合接触，并且所述ii类mhc分子结合至本发明的肽组合中的一种或多种肽；或(c)提供可溶性肽-hla多聚体试剂，其包含具有与由所述个体表达的等位基因相同的等位基因的ii类mhc分子，所述mhc分子已结合至本发明的所述肽组合中的一种或多种肽；(d)使(b)的所述apc群体或(c)的所述肽-hla多聚体与(a)的所述cd4淋巴细胞接触；以及(e)确定所述cd4淋巴细胞是否识别所述ii类mhc结合肽，作为所述个体患有或易患t1d的指示。
这种apc可以是b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞或全外周血单核细胞(pbmc)。apc还可以是源自b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的永生化细胞系。在受试者是人时，apc还可以是t细胞，因为人t细胞能够表达ii类mhc分子。所述方法进一步包括如果所述cd4淋巴细胞识别所述ii类mhc结合肽，则向所述个体施用本发明的肽组合。
本发明的第九方面涉及一种肽组合，其包含：
具有seqidno:4的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:5的氨基酸序列的肽；以及
具有seqidno:6的氨基酸序列的肽
其用于治疗或预防1型糖尿病(t1d)，其中所述组合用于至少每月一次、优选每1至4周一次施用，持续四次施用。
在一个实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每2至4周一次施用，持续四次施用。
在另一实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每周一次施用，持续四周。
“其中所述组合物用于施用”是指施用所述组合。优选地，所述肽组合用于以240μg或12mg总肽的剂量施用，肽以等摩尔比率存在。
优选地，所述肽组合被配制为包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药学上可接受的组合物。优选地，所述组合物被配制为通过胃肠外、经口或局部途径递送，所述途径包括静脉内、皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、经鼻、经口或经表皮途径，且更优选地，所述组合物被配制为通过皮内途径递送。
本发明的第十方面涉及一种治疗或预防1型糖尿病(t1d)的方法，其中至少每月一次、优选每1至4周一次向t1d患者或被鉴别为处于t1d高风险下的非糖尿病个体施用包含以下各项的肽组合：
具有seqidno:4的氨基酸序列的肽；
具有seqidno:5的氨基酸序列的肽；以及
具有seqidno:6的氨基酸序列的肽
持续四次施用。
在一个实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每2至4周一次施用，持续四次施用。
在另一实施方案中，包含本发明的肽组合的组合物至少每月一次、优选每周一次施用，持续四周。
优选地，所述组合以240μg或12mg总肽的剂量施用，肽以等摩尔比率存在。
优选地，所述肽组合被配制为包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药学上可接受的组合物。优选地，所述组合物被配制为通过胃肠外、经口或局部途径递送，所述途径包括静脉内、皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、经鼻、经口或经表皮途径，且更优选地，所述组合物被配制为通过皮内途径递送。
熟练的技术人员将了解，本发明的全部方面，不论其涉及例如肽组合物、其用途、药学上可接受的组合物抑或治疗方法，同等地适用于本发明的全部其他方面。具体地说，肽组合的方面例如可能比在本发明的其他方面(例如肽组合的用途)中更详细地描述。然而，熟练的技术人员将了解，在已关于本发明的特定方面给出更详细信息时，此信息通常同等地适用于本发明的其他方面。
发明详述
本发明现将参考附图仅以举例的方式详细描述，其中：
图1示出3种亲本序列的结果，其以交叉影线示出且与较短巢式序列肽相比，以显示使用干扰素-γ的产生作为读出、通过酶联免疫斑点检测的t1d患者应答的百分比。
图2示出在用多肽组合物免疫以衍生糖尿病相关自身免疫性的临床前模型之后t细胞增殖作为pi和ia-2特异性自身免疫性的读出的结果。
图3示出在用多肽组合物处理自身免疫性hla-dr4tg小鼠之后t细胞增殖作为pi和ia-2自身免疫性的读出的结果。
图4示出，用3种pi肽的组合处理小鼠比用单一pi肽处理更有效。简言之，小鼠中对胰岛素原的耐受性通过用100μg于cfa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫和在免疫之后即刻和1天用腹膜内百日咳毒素处理而破坏。小鼠随后接受4次每周一次的10μg对照-pi或胰岛素原单/多pi(c13-32(seqidno:4)；c19-a3(seqidno:5)；c22-a5(seqidno:6))的皮内处理，随后用100μg于ifa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫以加强不间断的自身免疫应答(a)。7天后收获淋巴结(ln)，且将ln细胞悬浮液在有或无胰岛素原蛋白质或肽(c13-32；c19-a3；c22-a5)下体外培养48小时。通过cfse稀释度在96小时(b)和通过elisa在48小时(c)分析，响应于用50μg/ml胰岛素原蛋白质和10μg/ml肽(c13-32；c19-a3；c22-a5)的体外刺激，cd4+t细胞的增殖和ifn-γ产生。在第42天测量胰岛素原特异性igg1的血清水平(d)。在第42天通过流式细胞术于ln培养物中测量增殖的cd3+cd4+cd25高foxp3+treg的百分比(e)。数据代表三个独立实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；通过单向anova或学生t检验确定统计显著性。b和c中每组有15只小鼠；d-f每组有5只小鼠。
图5示出，增加频率的低剂量多pi比更高剂量或更少治疗对逆转对全胰岛素原的耐受性的破坏更有效。小鼠中对胰岛素原的耐受性通过用100μg于cfa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫和在免疫之后即刻和1天用腹膜内百日咳毒素处理而破坏。小鼠随后接受4次或2次每周一次的10μg或1μg由3种胰岛素原肽(c13-32；c19-a3；c22-a5)组成或对照ha肽的皮内治疗，随后用100μg于ifa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫以加强不间断的自身免疫应答(a)。在第42天收集ln，且将ln细胞在有或无胰岛素原蛋白质或肽(c13-32；c19-a3；c22-a5)下体外培养48小时。通过胸苷并入和elisa分析响应于50μg/ml胰岛素原的增殖和细胞因子产生以及平均值±sem增殖(b)，以及响应于50μg/ml胰岛素原的ifn-γ产生(c)，或在dln培养物中显示10μg/ml胰岛素原肽。在第42天通过流式细胞术于ln培养物中测量增殖的cd3+cd4+cd25高foxp3+treg的百分比(e)。在第42天测量胰岛素原特异性igg1的血清水平(f)。数据代表至少两个独立实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；通过单向anova或学生t检验确定统计显著性。每组有6只小鼠。
图6显示，用3种pi肽处理增强抗原特异性调控。与对照-pi处理的小鼠相比，来自用胰岛素原多pi处理的小鼠的treg具有增强的胰岛素原特异性抑制因子活性。小鼠中对胰岛素原的耐受性通过用100μg于cfa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫以及在免疫之后即刻和1天用腹膜内百日咳毒素治疗而破坏。小鼠随后接受4次每周一次的1μg由3种胰岛素原肽(c13-32；c19-a3；c22-a5)组成的pi或对照ha肽的皮内处理，随后用100μg于ifa中乳化的胰岛素原蛋白质皮下免疫以加强不间断的自身免疫应答(a)。在第42天收获ln，并且将cd4+cd25高treg分离且以不同浓度与来自用胰岛素原/cfa免疫的小鼠的cfse标记的应答t细胞共培养。将细胞在αcd3αcd28戴诺磁珠(dyna-beads)(b)或胰岛素原蛋白质(c)存在下共培养，且在96小时通过流式细胞术通过测量cfse稀释度来计算应答cd4+t细胞的增殖。cfse标记的应答细胞在来自ha或胰岛素原-pit处理的小鼠的降低浓度的cd4+cd25高treg存在下响应于50μg/ml胰岛素原的平均值±sem增殖(d)。通过单向anova或学生t检验确定统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，每组有15只小鼠(汇集的淋巴结)。
实施例1
经由诱导胰岛素原特异性/ia-2特异性自身反应性产生糖尿病相关自身免疫性的小鼠模型
b6.129s2-h2-ab1tm1grutg(hla-dra/h2-ea,hla-drb1*0401/h2-eb)1kito小鼠(hla-dr4-tg)(1)自taconic,usa进口，且用于全部实验中。全部动物均是不含规定病原体的且在king'scollegelondonbiologicalservicesunit根据homeofficeregulations维持在标准条件下。
在尾巴基部用于完全弗氏佐剂(cfa，sigma-aldrich)中乳化的100μg全重组人胰岛素原蛋白质(biomm,brazil)和/或重组人胰岛素瘤相关抗原-2(ia-2；proteogenix)皮下激发小鼠。在免疫时和1天后用经由腹膜内腔递送的200ng百日咳毒素(ptx,sigma-aldrich)处理小鼠。当测试肽免疫疗法时，在最后一次肽疗法处理之后7天，在尾巴基部用100μg于不完全弗氏佐剂(ifa，sigma-aldrich)中乳化的自身抗原(胰岛素原和/或ia-2)皮下地进一步加强自身免疫应答。通过测试对胰岛素原或ia-2的回忆应答，获得胰岛素原和ia-2特异性自身免疫性的诱导的证据，以展现t细胞增殖和t细胞炎性细胞因子产生。
图2的图形示出在用于具有百日咳毒素(ptx)佐剂的cfa中的这些自身抗原使人源化小鼠(hla-dr4tg：关于人肽呈递分子hla-dr4转基因的小鼠)免疫之后，针对自身抗原胰岛素原(pi)和ia-2的促炎性细胞因子产生(分别为图a和b)以及t细胞增殖(分别为图c和d)。充分确定，响应于这些自身抗原的通过t细胞的增殖和促炎性细胞因子产生为人1型糖尿病的特征。因此，这些数据表明，如所示操纵的hla-dr4tg小鼠可重演人疾病的自身免疫性特征。
实施例2
测量小鼠中胰岛素原和ia-2特异性t细胞增殖、炎性细胞因子产生以及增殖的调控t细胞(treg)的诱导
使用bd细胞过滤器(70μm)使引流淋巴结(dln)均质化。将细胞于rpmi中洗涤，且以2.5×106个细胞/ml再悬浮于含有0.5％自体同源小鼠血清的rpmi中。添加2.5×105个细胞至u底板的各孔中。用单独培养基、α-cd3/α-cd28戴诺磁珠(invitrogen)作为阳性对照刺激物或用胰岛素原蛋白质或ia-2再刺激细胞。在48小时，移除上清液以用于细胞因子分析，且添加0.5mci/孔氚化胸苷[3h]。18小时后使用microbetatrilux机器(perkinelmer)收获细胞。使用现成set-go试剂盒(ebiosciences)根据制造商的指南测量在48小时获取的培养物上清液中的ifn-γ和il-10水平。
根据标准方案进行流式细胞术。以1:100的稀释度添加抗体(ab)(抗cd4-percp、抗foxp3-apc、抗cd3-pe、抗cd25-fitc、抗ki67-pacificblue(均来自ebioscience,uk)、抗cd11c-pecy7、抗pdl1-pe、抗cd86-fitc、抗hla-apc(均来自bdbioscience))至各样品中。使用标准试剂盒且根据制造商的指南(biolegend)进行细胞内染色。使用配备有405-nm紫光激光器、488-nm氩激光器和635-nm红色二极管激光器(bdbioscience)的facscantoiii流式细胞仪和flowjo软件分析样品。首先使用前向和侧向散射参数根据大小和颗粒度鉴别淋巴细胞。随后基于cd3和cd4表达鉴别cd4+t细胞。基于高cd25表达和foxp3表达表征调控t细胞。最终，基于核蛋白ki67的上调，鉴别增殖的调控cd3+cd4+foxp3+cd25高t细胞。
实施例3
胰岛素原特异性调控
小鼠中对胰岛素原的耐受性如先前所描述而破坏。小鼠随后接受4次每周一次的1μg对照-pi或胰岛素原多pi(包含等摩尔量的c13-22、c19-a3和c22-a5)的皮内治疗，随后通过皮下注射胰岛素原/ifa加强对胰岛素原的不间断的自身免疫应答。移除淋巴结，且使用cd4t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec,germany)通过阴性选择分离cd4+t细胞。然后用抗cd25-fitc(ebioscience)对细胞染色，且通过荧光活化细胞分选(facs)使用bdfacsaria分离cd4+cd25高抑制t细胞。将来自胰岛素原/cfa免疫小鼠的应答细胞如先前所描述用cfse标记，且与cd4+cd25高t细胞一起在单独培养基、α-cd3α-cd28戴诺磁珠或胰岛素原蛋白质下共培养96小时。通过流式细胞术测量应答细胞的增殖(对应于cfse损失)。通过下式计算抑制％：
实施例4
鉴别人t1d患者中的最优ia-2序列
使用酶联免疫斑点(elispot)测定进行响应于肽刺激通过cd4+t细胞产生的干扰素(ifn)-γ的检测，所述测定如先前所描述在盲法熟练测试中对1型糖尿病具有显著识别能力(arif,s.等人jclininvest2004；113:451-463和herold,k.c.等人diabetes2009；58:2588-2595)。数据表示为每一式三份的平均斑点数，且与在单独稀释剂存在下的平均斑点数相比(刺激指数；si)。当使用利用如先前所描述的受试者工作特征图(receiver-operatorcharacteristicplot)确定的截止值，si≥3时，应答视为阳性的(arif,s.等人jclininvest2004；113:451-463)。
图1示出对通过洗脱鉴别的巢嵌于特异性肽系列内的表位的1型糖尿病患者应答的比例(呈％形式)(参见peakmanm等人jclininvest1999；104:1449-57)。示出3种亲本序列的结果(交叉影线)，且将这些与较短巢式序列肽相比较。如使用酶联免疫斑点测定所检测，应答代表通过与各肽一起培养的外周血单核细胞的ifn-γ产生。
图1说明709系列(718-36)和853系列(855-67)内的优先序列。752系列的巢式肽中无一者明显优异。
实施例5
肽组合
若干胰岛素原(pi)和ia-2肽组合被选择用于评估为在诱导免疫调控方面最优。参见以下表1。
表1-肽免疫疗法治疗中使用的肽混合物
seqidno:7是ia-2的片段，其包含残基718-730。
seqidno:8是ia-2的片段，其包含残基855-869。
seqidno:9是ia-2的片段，其包含残基709-732。
seqidno:10是ia-2的片段，其包含残基856-870。
seqidno:11是ia-2的片段，其包含残基709-736。
seqidno:12是ia-2的片段，其包含残基853-872。
实施例6
特定六肽组合在限制胰岛素原和ia-2自身免疫性方面比若干其他试用组合更有效
通过用强佐剂和pi/ia-2免疫化，致使hla-dr4转基因(人源化)小鼠“自身免疫性”，以如上所描述诱导对pi和ia-2的炎性应答。炎性应答包括t细胞增殖和炎性细胞因子产生，男性自身免疫性(1型)糖尿病的主要标志。将小鼠分配至5个如表1中所示用肽混合物或对照的处理组。
如以上实施例1中所描述在b6.129s2-h2-ab1tm1grutg(hla-dra/h2-ea,hla-drb1*0401/h2-eb)1kito小鼠(hla-dr4-tg)中诱导针对pi和ia-2的自身免疫应答。为检查以肽免疫疗法形式施用的不同肽组合对诱导的自身免疫应答的作用，每周一次通过皮内注射(10μg总肽含量/注射，肽呈等摩尔比率)于100μl无菌pbs中向下腹递送表1中所示的肽组合或对照(注射用水)，持续4周。7天后通过如实施例2中所描述，检查淋巴结细胞针对pi和ia-2的增殖和细胞因子产生来测试对pi和ia-2的自身免疫应答。
用对照处理的小鼠将具有稳健t细胞增殖和炎性细胞因子应答。在疗法有效时，这些应答将显著减少。
结果表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。通过d'agostino&pearson多项正态性测试证实高斯分布(gaussiandistribution)，随后通过单向anova或学生t检验确定显著性。p<0.05的值视为显著。
图3表示对获自已通过免疫针对pi和ia-2变得自身免疫性的hla-dr4tg小鼠的淋巴结细胞的体外pi(图a)和ia-2(图b)的回忆增殖应答。随后用表1中规定的对照或肽组合之一处理小鼠。图3中的数据被示为来自n＝8/组的平均值(sem)。
图3a说明，组1组合是与对照相比提供pi自身免疫性的统计上显著降低的唯一混合物。组1组合在降低自身免疫性方面比其最接近替代型式显著更好。组3和组4不显著降低自身免疫性。
图3b说明，组1组合是与对照相比提供ia-2自身免疫性的统计上显著降低的唯一混合物。组1组合在降低自身免疫性方面比其最接近替代型式显著更好。组3和组4不显著降低自身免疫性。
通过组1肽实现增殖的显著减少(即对pi和ia-2的自身免疫性的控制)，所述肽因此显示作为耐受原的最优效能。值得注意地，组1-4肽仅在ia-2组成方面不同。pi肽在全部组中均为相同的，但组1肽组合在限制pi特异性自身免疫性方面也是优异的。这表明跨抗原连锁性抑制的现象。
上述结果证明，与替代性肽组合相比，本发明要求保护的新颖肽组合在限制抗pi和抗ia-2自身免疫性方面是优异的。出人意料地，已证明，ia-2肽的不同组合在限制pi自身免疫性方面提供不同作用。这是跨抗原连锁性抑制的证明，所述跨抗原连锁性抑制对患者可具有显著治疗益处。来自有限数目的自身抗原的有限数目的肽可用于靶向多种不同自身抗原，所述自身抗原在t1d中起一定作用。
实施例7
特定pi三肽组合在限制胰岛素原自身免疫性方面比各单独pi肽更有效
如以上实施例1中所描述在b6.129s2-h2-ab1tm1grutg(hla-dra/h2-ea,hla-drb1*0401/h2-eb)1kito小鼠(hla-dr4-tg)中诱导针对pi的自身免疫应答。
此pi自身免疫性模型用于评估单和多胰岛素原肽调节对胰岛素原的确定自身免疫应答的能力。通过用4次每周一次的单pi或多pi(全部3种胰岛素原肽的等摩尔混合物)皮内注射处理hla-dr4-tg小鼠，研究各hla-dr4限制胰岛素原肽的耐受原潜力。在用全胰岛素原-ifa二次激发，以加强不间断的自身免疫应答之后，体外分析回忆应答(图4a)。多pi显著下调引流淋巴结(dln)培养物响应于胰岛素原和胰岛素原肽而非卵白蛋白(ova)的抗原特异性增殖能力(图4b)。另外，多pi显著减少炎性介质ifn-γ(图4c)、il-17和il-13(数据未示出)的合成。令人感兴趣地，未观察到il-10的抗原特异性诱导(图4d)。多pi在下调体内对胰岛素原蛋白质的应答方面也是有效的，如胰岛素原特异性igg的降低的血清水平所指示(图4e)。相比之下，具有个别c13-32、c19-a3或c22-a5肽的单pi显示较低治疗效力水平(图4e-4f)。
关于这些作用的机制，通过流式细胞术对dln的分析证明，与对照-pi处理的小鼠相比，在多pi之后淋巴结中增殖的treg的比例显著增加(图2f)。再次，3种胰岛素原肽的组合在诱导treg增殖方面比单pi更有效，从而表明多种pi肽在调节确定自身免疫应答方面比单一pi肽更有效。
实施例8
最优化肽剂量和施用
2次或4次用1或10μg多pi处理小鼠(图5a)。为确定减少的多pi频率和/或剂量的作用，通过测量dln细胞悬浮液针对胰岛素原蛋白质和胰岛素原肽的增殖和细胞因子产生来体外分析回忆应答(图5b-5d)。将多pi处理的数目从4减至2导致治疗效力实质性损失。相比之下，4次多pi的处理在下调对胰岛素原的应答方面是有效的，且1μg的减少剂量似乎与10μg多pi一样有效(图5b-5d)。在二次免疫后7天通过流式细胞术对dln组成的分析显示，与已接受对照-pi的小鼠相比，已接受多pi的小鼠中调控t细胞增殖的水平增加，处理组之间未观察到显著差异(图5e)。胰岛素原特异性血清igg水平通过多pi下调，且在已接受4次10μg多pi处理的小鼠中显著降低(图5f)。
实施例9
用三种pi肽处理增强抗原特异性调控
通过测量与接受活性处理的小鼠相比，用对照-pi处理的小鼠的treg区室中的胰岛素原特异性抑制因子活性来评估多pi对treg功能的影响。将cd4+cd25高调控t细胞从用对照-pi或胰岛素原多pi处理的小鼠分离，且以不同浓度与来自用胰岛素原/cfa免疫的小鼠的cfse标记的应答t细胞共培养(图6a)。将细胞在抗cd3/抗cd28免疫磁性珠粒存在下共培养，以测量对照-pit和多pittreg抑制多克隆应答的能力。在两种处理条件下产生的treg展现等效抑制能力(图6b)。然而，在用胰岛素原蛋白质刺激的共培养物中，存在不同处理相关的抑制能力(图6c)。来自多pi处理小鼠的treg比来自对照-pi处理小鼠的treg显著更大程度地抑制胰岛素原特异性应答(图6d)。
本说明书中引用的全部专利和参考文献以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110>伦敦国王学院
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