本发明涉及新的四价多特异性抗体、其制造和用途。
背景技术：
：工程化的蛋白质，如能够结合两种或更多种抗原的双特异性或多特异性抗体是本领域已知的。可以使用细胞融合、化学缀合或重组dna技术产生此类多特异性结合蛋白。近来已经开发了多种重组多特异性抗体形式，例如，通过融合例如igg抗体形式与单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如coloma,m.j.等人naturebiotech.15(1997)159-163；wo2001/077342；和morrison,s.l.,naturebiotech.25(2007)1233-1234)。产生多特异性抗体的一个缺点是除了所需的功能分子之外，形成各种不需要的副产物。错配包括将错误的重链相互配对、以及将轻链与错误的重链对应物配对或不需要的轻链配对。当产生双特异性抗体时，一种避免错配副产物问题的方法称为“杵臼(knob-into-hole)技术”，其旨在通过将突变引入ch3结构域以修饰接触界面来强制配对两种不同的抗体重链。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸置换以产生“臼”。相反，具有大侧链的氨基酸被引入到另一个ch3结构域中，以产生“杵”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链，其必须适用于两条重链)，相对于同二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)观察到高产率的异二聚体形成(“杵-臼”)(ridgway,j.b.等人,proteineng.9(1996)617-621；和wo96/027011)。通过使用噬菌体展示方法重塑两个ch3结构域的相互作用表面并引入二硫键桥以稳定异二聚体可进一步增加异二聚体的百分比(merchant,a.m.等人,naturebiotech.16(1998)677-681；atwell,s.等人,j.mol.biol.270(1997)26–35)。杵臼技术的新方法在例如ep1870459a1中描述。虽然这种形式看起来非常有吸引力，但目前还没有数据描述向临床的进展。该策略的一个重要限制是为了防止错配副产物的形成，两个亲本抗体的轻链必须相同以防止错配和形成无活性分子。因此，该技术不适合作为从针对第一和第二抗原的两种抗体出发容易地开发针对三种或四种抗原的重组三或四特异性抗体的基础，因为这些抗体的重链和/或相同轻链必须首先被优化，然后必须加入针对第三和第四抗原的另外的抗原结合肽。涉及异二聚化多肽的wo2013/02362中描述了用于支持fc结构域配对的其他方法。wo2013/12733涉及包含异二聚化fc区的多肽。wo2012/131555涉及工程化的异二聚体免疫球蛋白。ep2647707涉及工程化的异二聚体免疫球蛋白。避免在双特异性抗体产生中错配副产物问题的一种方法旨在强制轻链多肽与其正确的重链对应物配对。这种被称为“crossmab技术”的方法基于重链和轻链之间的结构域交叉，从而为不同特异性的重链和轻链创建不同的结构域排列。wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253、wo2009/080254和schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191涉及具有结构域交叉的二价双特异性igg抗体。wo2010/145792和wo2010/145792涉及具有结构域交叉的四价抗原结合蛋白。在wo2009/080252中描述的在一个结合位点中具有vh/vl置换/交换以预防轻链错配的多特异性抗体(crossmabvh-vl)(还参见schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191)明显减少由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配引起的副产物(与没有这样的结构域交换的方法相比)。然而，其制剂并没有完全无副产物。主要副产物基于错误的轻链与结构域交换的重链的bence-jones型相互作用(也参见schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191；在增补中的图s1i)。wo2015/101588a1涉及血脑屏障穿梭组件。wo2015/101588a1提及在一个结合臂中具有vh/vl结构域交叉的在ch1/cl界面中具有突变的二价双特异性抗体。wo2015/101588a1没有提及所述突变的技术效果。仍需要进一步减少此类副产物以改善例如此类双特异性抗体的纯度。特征在于使其适用于治疗用途的抗体也可以得到改善。技术实现要素：一方面，本发明涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-在cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-在ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。在根据本发明第一方面的抗体的一个实施方案中，不包含i)中结构域交叉的fab片段包含ii)中的氨基酸取代。另一方面，本发明涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与排列在所述重链上的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-在cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-在ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。在根据本发明第二方面的抗体的一个实施方案中，不包含i)中结构域交叉的fab片段包含ii)中的氨基酸取代。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代，并且在cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中不包含如ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：位置124的氨基酸被e或d取代。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中b)中的另外的fab片段融合至核心抗体重链的c-末端。本发明的一个实施方案涉及抗体，其是双特异性的。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中多特异性抗体包含两个恒定重链结构域3(ch3)，所述两个恒定重链结构域3(ch3)进行以下改变以促进异二聚化：通过用比原始氨基酸残基具有更大侧链体积的氨基酸残基取代至少一个原始氨基酸残基而在一个ch3结构域中产生突起，并且通过用比原始氨基酸残基具有更小侧链体积的氨基酸残基取代至少一个原始氨基酸残基而在另一个ch3结构域中产生空腔，使得在一个ch3结构域中产生的突起可定位于在另一个ch3结构域中产生的空腔中。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含两个ch3结构域，所述两个ch3结构域进行以下改变以促进异二聚化：通过用带正电荷的氨基酸取代一个ch3结构域中的至少一个原始氨基酸残基，并且用带负电荷的氨基酸取代另一个ch3结构域中的至少一个原始氨基酸残基。本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含两个ch3结构域，所述两个ch3结构域进行以下改变以促进异二聚化：通过在每个ch3结构域中引入至少一个半胱氨酸残基使得在ch3结构域之间形成二硫键。本发明的另一个方面是编码根据本发明的抗体的核酸。本发明的另一个方面是包含根据本发明的核酸的表达载体。本发明的另一个方面是包含根据本发明的核酸的宿主细胞。本发明的另一个方面是包含根据本发明的多特异性抗体的药物或诊断组合物。本发明的另一个方面是包含根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物。根据本发明，通过在ch1和cl结构域的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷氨基酸的取代可以改善所需的多特异性抗体与不需要的副产物(如例如bencejones型产物)相比的比率。此外，改善本发明的抗体中聚集的行为，导致更低的聚集分数，由此改善了所需抗体分子的总产率。附图说明图1：根据本发明第一方面的四价多特异性抗体的示例性说明，即包含核心抗体的抗体，所述核心抗体包含结合相同抗原的两个fab片段。图1a和b：包含核心抗体的四价多特异性抗体，所述核心抗体具有特异性结合第一抗原的两个fab片段，其中特异性结合第二抗原的另外的fab片段通过肽连接子融合至每条重链的c-末端。所述另外的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉。在核心抗体内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。图1c：包含核心抗体的四价多特异性抗体，所述核心抗体具有特异性结合第一抗原的两个fab片段，其中特异性结合第二抗原的另外的fab片段通过肽连接子融合至每条重链的c-末端。肽连接子可排列成连接ch3和另外的fab的vl结构域(描绘)，或者可选地连接ch3和另外的fb的vh结构域(未描绘)。通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变，所述另外的fab片段在ch1/cl界面内包含修饰。核心抗体的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉。图1d：包含核心抗体的四价多特异性抗体，所述核心抗体具有特异性结合第一抗原的两个fab片段，其中特异性结合第二抗原的另外的fab片段通过肽连接子融合至每条重链的n-末端。所述另外的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉。在核心抗体内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。图1e：包含核心抗体的四价多特异性抗体，所述核心抗体具有特异性结合第一抗原的两个fab片段，其中特异性结合第二抗原的另外的fab片段通过肽连接子融合至每条重链的n-末端。通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变，所述另外的fab片段在ch1/cl界面内包含修饰。核心抗体的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉。图2：根据本发明第二方面的四价多特异性抗体的示例性说明，即包含核心抗体的抗体，所述核心抗体包含结合不同抗原的两个fab片段。图2a：包含具有两个fab片段的核心抗体的四价多特异性抗体，其中一个fab片段特异性结合第一抗原，另一个fab片段特异性结合第二抗原。另外的fab片段融合至每条重链的c-末端。所述另外的fab片段与其所融合的重链特异性结合相同的抗原(在该实施例中：融合至特异性结合第一抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第一抗原；相反，融合至特异性结合第二抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第二抗原)。与所述另外的fab片段融合的重链的fab片段和所述另外的fab片段都包含相同的修饰：在该实施例中，特异性结合第二抗原的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉，并且在特异性结合第一抗原的fab片段内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。图2b：包含具有两个fab片段的核心抗体的四价多特异性抗体，其中一个fab片段特异性结合第一抗原，另一个fab片段特异性结合第二抗原。另外的fab片段融合至每条重链的c-末端。所述另外的fab片段与其所融合的重链特异性结合相同的抗原(在该实施例中：融合至特异性结合第一抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第一抗原；相反，融合至特异性结合第二抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第二抗原)。与所述另外的fab片段融合的重链的fab片段和所述另外的fab片段都包含相同的修饰：在该实施例中，特异性结合第二抗原的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉，并且在特异性结合第一抗原的fab片段内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。核心抗体包含支持重链异二聚化的ch3/ch3界面中的修饰，例如，杵臼(knobs-into-holes)突变、在不同ch3结构域中具有相反电荷氨基酸的突变和/或另外的二硫键桥。图2c：包含具有两个fab片段的核心抗体的四价多特异性抗体，其中一个fab片段特异性结合第一抗原，另一个fab片段特异性结合第二抗原。另外的fab片段融合至每条重链的n-末端。所述另外的fab片段与其所融合的重链特异性结合相同的抗原(在该实施例中：融合至特异性结合第一抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第一抗原；相反，融合至特异性结合第二抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第二抗原)。与所述另外的fab片段融合的重链的fab片段和所述另外的fab片段都包含相同的修饰：在该实施例中，特异性结合第二抗原的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉，并且在特异性结合第一抗原的fab片段内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。图2d：包含具有两个fab片段的核心抗体的四价多特异性抗体，其中一个fab片段特异性结合第一抗原，另一个fab片段特异性结合第二抗原。另外的fab片段融合至每条重链的n-末端。所述另外的fab片段与其所融合的重链特异性结合相同的抗原(在该实施例中：融合至特异性结合第一抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第一抗原；相反，融合至特异性结合第二抗原的重链的另外的fab片段特异性结合第二抗原)。与所述另外的fab片段融合的重链的fab片段和所述另外的fab片段都包含相同的修饰：在该实施例中，特异性结合第二抗原的fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉，并且在特异性结合第一抗原的fab片段内，通过在cl结构域中引入带正电荷的氨基酸和在ch1结构域中引入带负电荷的氨基酸的特定突变修饰ch1/cl界面。核心抗体包含支持重链异二聚化的ch3/ch3界面中的修饰，例如，杵臼(knobs-into-holes)突变、在不同ch3结构域中具有相反电荷氨基酸的突变和/或另外的二硫键桥。图3a：四价抗dr5-fap抗体的结构域排列和氨基酸取代(实施例2)。dr5taa-0077对照抗体包含特异性结合dr5的核心抗体的结合臂中的vh/vl结构域交叉。主要副产物(中间)是具有一个非功能性结合位点的抗体，因为该抗体包含三个fap特异性轻链。本发明的dr5taa-0083抗体在右侧标出，指明ch1/cl界面中的氨基酸取代。图3b：四价抗dr5-fap抗体的结构域排列和氨基酸取代(实施例2)。dr5taa-0081对照抗体包含特异性结合fap的另外的fab片段的结合臂中的vh/vl结构域交叉。主要副产物(中间)是具有一个非功能性结合位点的抗体，因为该抗体包含三个fap特异性轻链。本发明的dr5taa-0082抗体在右侧标出，指明ch1/cl界面中的氨基酸取代。图4a-b：图4a：根据实施例3通过biacoretm评估的四价抗dr5-fap抗体的独立结合的示例性传感图；图4b：四价抗dr5-fap抗体dr5taa-0057(对照)/dr5taa-0077(对照)/dr5taa-0078(对照)的独立结合的传感图。图5a-c：图5a：根据实施例4通过biacoretm评估的四价抗dr5-fap抗体的同时结合的示例性传感图。图5b：四价抗dr5-fap抗体dr5taa-0057(对照)/dr5taa-0077(对照)/dr5taa-0078(对照)/dr5taa-0081(对照)的同时结合的传感图。图5c：四价抗dr5-fap抗体dr5taa-0082、dr5taa-0083的同时结合的传感图。发明详述1.定义术语“一(a)”、“一(an)”和“该”通常包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。文中使用的术语“或......或......”是指可不同时实现的替代特征。因此，当在本文中被为“x或y”时，意味着仅可以实现x或仅可以实现y，但不能实现“x和y”。本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。“多特异性抗体”结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个、四个或更多个不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的实例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。当抗体具有多于一种特异性时，识别的表位可以与单个抗原或与多于一种抗原相关。如本文所用，术语“价”表示抗体分子中存在特定数目的结合位点。天然抗体例如具有两个结合位点并且是二价的。如此，术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。根据本发明的抗体至少是三价的，即包含至少三个抗原结合位点。“抗体特异性”是指由抗体选择性识别抗原的特定表位。天然抗体，例如，是单特异性的。如本文所用的术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。表位是被抗体结合的抗原的区。术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子(如氨基酸、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基)的化学活性表面分组，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合抗原。如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定法中，优选在具有纯化的野生型抗原的等离子体共振测定法(biacore,ge-healthcareuppsala,sweden)中抗体与抗原表位的结合。抗体与抗原结合的亲和力由术语ka(从抗体/抗原复合物中抗体的结合速率常数)、kd(解离常数)和kd(kd/ka)定义。在一个实施方案中，结合或特异性结合意味着结合亲和力(kd)为10-8mol/l或更低，在一个实施方案中为10-8m至10-13mol/l。因此，根据本发明的多特异性抗体特异性结合各抗原，其对抗原是特异的，结合亲和力(kd)为10-8mol/l或更低，例如，结合亲和力(kd)为10-8至10-13mol/l。在一个实施方案中结合亲和力(kd)为10-9至10-13mol/l。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组合物的抗体分子的制剂。术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种。术语“人源化抗体”是指这样的抗体，其中框架或cdr已经被修饰以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的cdr。在一个优选的实施方案中，将鼠cdr接枝到人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如riechmann,l.等人,nature332(1988)323-327；和neuberger,m.s.等人,nature314(1985)268-270。本发明所涵盖的其他形式的人源化抗体是其中恒定区已被从原始抗体的恒定区另外修饰或改变以产生根据本发明的性质(特别是关于c1q结合和/或fc受体(fcr)结合)的那些抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是众所周知的(vandijk,m.a.,和vandewinkel,j.g.,curr.opin.chem.biol.5(2001)368-374)。也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体，所述转基因动物在免疫接种时能够产生完整的人抗体谱(repertoire)或人抗体的选择，而无内源性免疫球蛋白的产生。在这样的种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(参见，例如，jakobovits,a.等人,proc.natl.acad.sci.usa90(1993)2551-2555；jakobovits,a.等人,nature362(1993)255-258；bruggemann,m.等人,yearimmunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示文库中产生人抗体(hoogenboom,h.r.,和winter,g.,j.mol.biol.227(1992)381-388；marks,j.d.等人,j.mol.biol.222(1991)581-597)。cole等人和boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(cole等人monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77(1985)；和boerner,p.等人,j.immunol.147(1991)86-95)。如针对根据本发明的嵌合和人源化抗体已经提到的，本文所用的术语“人抗体”还包含这样的抗体，其在恒定区中被修饰，例如，以通过“类别转换”即fc部分的改变或突变(例如从igg1到igg4和/或igg1/igg4突变)产生根据本发明的性质，特别是关于c1q结合和/或fcr结合。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从宿主细胞(如ns0或cho细胞)或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体或用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经进行体内体细胞超突变。因此，重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是源自人种系vh和vl序列并且与其相关的序列，但是其可能并不天然存在于体内人抗体种系谱中。如本文所用，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示配体(例如抗原或其抗原片段)实际结合的并且源自抗体的抗体分子区。抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)或vh/vl对。特异性结合所需抗原的抗原结合位点可以源自a)特异性结合抗原的已知抗体或b)通过从头免疫接种方法获得的新抗体或抗体片段，特别是使用抗原蛋白或核酸或其片段或通过噬菌体展示。根据本发明的抗体的抗原结合位点可以含有六个互补决定区(cdr)，其对抗原的结合位点的亲和力具有不同程度的贡献。有三个重链可变结构域cdr(cdrh1、cdrh2和cdrh3)和三个轻链可变结构域cdr(cdrl1、cdrl2和cdrl3)。通过与编译的氨基酸序列数据库进行比较确定cdr和框架区(fr)的范围，其中这些区根据序列间的变异性来定义。在本发明的范围内还包括由较少的cdr组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三、四或五个cdr确定)。例如，少于完整的一组6个cdr可能足以用于结合。来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定结构域的氨基酸序列归入两种不同类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。野生型轻链通常含有两个免疫球蛋白结构域，通常为一个可变结构域(vl)(其对结合抗原重要)和恒定结构域(cl)。存在定义抗体的类别或同种型的几种不同类型的“重链”。野生型重链包含一系列免疫球蛋白结构域，通常具有一个可变结构域(vh)(其对结合抗原重要)和几个恒定结构域(ch1、ch2、ch3等)。术语“fc结构域”在本文中用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的c-末端区。例如在天然抗体中，fc结构域由两个相同的蛋白片段组成，其源自igg、iga和igd同种型中抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域；igm和igefc结构域在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。“抗体片段”是指不是完整抗体的分子，其包含结合完整抗体所结合抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv、scfab)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，“fab片段”是指包含轻链片段和重链的vh结构域和第一恒定结构域(ch1)的抗体片段，所述轻链片段包含轻链(cl)的vl结构域和恒定结构域。如本文所用的“可变结构域”或“可变区”表示直接参与抗体与抗原结合的轻链和重链对中的每一对。轻链的可变结构域缩写为“vl”，重链的可变结构域缩写为“vh”。人轻链和重链的可变结构域具有相同的一般结构。每个可变结构域包含四个框架(fr)区，其序列是广泛保守的。fr通过三个“高变区”(或“互补决定区”，cdr)连接。每条链上的cdr被这样的框架氨基酸分开。因此，抗体的轻链和重链从n-末端至c-末端方向包含结构域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。fr采用β片层构象，cdr可形成连接β片层结构的环。每条链中的cdr通过fr保持在其三维结构中并与来自另一条链的cdr一起形成“抗原结合位点”。特别地，重链的cdr3是对抗原结合贡献最大的区。cdr和fr区根据kabat,等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的标准定义来确定。在本申请中使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”表示除可变区以外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出各种效应功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分为以下类别：iga、igd、ige、igg和igm，其中几个可进一步分成亚类，例如igg1、igg2、igg3和igg4、iga1和iga2。对应于不同抗体类别的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(cl)称为κ(kappa)和λ(lambda)。如本文所用的“恒定结构域”来自人源，其来自igg1、igg2、igg3或igg4亚类的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这样的恒定结构域和区在现有技术中是众所周知的，例如，由kabat,等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)描述。如本文所用的术语“全长抗体”表示由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的抗体。全长抗体的重链是在n-末端至c-末端方向上由抗体重链可变结构域(vh)、抗体重链恒定结构域1(ch1)、抗体铰链区(hr)、抗体重链恒定结构域2(ch2)和抗体重链恒定结构域3(ch3)(缩写为vh-ch1-hr-ch2-ch3)组成的多肽；在ige亚类的抗体的情况下可选地包含抗体重链恒定结构域4(ch4)。在一个实施方案中，全长抗体的重链是在n-末端至c-末端方向上由vh、ch1、hr、ch2和ch3组成的多肽。全长抗体的轻链是在n-末端至c-末端方向上由抗体轻链可变结构域(vl)和抗体轻链恒定结构域(cl)(缩写为vl-cl)组成的多肽。抗体轻链恒定结构域(cl)可以是κ(κ)或1(λ)同种型。抗体链通过cl结构域和ch1结构域之间(即轻链和重链之间)以及全长抗体重链的铰链区之间的链间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如igg(例如igg1和igg2)、igm、iga、igd和ige。根据本发明的抗体可来自单个物种，例如人，或者其可以是嵌合或人源化抗体。形成根据本发明抗体的核心抗体的全长抗体包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点由一对vh和vl形成。形成根据本发明抗体的核心抗体的全长抗体可以包含具有相同抗原结合特异性的两个fab片段(第一方面，参见图1a-d)或可以包含具有不同抗原结合特异性的两个fab片段(第二方面，图2a-d)。如果核心抗体包含具有相同抗原结合特异性的两个fab片段，则全长抗体包含两个相同的fab片段。这两个fab片段可以(a)包含vh和vl结构域相同的结构域交叉，产生vh-cl结构域排列的轻链和包含vl-ch1结构域排列的重链(从n-末端至c-末端方向)(参见图1b和1d)，或(b)两个fab片段不包含结构域交叉，从而包含vl-cl结构域排列的轻链和包含vh-ch1结构域排列的重链(从n-末端至c-末端方向)(参见图1a和1c)。如果核心抗体包含具有不同抗原结合特异性的两个fab片段，则全长抗体包含两个fab片段，其中恰好一个fab片段包含vh和vl结构域的结构域交叉，产生vh-cl结构域排列的轻链和包含vl-ch1结构域排列的重链(从n-末端至c-末端方向)(参见图2a-d，结合臂结合抗原2)。在一个优选的实施方案中，另一个fab片段不包含结构域交叉，从而包含vl-cl结构域排列的轻链和包含vh-ch1结构域排列的重链(从n-末端至c-末端方向)。所述全长抗体的“重链或轻链的c-末端”表示所述重链或轻链的c-末端上的最后一个氨基酸。如本文所提及的术语fab片段内的“结构域交叉”意指在偏离抗体天然结构域结构的抗体结合臂(即fab片段)中，至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域取代，反之亦然。有三种一般类型的结构域交叉，(i)ch1和cl结构域的交叉，其导致vl-ch1结构的交叉轻链和包含vh-cl结构的交叉重链，(ii)vh-vl结构域的交叉，其导致vh-cl结构的交叉轻链和包含vl-ch1结构的交叉重链，和(iii)<vl-cl>多肽和<vh-ch1>多肽的交叉(“fab交叉”)，其导致vh-ch1结构的交叉轻链和包含vl-cl结构的交叉重链(所有前述的结构域排列以从n-末端至c-末端方向表示)。在本发明的术语中，就相应的重链和轻链结构域而言“彼此置换”是指前述结构域交叉的策略。因此，当ch1和cl结构域“彼此置换”时，其是指在项(i)中提及的结构域交叉以及所得到的重链和轻链结构域结构。因此，当vh和vl“彼此置换”时，其是指在项(ii)中提及的结构域交叉；当ch1和cl结构域“彼此置换”以及vh1和vl结构域“彼此置换”时，其是指在项(iii)中提及的结构域交叉。包括结构域交叉的双特异性抗体被公开在，例如wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253、wo2009/080254和schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191中。根据本发明的抗体实质上包含包括如项(ii)中提及的vh和vl结构域交叉的fab片段。根据本发明的总体构思，特异性结合相同抗原的fab片段由相同的结构域排列构建。因此，如果在根据本发明的抗体中存在多于一个的包括vh和vl结构域交叉的fab片段，则所述fab片段特异性结合相同的抗原。在根据本发明的抗体内，特异性结合与包含vh和vl结构域的结构域交叉的fab片段不同抗原的fab片段不包含所述相同的结构域交叉。包含在根据本发明的抗体中的“另外的fab片段”是指融合至所述全长抗体的重链的n-末端或c-末端的另外的fab片段，在一个实施方案中，通过肽连接子融合。根据本发明的抗体排列为使得另外的fab片段融合至特异性结合第二抗原的全长抗体的重链(在这种情况下，核心抗体包含具有相同抗原结合特异性的两个fab片段，参见图1a-d)，或另外的fab片段融合至与其所排列在其上的重链特异性结合相同抗原的重链(在这种情况下，核心抗体包含具有不同抗原结合特异性的两个fab片段，参见图2a-d)。另外的fab片段通过n-末端重链部分(vh结构域)或其轻链部分(vl结构域)融合至核心抗体重链的c-末端；或通过c-末端重链部分(ch1结构域)或其轻链部分(cl结构域)融合至核心抗体重链的n-末端。在一个实施方案中，另外的fab片段通过重链部分融合至核心抗体重链的c-或n-末端。本发明中使用的术语“肽连接子”表示具有氨基酸序列的肽，其优选是合成来源的。在根据本发明的抗体内，肽连接子用于将另外的fab片段融合至核心抗体重链的c-或n-末端。在一个实施方案中，肽连接子是具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列具有至少5个氨基酸的长度，在另一个实施方案中具有5至100个氨基酸的长度，在又一个实施方案中为10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述肽连接子是(gxs)n或(gxs)ngm其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，和x＝3，n＝3、4、5或6，m＝0、1、2或3；或x＝4，n＝2、3、4或5，m＝0、1、2或3。在一个实施方案中，x＝4和n＝2或3，在另一个实施方案中，x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接子是(g4s)2。如本文所用，术语“三级结构”是指根据本发明的抗体的几何形状。三级结构包含包含抗体结构域的多肽链骨架，而氨基酸侧链以多种方式相互作用并键结。如本文所用的术语“氨基酸”表示在位于羧基的α位置具有氨基部分的有机分子。氨基酸的实例包括：精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和脯氨酸。所用的氨基酸任选在每种情况下都是l-型。术语“带正电荷”或“带负电荷”的氨基酸是指在ph7.4时氨基酸侧链的电荷。氨基酸可根据常见的侧链性质分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链方向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。表-具有特定性质的氨基酸如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据kabat,等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中描述的kabat编号系统编号，在本文中其被称为“根据kabat等人编号”。具体而言，对于可变结构域和κ和λ同种型的轻链恒定结构域cl，使用kabat,等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的kabat编号系统(参见第647-660页)，在本文中被称为“根据kabat编号”，尽管如此，对于恒定重链结构域(ch1、铰链、ch2和ch3)使用eu索引编号系统(见第661-723页)，在本文中被称为“根据kabateu索引编号”。通过将适当的核苷酸改变引入抗体dna或通过核苷酸合成来制备多特异性抗体的多肽链内的氨基酸取代(或突变)。但是，这样的修饰只能在非常有限的范围内进行，例如，如上所述。例如，这些修饰不会改变上述抗体特征，如igg同种型和抗原结合，但可以进一步改善重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。在某些实施方案中，提供了具有一个或多个保守氨基酸取代的抗体变体。通过重组方法产生根据本发明的抗体。重组产生抗体的方法在现有技术中广为人知，包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体并通常纯化至药学上可接受的纯度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码相应(修饰的)轻链和重链的核酸插入到表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞如cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、hek293细胞、cos细胞、per.c6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收抗体。用于重组产生抗体的一般方法在现有技术中是公知的，并且描述在例如makrides,s.c.,proteinexpr.purif.17(1999)183-202；geisse,s.等人proteinexpr.purif.8(1996)271-282；kaufman,r.j.,mol.biotechnol.16(2000)151-161；werner,r.g.,drugres.48(1998)870-880的综述文章中。本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过dna或rna聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以包含合成后制备的修饰，如缀合至标记。其他类型的修饰包括例如“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，如，例如具有不带电荷的键(linkage)(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的那些修饰、含有悬垂(pendant)部分(如，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-l-赖氨酸等))的那些修饰、含有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的那些修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰、含有烷化剂的那些修饰、含有修饰的键(例如α异头核酸等)的那些修饰、以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团置换、被标准保护基团保护、或被活化以制备另外的到其他核苷酸的键、或者可以被缀合到固体或半固体支持物。5'和3'末端oh可被磷酸化或被1至20个碳原子的胺或有机加帽基团取代。其他羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖的类似物形式，包括例如2'-o-甲基-、2'-o-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团置换。这些替代的连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸盐被p(o)s(“硫代酸酯”)、p(s)s(“二硫代酸酯”)、(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch2(“formacetal”)置换，其中每个r或r'独立地为h或取代或未取代的烷基(1-20c)，任选地含有醚(-o-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。不是多核苷酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文涉及的所有多核苷酸，包括rna和dna。“分离的”核酸是指已从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合到已引入其的宿主细胞基因组中的载体。该术语包括功能主要为将dna或rna插入细胞中(例如染色体整合)的载体、功能主要为复制dna或rna的载体复制、以及功能为转录和/或翻译dna或rna的表达载体。还包括提供多于一种所描述功能的载体。“表达载体”是能够指导其可操作地连接的核酸表达的载体。当表达载体被引入合适的宿主细胞时，它可以被转录并翻译成多肽。当在根据本发明的方法中转化宿主细胞时，使用“表达载体”；因此如本文所述与宿主细胞转化有关的术语“载体”意指“表达载体”。“表达系统”通常是指包含表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体功能为生产所需的表达产物。如本文所用，“表达”是指将核酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna(也称为转录本)随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录本和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组dna，则在真核细胞中的表达可包括mrna的剪接。如本文所用的术语“转化”是指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果使用没有强大细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则通过如graham和vandereh,virology52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀方法进行转染。然而，也可以使用其他方法将dna引入细胞，如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有大量细胞壁构造的细胞，则一种转染方法是例如使用氯化钙的钙处理，如cohen,f.n,等人pnas69(1972)7110etseq所述。如在本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被工程化以产生根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。然而，该术语不包括人中的人细胞。如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的指定包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应该理解的是，由于有意或无意的突变，所有子代在dna含量上可能不完全相同。包括与针对最初转化的细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的变体子代。从上下文可以清楚地看出意图明确指定的地方。在例如barnes,l.m.等人cytotechnology32(2000)109-123；barnes,l.m.等人biotech.bioeng.73(2001)261-270中描述了ns0细胞中的表达。在例如durocher,y.等人nucl.acids.res.30(2002)e9中描述了瞬时表达。orlandi,r.等人proc.natl.acad.sci.usa86(1989)3833-3837；carter,p.等人proc.natl.acad.sci.usa89(1992)4285-4289；和norderhaug,l.等人j.immunol.methods204(1997)77-87描述了可变结构域的克隆。schlaeger,e.-j.和christensen,k.在cytotechnology30(1999)71-83中和schlaeger,e.-j.,j.immunol.methods194(1996)191-199中描述了优选的瞬时表达系统(hek293)。可以对宿主细胞产生的抗体进行从重链c-末端的一个或多个、特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者其可以包括全长重链的切割变体(本文中也称为切割的变体重链)。在重链的最后两个c-末端氨基酸是甘氨酸(g446)和赖氨酸(k447，根据kabateu索引编号)的情况时可能是这样。因此，如果未另外指明，包括具有游离c-末端的ch3结构域的重链氨基酸序列在本文中表示不含c-末端甘氨酸-赖氨酸二肽。相反，包含融合至其c-末端的另外的fab片段的重链氨基酸序列在本文中表示包括c-末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施方案中，包含重链(所述重链包括具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域)的抗体包含另外的c-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据kabateu索引编号)。在本发明的一个实施方案中，包含重链(所述重链包括具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域)的抗体包含另外的c-末端甘氨酸残基(g446，根据kabateu索引编号)。本发明的组合物，如本文所述的药物组合物，包含本发明的抗体群。抗体群可以包含具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体。在一个实施方案中，抗体群由具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体具有切割的变体重链。在本发明的一个实施方案中，包含本发明抗体群的组合物包含抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域和另外的c-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据kabateu索引编号)。在本发明的一个实施方案中，包含本发明抗体群的组合物包含抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域和另外的c-末端甘氨酸残基(g446，根据kabateu索引编号)。在本发明的一个实施方案中，此类组合物包含由以下抗体组成的抗体群：包含重链(所述重链包括如本文所述的ch3结构域)的抗体；包含重链(所述重链包括具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域和另外的c-末端甘氨酸残基(g446，根据kabateu索引编号))的抗体；和包含重链(所述重链包括具有如本文所述的游离c-末端的ch3结构域和另外的c-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据kabateu索引编号)的抗体。通过标准技术(包括碱/sds处理、cscl显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术)进行抗体纯化(从宿主细胞培养物中回收抗体)以消除细胞组分或其他污染物，例如，其他细胞核酸或蛋白质。参见ausubel,f.等人编辑currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork(1987)。很好地建立了不同的方法并被广泛用于蛋白质纯化，如使用微生物蛋白质的亲和色谱法(例如蛋白a或蛋白g亲和色谱法)、离子交换色谱法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附法(例如用β-巯基乙醇和其他sh配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和色谱法(例如用ni(ii)-和cu(ii)-亲和材料)、尺寸排阻色谱和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(vijayalakshmi,m.a.,appl.biochem.biotech.75(1998)93-102)。术语“药物组合物”是指一种制剂，其为允许其中所含活性成分的生物学活性有效的形式，并且其不含对施用该组合物的受试者是不可接受的毒性的其他组分。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据所需结果而变化。为了通过某些施用途径施用根据本发明的抗体，可能需要用防止抗体失活的物质包被抗体或与防止抗体失活的物质共同施用抗体。例如，抗体可以在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中施用给受试者。药学上可接受的稀释剂包括生理盐水和水性缓冲溶液。“药学上可接受的载体”是指除了活性成分之外的药物组合物中的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个优选的实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据本发明的药物组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上文的灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可通过包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长的吸收。如本文所用，“治疗”(及其语法变体，如“治疗”或“治疗”)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，并且可预防进行或在临床病理学的病程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速度、改进或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。如本文所用，短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。无论选择何种施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现对特定患者、组合物和施用模式所需的治疗反应而对患者无毒性的活性成分的量。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。组合物必须是无菌的并且流体达到组合物可以通过注射器递送的程度。除了水以外，在一个实施方案中，载体是等渗缓冲生理盐溶液。例如，通过使用如卵磷脂的包衣、通过维持在分散情况下的所需粒度和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇或山梨醇和氯化钠。术语“包装插页”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸分解酶；抗生素；毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。如本文所用，术语“癌症”指增殖性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺癌(nscl)、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、许旺氏细胞瘤(schwanomas)、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括上述癌症的任何难治性版本，或一种或多种上述癌症的组合。如本文所用，“人vegf”是指人血管内皮生长因子(vegf/vegf-a)，其描述于例如leung,d.w.等人science246(1989)1306-9；keck,p.j.等人science246(1989)1309-12和connolly,d.t.等人j.biol.chem.264(1989)20017-24。vegf参与调节与肿瘤和眼内疾病相关的正常和异常血管生成和新血管形成(ferrara,n.等人endocr.rev.18(1997)4-25；berkman,r.a.等人j.clin.invest.91(1993)153-159；brown,l.f.等人humanpathol.26(1995)86-91；brown,l.f.等人cancerres.53(1993)4727-4735；mattern,j.等人brit.j.cancer.73(1996)931-934；和dvorak,h.等人am.j.pathol.146(1995)1029-1039)。vegf是从几种来源分离的同二聚体糖蛋白。vegf对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。如本文中使用的人“ang-2”是指人血管生成素-2(ang-2)(或者缩写为angpt2或ang2)，其描述于maisonpierre,p.c.等人science277(1997)55-60和cheung,a.h.等人genomics48(1998)389-91中。血管生成素-1和血管生成素-2作为ties(选择性表达在血管内皮中的酪氨酸激酶家族)的配体被发现(yancopoulos,g.d.等人nature407(2000)242-48)。现在有4个明确的血管生成素家族成员。血管生成素-3和-4(ang-3和ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座的广泛分歧的对应物(kim,i.等人febslet,443(1999)353-56；kim,i.等人jbiolchem274(1999)26523-28)。术语“pd1”也称为程序性细胞死亡蛋白1，是1992年首次描述的288个氨基酸的i型膜蛋白(ishida等人，emboj.，11(1992)，3887-3895)。pd-1是t细胞调节剂的扩展的cd28/ctla-4家族的成员，具有两种配体：pd-l1(b7-h1，cd274)和pd-l2(b7-dc，cd273)。该蛋白质的结构包括细胞外igv结构域，然后是跨膜区和细胞内尾部。细胞内尾部含有位于基于酪氨酸的免疫受体抑制基序和基于酪氨酸的免疫受体转换基序的两个磷酸化位点，这表明pd-1负调节tcr信号。这与配体结合后shp-1和shp-2磷酸酶与pd-1的胞质尾部结合一致。尽管pd-1在幼稚t细胞上不表达，但其在t细胞受体(tcr)介导的活化后上调，并且在活化和耗损的t细胞上都观察到(agata等人,int.immunology8(1996),765-772)。这些耗损的t细胞具有功能失调的表型，不能适当地作出反应。尽管pd-1具有相对较宽的表达模式，但其最重要的作用可能是作为t细胞上的共抑制受体(chinai等人,trendsinpharmacologicalsciences36(2015),587-595)。因此目前的治疗方法集中于阻断pd-1与其配体的相互作用以增强t细胞应答。术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白pd-1”、“pd-1”、“pd1”、“pdcd1”、“hpd-1”和“hpd-1”可以互换使用并且包括人pd-1的变体、同种型、物种同系物、以及与pd-1具有至少一个共同表位的类似物。人pd1的氨基酸序列显示于uniprot(www.uniprot.org)，登录号q15116。术语“tim3”是“t细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的分子3”的缩写，也称为havcr2、kim-3、timd3和flj14428，是指t辅助细胞1型特异性细胞表面蛋白，其调节巨噬细胞活化和炎症状态的严重性。tim3也与癌症相关，特别是与癌症干细胞相关。对于许多物种的tim3的核苷酸和蛋白质序列是已知的。例如，人氨基酸序列可以在uniprot登录号q8tdq0中找到。人蛋白质的特征在于包含ig样结构域和粘蛋白结构域的细胞外结构域(还包含o-连接和n-连接的糖基化位点)，其包含约氨基酸22-202、跨膜结构域(氨基酸203-223)和细胞内(胞质)结构域(氨基酸224-301)。对于人tim3蛋白，细胞外结构域包含约氨基酸22-202，跨膜结构域包含约氨基酸203-223，胞质结构域包含约氨基酸224-301。术语“tim-3”包括人tim-3的变体、同种型、物种同系物、和与tim-3具有至少一个共同表位的类似物。除非另有说明，否则本文使用的术语“死亡受体5(dr5)”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然dr5，包括哺乳动物如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的dr5以及由细胞中加工产生的任何形式的dr5。该术语还包括dr5的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。除非另有说明，否则本文使用的术语“成纤维细胞活化蛋白(fap)”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然fap20，包括哺乳动物如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的fap以及由细胞中加工产生的任何形式的fap。该术语还包括天然存在的fap变体，例如剪接变体或等位基因变体。优选地，本发明的抗fap抗体结合fap的细胞外结构域。2.本发明实施方案的详细描述i.多特异性抗体在wo2009/080252和schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191(通过引用并入本文)中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(crossmabvh-vl)。它们明显地减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配产生的副产物(与没有这种结构域交换的方法比较)。然而，其制剂并不是完全没有副产物。主要的副产物基于bence-jones型的相互作用(也参见schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191；在增补中的图s1i中)。wo2015/101588a1涉及用作血脑屏障穿梭组件的抗体，并且提及了在ch1/cl界面内包括突变的结合臂之一中具有vh/vl结构域交叉的二价双特异性抗体。本文公开了用于进一步改善vh/vl结构域交叉的双特异性抗体的方法，例如，通过在ch1和cl结构域的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷氨基酸取代，通过进一步降低副产物以及通过降低聚集行为以改善此类多特异性抗体的产率。因此，本发明涉及在一种结合特异性的fab片段内具有vh/vl结构域交叉的四价多特异性抗体。在抗体内，具有相同特异性的一组fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：(i)cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和(ii)ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)，而具有不同结合特异性的其他fab片段不包含所述氨基酸取代。其他fa片段的cl结构域中特定氨基酸的另外的取代可能也是有益的。第一方面，本发明涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，以及b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中，仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的一个或者两个fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-在cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-在ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。图1a-d中描绘了根据该第一方面的多特异性抗体的示意图。根据这个方面，核心抗体是包含结合相同抗原(例如第一抗原)的两个fab片段的全长抗体。在该方面的一个实施方案中，核心抗体是单特异性抗体。在该方面的一个实施方案中，核心抗体的fab片段不包含vh和vl结构域的结构域交叉。第二方面，本发明涉及四价多特异性抗体，其包含：a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与排列在所述重链上的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-在cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-在ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。图2a-d中描绘了根据该第二方面的多特异性抗体的示意图。根据这个方面，核心抗体是包含结合不同抗原的两个fab片段(例如特异性结合第一抗原的第一fab片段和特异性结合第二抗原的第二fab片段)的全长抗体。如图2a-d所示，在所述第二方面的多特异性抗体内，包括一个另外的fab片段的一条重链携带两个具有相同抗原结合特异性的fab片段(即，一个fab片段是核心抗体的fab片段，另一个fab片段是融合至重链的另外的fab片段)。在该第二方面的一个实施方案中，核心抗体是双特异性抗体。因此，本发明基于多特异性抗体的一般抗体结构域排列，其中通过将两个另外的fab片段融合至核心抗体形成四价多特异性抗体。核心抗体是全长抗体，其可以包含具有相同抗原结合特异性的两个fab片段(第一方面，参见图1a-d)或可以包含具有不同抗原结合特异性的两个fab片段(第二方面，图2a-d)。根据上述两个方面的多特异性抗体同样适用于与下面列出的其他实施方案组合。vh和vl结构域的结构域交叉存在于特异性结合相同(例如第一)抗原的fab片段中。因此，根据现有技术中已知的crossmab技术，所述fab片段的轻链结构域排列不同于特异性结合另一个(不同的，例如第二)抗原的fab片段的结构域排列。根据本发明的概念，根据本发明的抗体在具有vh/vl结构域置换/交换的fab片段中不包括另外的ch1/cl结构域交换，即结构域交换的fab由两个多肽组成，一个包含vh和cl结构域，另一个包含vl和ch1结构域。此外，特异性结合相同抗原的一组fab片段(即不依赖结构域交叉，例如如前例举的结合“第一”或“第二”抗原的fab片段，但不是包括相同取代的两组fab片段)包括ch1/cl界面内的氨基酸取代，由此在不同的重链和轻链对中引入相反电荷的氨基酸，其支持正确的重链和轻链对的二聚化。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，不包含vh/vl结构域交叉的fab片段在ch1/cl界面中包含ii)中的氨基酸取代。在一对fab片段的ch1/cl界面中的氨基酸取代在根据本发明抗体的一个实施方案中，不包含i)中的结构域交叉的fab片段包含ii)中的氨基酸取代。因此，在一个实施方案中，本发明的第一方面涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，该全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，以及b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中，仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中不包含i)中的结构域交叉的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。因此，在一个实施方案中，本发明的第二方面涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，以及b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与排列在所述重链上的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中不包含i)中的结构域交叉的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代(所有编号均根据kabateu索引)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k或r取代(根据kabat编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代(所有编号根据kabat)。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代。在抗体cl结构域内的这种突变可以另外提供抗体分子有利的安全特征(与相应的ch1结构域在位置147和213中的带负电荷氨基酸(即e或d)的突变组合，和任选地，与例如本文公开的抗体的另一cl结构域中的任何另外的氨基酸取代组合)。与本文所述的其他突变相比，所述cl结构域的氨基酸序列分析揭示了更少的t细胞表位。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k或r取代(根据kabat编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代。在根据本发明抗体的一个优选实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代。第二对fab片段的ch1/cl界面中另外的氨基酸取代在根据本发明抗体的一个实施方案中，不包含如ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代-位置124的氨基酸被e或d取代。因此，在根据本发明抗体的一个实施方案中ⅱ)-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)，和iii)不包含如ii)中定义的氨基酸取代的一个或两个fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。在一个优选的实施方案中，不包含i)中的vh/vl结构域交叉的fab片段包含ii)中的氨基酸取代，并且包含i)中的vh/vl结构域交叉的fab片段包含iii)中的氨基酸取代。因此，在一个实施方案中，本发明的第一方面涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，和b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中不包含i)中的结构域交叉的fab片段，在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和iii)其中包含i)中的结构域交叉的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。因此，在一个实施方案中，本发明的第二方面涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个(在一个实施方案中恰好一个)核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个(在一个实施方案中恰好两个)另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与排列在所述重链上的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换(在一个实施方案中仅可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换)，和ii)其中不包含i)中的结构域交叉的fab片段，在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和iii)其中包含i)中的结构域交叉的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)，和iii)不包含ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：位置124的氨基酸被e或d取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)，和iii)不包含如ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：位置124的氨基酸被e或d取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)；和iii)不包含如ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)；和iv)不包含如ii)中定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被k取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被r取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被e取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被e取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，在不包含i)中的结构域交叉的fab片段中，在ch1结构域中，位置147的氨基酸被d取代，位置213的氨基酸被d取代，在cl结构域中，位置123的氨基酸被r取代，位置124的氨基酸被k取代；在包含i)中的结构域交叉的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e取代。在根据本发明抗体的一个实施方案中，包含ii)中的氨基酸取代的fab片段包含κ同种型的轻链恒定结构域cl。在根据本发明抗体的一个实施方案中，包含ii)中的氨基酸取代的fab片段包含λ同种型的轻链恒定结构域cl。在根据本发明抗体的一个实施方案中，另外的fab片段融合至核心抗体重链的c-末端。在根据本发明抗体的一个实施方案中，另外的fab片段融合至核心抗体重链的n-末端。fc区的异二聚化在本发明的一个实施方案中，根据本发明的抗体包含两个恒定重链结构域3(ch3)，其根据现有技术中已知的不同方法被改变以促进异二聚化(例如通过在ch3/ch3界面内的杵臼修饰和/或引入另外的半胱氨酸键桥)。在根据本发明抗体的一个方面，多特异性抗体包含两个恒定重链结构域3(ch3)，其通过以下改变以促进异二聚化：通过至少一个原始氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在一个ch3结构域中产生突起，并且通过至少一个原始氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在另一个ch3结构域中产生空腔，使得在一个ch3结构域中产生的突起可定位在另一个ch3结构域中产生的空腔内(对应于杵臼技术的一般方法)。在该方面的一个优选实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自r、f、y和w。在该方面的一个优选实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自a、s、t和v。在该方面的一个优选实施方案中，一个ch3结构域包含t366w突变，另一个ch3结构域包含t366s、l368a和407v突变(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个方面，多特异性抗体包含两个ch3结构域，其通过以下改变以促进异二聚化：在一个ch3结构域中至少一个原始氨基酸残基被带正电荷的氨基酸取代，并且在另一个ch3结构域中至少一个原始氨基酸残基被带负电荷的氨基酸取代。在该方面的一个优选实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自k、r和h。在该方面的一个优选实施方案中，所述带负电荷的氨基酸选自e或d。在该方面的一个优选实施方案中，一个ch3结构域包含r409d和k370e突变，另一个ch3结构域包含d399k和e357k突变(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个方面，多特异性抗体包含两个ch3结构域，其通过以下改变以促进异二聚化:在每个ch3结构域中引入至少一个半胱氨酸残基使得在ch3结构域之间形成二硫键。在该方面的一个优选实施方案中，一个ch3结构域包含e356c或s354c突变，另一个ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。在该方面的一个优选实施方案中，一个ch3结构域包含s354c突变，另一个ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，多特异性抗体包含两个ch3结构域，其被改变以促进异二聚化，其中一个ch3结构域包含t366w突变，另一个ch3结构域包含t366s、l368a和407v突变(根据kabateu索引编号)；并且其中任何一个上述ch3结构域包含e356c或s354c突变，而另一个上述ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。在根据本发明抗体的一个实施方案中，多特异性抗体包含两个ch3结构域，其被改变以促进异二聚化，其中一个ch3结构域包含t366w突变，另一个ch3结构域包含t366s、l368a和407v突变(根据kabateu索引编号)；并且其中任何一个上述ch3结构域包含s354c突变，而另一个上述ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。肽连接子在根据本发明抗体的一个实施方案中，一个或两个b)中的另外的fab片段通过肽连接子融合至核心抗体的重链。在根据本发明抗体的一个实施方案中，肽连接子具有至少5个氨基酸的长度。在根据本发明抗体的一个实施方案中，肽连接子具有5-100个氨基酸的长度。在根据本发明抗体的一个实施方案中，肽连接子具有10-50个氨基酸的长度。在根据本发明抗体的一个实施方案中，肽连接子是甘氨酸-丝氨酸接头。在根据本发明抗体的一个实施方案中，肽连接子是(gxs)n或(gxs)ngm其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，和x＝3，n＝3、4、5或6，m＝0、1、2或3；或者x＝4，n＝2、3、4或5，m＝0、1、2或3。在一个实施方案中，x＝4以及n＝2或3，在另一个实施方案中x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接子是(g4s)2。抗体同种型在一个实施方案中，根据本发明的抗体的核心抗体是全长igg抗体。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的恒定结构域是人igg1或igg4亚类。在一个实施方案中，ch3结构域源自人igg1抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体不含ch4结构域。抗体变体在根据本发明抗体的一个实施方案中，-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉使得vh结构域和vl结构域彼此置换，其中不包含所述结构域交叉的另一个fab片段包含包括cl和vl结构域的轻链和包括ch1和vh结构域的重链。在根据本发明抗体的一个实施方案中，b)中的另外的fab片段融合至核心抗体重链的c-末端。在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体是分离的抗体。在根据本发明抗体的一个实施方案中，抗体是双特异性、三特异性或四特异性的。在根据本发明抗体的一个实施方案中，抗体是双特异性的。在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或取代残基。可制备任何缺失、插入和取代的组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所需的特征。a)糖基化变体在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体的糖基化程度。可以通过改变氨基酸序列而方便地完成向抗体添加或缺失糖基化位点，从而产生或去除一个或多个糖基化位点。当抗体包含fc区时，与其连接的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过n键连接至fc区ch2结构域的asn297。参见例如wright,a.和morrison,s.l.,tibtech15(1997)26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、n-乙酰葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及与双触角寡糖结构“茎”中的glcnac连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善性质的抗体变体。在一个实施方案中，提供具有碳水化合物结构(其缺乏(直接或间接)连接于fc区的岩藻糖)的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算相对于与asn297连接的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的asn297上糖链内岩藻糖的平均量，确定岩藻糖的量，如通过maldi-tof质谱法测量，如，例如wo2008/077546中所述。asn297是指位于fc区约位置297(fc区残基的eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中较小的序列变异，asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能。参见例如us2003/0157108；us2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的实例包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki,a.等人,j.mol.biol.336(2004)1239-1249；yamane-ohnuki,n.等人,biotech.bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖化缺陷的lec13cho细胞(ripka,j.等人,arch.biochem.biophys.249(1986)533-545；us2003/0157108；和wo2004/056312,特别是在实施例11中)和敲除细胞系如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除cho细胞(参见例如yamane-ohnuki,n.等人,biotech.bioeng.87(2004)614-622；kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.94(2006)680-688；和wo2003/085107)。进一步提供具有等分寡糖的抗体变体，例如其中与抗体fc区连接的双触角寡糖被glcnac等分。这样的抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。这样的抗体变体的实例描述于例如wo2003/011878；美国专利号6,602,684和us2005/0123546。还提供了在与fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可具有改善的cdc功能。例如在wo1997/30087；wo1998/58964和wo1999/22764中描述了这样的抗体变体。b)fc区变体在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体fc区，从而产生fc区变体。fc区变体可包含人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)，所述人fc区序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)。在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应功能的抗体变体，这使其成为在抗体体内半衰期是重要的但某些效应功能(如补体和adcc)是不必要的或有害的应用中的理想候选。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实cdc和/或adcc活性的减少/消耗。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定法以确保抗体缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)、但保留了fcrn结合能力。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fc(riii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结在ravetch,j.v.andkinet,j.p.,annu.rev.immunol.9(1991)457-492第464页的表3中。用于评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如hellstrom,i.等人,proc.natl.acad.sci.usa83(1986)7059-7063；和hellstrom,i.等人,proc.natl.acad.sci.usa82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166(1987)1351-1361)。或者，可以使用非放射性测定法(参见例如用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.mountainview,ca；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega，madison，wi)。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。或者或另外，可在体内评估感兴趣分子的adcc活性，例如在动物模型中如在clynes,r.等人,proc.natl.acad.sci.usa95(1998)652-656中公开的动物模型中。也可以进行c1q结合测定法以证实抗体不能结合c1q并因此缺乏cdc活性。参见，例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定法(参见例如gazzano-santoro,h.等人,j.immunol.methods202(1996)163-171；cragg,m.s.等人,blood101(2003)1045-1052；和cragg,m.s.andm.j.glennie,blood103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行fcrn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如petkova,s.b.等人,int.immunol.18(2006:1759-1769)。具有降低的效应功能的抗体包括具有一个或多个fc区残基238、265、269、270、297、327和329取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置上具有取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其中残基265和297被丙氨酸取代(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与fcr结合的某些抗体变体。(参见，例如美国专利号6,737,056；wo2004/056312和shields,r.l.等人,j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，其改善adcc，例如在fc区的位置298、333和/或334的取代(残基的eu编号)。在一些实施方案中，在fc区中进行改变，导致c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)改变(即改善或降低)，例如如美国专利号6,194,551、wo99/51642和idusogie,e.e.等人,j.immunol.164(2000)4178-4184中所述。具有增加的半衰期和改善的与新生儿fc受体(fcrn)结合的抗体描述于us2005/0014934中，所述新生儿fc受体(fcrn)负责将母体igg转移至胎儿(guyer,r.l.等人,j.immunol.117(1976)587-593,和kim,j.k.等人,j.immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区，改善fc区与fcrn的结合。这样的fc变体包括在以下一个或多个fc区残基具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于fc区变体的其他实例还参见duncan,a.r.和winter,g.,nature322(1988)738-740；us5,648,260；us5,624,821和wo94/29351。c)抗体衍生物在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或不分支的。连接抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一个聚合物，其可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑来确定，包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定病症的治疗中等。在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(kam,n.w.等人,proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，包括但不限于不伤害正常细胞的波长，但该波长将非蛋白质部分加热至一定温度，在该温度下抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死。免疫缀合物在本发明的一个实施方案中，提供了包含根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物。在一个实施方案中，此类免疫缀合物包含与细胞毒性剂偶联的多特异性抗体。ii.重组方法可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码根据本发明的多特异性抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体的vl的氨基酸序列和/或包含vh(例如抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在另一个实施方案中，提供了包含此类载体(例如此类表达载体)的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已转化有)：包含核酸的第一载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的轻链的氨基酸序列；包含核酸的第二载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的重链的氨基酸序列，其中另外的fab片段与其融合，任选地包含核酸的第三载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的重链的氨基酸序列，其中没有另外的fab片段与其融合(在多特异性抗体是三价抗体的情况下)，包含核酸的第四载体，所述核酸编码一个或两个另外的fab片段的轻链的氨基酸序列。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已转化有)：包含核酸的第一载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的第一轻链的氨基酸序列，包含核酸的第二载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的第二轻链的氨基酸序列，包含核酸的第三载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的第一重链的氨基酸序列，和包含核酸的第四载体，所述核酸编码多特异性抗体的核心抗体的第一轻链的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如y0、ns0、sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了产生根据本发明的多特异性抗体的方法，其中所述方法包括培养这样的宿主细胞以产生抗体。在一个实施方案中，提供了制备根据本发明的多特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达所述抗体的条件下培养包含编码如上所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。为了重组产生根据本发明的抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并将其插入到一个或多个载体中进一步用于在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规步骤(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如us5,648,237、us5,789,199和us5,840,523(还参见charlton,k.a.,methodsinmolecularbiology,vol.248,lo,b.k.c.(编辑),humanapress,totowa,nj(2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可以可溶性级分从细菌细胞糊中分离并且可以进一步纯化。除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化通路已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见gerngross,t.u.,nat.biotech.22(2004)1409-1414；和li,h.等人,nat.biotech.24(2006)210-215。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(例如，在graham,f.l.等人,j.genvirol.36(1977)59-74中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(例如在mather,j.p.,biol.reprod.23(1980)243-252中描述的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；布法罗大鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；tri细胞，例如在mather,j.p.等人,annalsn.y.acad.sci.383(1982)44-68中所述；mrc5细胞和fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub,g.等人,proc.natl.acad.sci.usa77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如y0、ns0和sp2/0。关于适合抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如yazaki,p.andwu,a.m.,methodsinmolecularbiology,vol.248,lo,b.k.c.(编辑),humanapress,totowa,nj(2004)，第255-268页。本发明的抗体表现出改善的副产物谱和/或提高的聚集温度。本发明的另一个方面是用于减少制备过程中的副产物形成和/或提高多特异性抗体的聚集温度的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：-用包含编码四价多特异性抗体的重链和轻链的核酸的载体转化宿主细胞，所述四价多特异性抗体包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中为了减少多特异性抗体副产物的形成-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)，-在允许合成所述多特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞；和-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤-用包含编码四价多特异性抗体的重链和轻链的核酸的载体转化宿主细胞，所述四价多特异性抗体包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与在所述重链上排列的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中为了减少多特异性抗体副产物的形成-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)；-在允许合成所述多特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞；和-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。在一个优选的实施方案中，用于减少制备期间副产物的形成和/或用于提高根据本发明的多特异性抗体的聚集温度的方法包括用包含编码本文所公开的本发明的四价多特异性抗体的重链和轻链的核酸的载体转化宿主细胞。iii.药物组合物在一个实施方案中，提供了包含根据本发明的多特异性抗体的组合物。在一个实施方案中，提供了包含根据本发明的多特异性抗体的药物或诊断组合物。在一个实施方案中，提供了包含根据本发明的多特异性抗体与至少一种药学上可接受的载体组合的药物组合物。通过将具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合以冻干组合物或水溶液的形式制备根据本发明的抗体的药物组合物(remington'spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a.(编辑)(1980))。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(peg)。本文中示例性的药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuph20(baxterinternational,inc.)。美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20。在一个方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。示例性的冻干抗体组合物描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体组合物包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后者组合物包含组氨酸乙酸盐缓冲剂。本文的组合物还可以包含对于正在治疗的特定适应症所需的多于一种的活性成分，优选具有互补活性但不会相互不利地影响的那些活性成分。这样的活性成分适合以对预期目的有效的量组合存在。活性成分可以截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液(macroemulsions)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于remington'spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.(编辑)(1980)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品形式，例如，薄膜或微胶囊。用于体内施用的组合物通常是无菌的。无菌性可以容易地完成，例如通过无菌滤膜过滤。iv.治疗方法和组合物本文提供的任何多特异性抗体可用于治疗方法中。在一个方面，提供了根据本发明的多特异性抗体用作药物。在进一步的方面中，提供了根据本发明的多特异性抗体用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供了根据本发明的多特异性抗体用于治疗方法中。在某些实施方案中，本发明提供了根据本发明的多特异性抗体用于治疗患有癌症的个体的方法中，其包括向个体施用有效量的根据本发明的多特异性抗体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”优选是人。另一方面，本发明提供了根据本发明的多特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在另一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法中，该方法包括向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。另一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有癌症的个体施用有效量的根据本发明的多特异性抗体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。另一方面，本发明提供了包含本文提供的根据本发明的任何多特异性抗体的药物组合物，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的根据本发明的任何多特异性抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的根据本发明的任何多特异性抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。本发明的抗体可以单独使用或与其他试剂组合用于治疗。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。上述组合疗法包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或分开的组合物中)和分开施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后。本发明的抗体也可以与放射疗法组合使用。本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。本文考虑各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括被治疗的具体疾患、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、试剂递送部位、施用方法、施用时间表以及医师已知的其他因素。不是必须而是可选地，抗体与一种或多种目前用于预防或治疗讨论中的疾患的试剂配制。这样的其他试剂的有效量取决于组合物中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。其通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或本文所述剂量的约1％至99％，或以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。为了预防或治疗疾病，本发明抗体(当单独使用或与一种或多种另外的治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是否用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。抗体一次或经过一系列治疗适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，例如，通过一次或多次分开施用、或通过连续输注。根据上述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，通常根据病症持续治疗直至疾病症状发生所需的抑制。抗体的一个示例性剂量在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)中的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如，使患者接受约二至约二十，或例如约六次剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一次或多次较低剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定法进行监测。应当理解，任何上述组合物或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物代替本发明的多特异性抗体或除本发明的多特异性抗体之外使用本发明的免疫缀合物进行。v.制品在本发明的另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质的制品。该制品包含容器和在容器上或与容器关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以由各种材料(如玻璃或塑料)制成。该容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病症，并且容器可以具有无菌入口(例如该容器可以是静脉内溶液袋或具有由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文报道的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒素或其他治疗剂。本发明该实施方案中的制品可以进一步包含指示组合物可用于治疗具体病症的包装插页。或者或另外，制品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户观点来看所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。可以理解的是，代替或除根据本发明的多特异性抗体之外，上述任何制品可以包括本发明的免疫缀合物。3.本发明的具体实施方案列出了本发明的以下具体实施方案。1.一种四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。2.一种四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与在所述重链上排列的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。3.根据实施方案1所述的抗体，其中核心抗体是单特异性抗体。4.根据实施方案1或2所述的抗体，其中核心抗体是双特异性抗体。5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗体，其中不包含i)中的结构域交叉的fab片段包含ii)中的氨基酸取代。6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)。7.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。8.根据实施方案1至7中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)；和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)。9.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体，其中不包含ii)中所定义的氨基酸取代的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代-位置124的氨基酸被e或d取代。10.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体，其中包含ii)中的氨基酸取代的fab片段包含κ同种型的轻链恒定结构域cl。11.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体，其中包含ii)中的氨基酸取代的fab片段包含λ同种型的轻链恒定结构域cl。12.根据实施方案1至10中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，-cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)；和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；和其中包含ii)中的氨基酸取代的一个或两个fab片段包含κ同种型的轻链恒定结构域cl。13.根据实施方案1至12中任一项所述的抗体，其中b)中另外的fab片段融合至核心抗体重链的c-末端。14.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体，其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得vh结构域和vl结构域彼此置换，其中不包含所述结构域交叉的其他fab片段包含包括cl和vl结构域的轻链和包括ch1和vh结构域的重链。15.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性、三特异性或四特异性的。16.根据实施方案1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性的。17.根据实施方案1至16中任一项所述的抗体，其中b)中另外的fab片段通过肽连接子与核心抗体的重链融合。18.根据实施方案17所述的抗体，其中所述肽连接子具有至少5个氨基酸的长度。19.根据实施方案17或18所述的抗体，其中所述肽连接子是由甘氨酸和丝氨酸残基连续排列组成的肽。20.根据实施方案1至19中任一项所述的抗体，其中所述多特异性抗体包含两个恒定重链结构域3(ch3)，其通过以下改变以促进异二聚化：至少一个原始氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在一个ch3结构域中产生突起，并且至少一个原始氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在另一个ch3结构域中产生空腔，使得在一个ch3结构域中产生的突起可定位在另一个ch3结构域中产生的空腔内。21.根据实施方案20所述的抗体，其中所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自r、f、y和w。22.根据实施方案20或21所述的抗体，其中所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自a、s、t和v。23.根据实施方案20至22中任一项所述的抗体，其中所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自r、f、y和w；并且所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自a、s、t和v。24.根据实施方案20至23中任一项所述的抗体，其中一个ch3结构域包含t366w突变，并且另一个ch3结构域包含t366s、l368a和407v突变(根据kabateu索引编号)。25.根据实施方案1至19中任一项所述的抗体，其中所述多特异性抗体包含两个ch3结构域，其通过以下改变以促进异二聚化：在一个ch3结构域中至少一个原始氨基酸残基被带正电荷的氨基酸取代，并且在另一个ch3结构域中至少一个原始氨基酸残基被带负电荷的氨基酸取代。26.根据实施方案25所述的抗体，其中所述带正电荷的氨基酸选自k、r和h。27.根据实施方案25或26所述的抗体，其中所述带负电荷的氨基酸选自e或d。28.根据实施方案25至27中任一项所述的抗体，其中所述带正电荷的氨基酸选自k、r和h；并且所述带负电荷的氨基酸选自e或d。29.根据实施方案25至27中任一项所述的抗体，其中一个ch3结构域包含r409d和k370e突变，并且另一个ch3结构域包含d399k和e357k突变(根据kabateu索引编号)。30.根据实施方案1至29中任一项所述的抗体，其中所述多特异性抗体包含两个ch3结构域，其通过以下改变以促进异二聚化:在每个ch3结构域中引入至少一个半胱氨酸残基使得在ch3结构域之间形成二硫键。31.根据实施方案30所述的抗体，其中一个ch3结构域包含e356c或s354c突变，并且另一个ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。32.根据实施方案30或31所述的抗体，其中一个ch3结构域包含s354c突变，并且另一个ch3结构域包含y349c突变(根据kabateu索引编号)。33.一种分离的核酸，其编码根据实施方案1至32中任一项所述的抗体。34.一种表达载体，其包含根据实施方案33所述的核酸。35.一种宿主细胞，其包含根据实施方案33所述的核酸。36.一种宿主细胞，其包含根据实施方案34所述的表达载体。37.一种组合物，其包含根据实施方案1至32中任一项所述的抗体。38.一种药物或诊断组合物，其包含根据实施方案1至32中任一项所述的抗体。39.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至32中任一项所述的抗体与至少一种药学上可接受的载体的组合。40.一种免疫缀合物，其包含根据实施方案1至32中任一项所述的抗体。41.根据实施方案40所述的免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂偶联的抗体。42.根据实施方案1至32中任一项所述的抗体用作药物。43.根据实施方案1至32中任一项所述的抗体用于治疗癌症。44.根据实施方案40或41所述的免疫缀合物用作药物。45.根据实施方案40或41所述的免疫缀合物用于治疗癌症。46.一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者施用根据实施方案1至32中任一项所述的多特异性抗体。47.根据实施方案46所述的方法，其中所述疾病是癌症。48.一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者施用根据实施方案40或41所述的免疫缀合物。49.根据实施方案48所述的方法，其中所述疾病是癌症。50.一种产生多特异性抗体的方法，所述方法包括培养根据实施方案35或36所述的宿主细胞以产生多特异性抗体。51.一种产生多特异性抗体的方法，所述方法包括培养包含表达载体的宿主细胞以产生多特异性抗体，所述表达载体包含编码根据实施方案1至32中任一项所述的抗体的核酸。52.一种制备根据实施方案1至32中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：-用包含编码抗体的核酸的表达载体转化宿主细胞，-在允许合成所述抗体的条件下培养所述宿主细胞，和-从所述宿主细胞培养物中回收所述抗体。53.特异性结合人dr5和人fap的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含两个特异性结合人dr5的fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合人fap，i)其中-特异性结合人dr5的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，以及ii)其中-特异性结合人fap的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。54.根据实施方案53所述的抗体，-其中特异性结合人dr5的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。55.特异性结合人dr5和人fap的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含两个特异性结合人dr5的fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合人fap，i)其中-特异性结合人fap的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人dr5的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和位置213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。56.根据实施方案55所述的抗体，-其中特异性结合人fap的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。57.特异性结合人dr5和人fap的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合人fap的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合人dr5，i)其中-特异性结合人fap的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人dr5的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。58.根据实施例57所述的抗体，-其中特异性结合人fap的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。59.特异性结合人dr5和人fap的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合人fap的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合人dr5，i)其中-特异性结合人dr5的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人fap的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。60.根据实施例59所述的抗体，-其中特异性结合人dr5的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。61.根据实施方案53至60中任一项所述的双特异性抗体，其特异性结合人dr5和人fap，其中a)抗体包含根据seqidno：33(<vhdr5>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：34(<vldr5>)的可变轻链结构域(vl)；和b)抗体包含根据seqidno：35(<vhfap>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：36(<vlfap>)的可变轻链结构域(vl)。62.根据实施方案54所述的双特异性抗体，其特异性结合人dr5和人fap，其中c)抗体包含根据seqidno：33(<vhdr5>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：34(<vldr5>)的可变轻链结构域(vl)；和d)抗体包含根据seqidno：35(<vhfap>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：36(<vlfap>)的可变轻链结构域(vl)。63.特异性结合人pd1和人tim3的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合人pd1的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中所述另外的fab片段特异性结合人tim3，i)其中-特异性结合人pd1的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人tim3的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。64.根据实施方案63所述的抗体，-其中特异性结合人pd1的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。65.特异性结合人pd1和人tim3的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合人pd1的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合人tim3，i)其中-特异性结合人tim3的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人pd1的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。66.根据实施方案65所述的抗体，-其中特异性结合人tim3的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。67.特异性结合人pd1和人tim3的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合人tim3的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合人pd1，i)其中-特异性结合人tim3的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人pd1的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。68.根据实施方案67所述的抗体，-其中特异性结合人tim3的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。69.特异性结合人pd1和人tim3的四价双特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，该全长抗体包含特异性结合人tim3的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合人pd1，i)其中-特异性结合人pd1的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中-特异性结合人tim3的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置123和124的氨基酸被k、r或h(优选k或r)取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147和213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)。70.根据实施方案69所述的抗体，-其中特异性结合人pd1的fab片段在cl结构域中包含以下氨基酸取代：-位置124的氨基酸被e或d取代。71.根据实施方案63至70中任一项所述的双特异性抗体，其特异性结合人pd1和人tim3，其中a)抗体包含根据seqidno：46(<vhpd1>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：47(<vlpd1>)的可变轻链结构域(vl)；和b)抗体包含根据seqidno：48(<vhtim3>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：49(<vltim3>)的可变轻链结构域(vl)。72.根据实施方案63至70中任一项所述的双特异性抗体，其特异性结合人pd1和人tim3，其中a)抗体包含根据seqidno：46(<vhpd1>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：47(<vlpd1>)的可变轻链结构域(vl)；和b)抗体包含根据seqidno：50(<vhtim3>)的可变重链结构域(vh)和根据seqidno：51(<vltim3>)的可变轻链结构域(vl)。73.在根据前述实施方案中任一个的一个优选实施方案中用于降低多特异性抗体在制备期间副产物形成和/或用于提高多特异性抗体聚集温度的方法，其包括以下步骤：-用包含编码四价多特异性抗体的重链和轻链的核酸的载体转化宿主细胞，所述四价多特异性抗体包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中另外的fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中为了降低多特异性抗体副产物的形成-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)；-在允许合成所述多特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞；和-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。74.在根据前述实施方案中任一个的一个优选实施方案中，用于降低多特异性抗体在制备期间副产物形成和/或用于提高多特异性抗体聚集温度的方法，其包括以下步骤：-用包含编码四价多特异性抗体的重链和轻链的核酸的载体转化宿主细胞，所述四价多特异性抗体包含：a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个fab片段，和b)两个另外的fab片段，其中所述另外的fab片段都在核心抗体重链的c-末端或n-末端融合，其中与重链融合的另外的fab片段表现出与在所述重链上排列的核心抗体的fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(vh)和可变轻链结构域(vl)彼此置换，和ii)其中为了降低多特异性抗体副产物的形成-特异性结合第一抗原的fab片段，或-特异性结合第二抗原的fab片段在恒定轻链结构域(cl)和恒定重链结构域1(ch1)中包含以下氨基酸取代：-cl结构域中位置124的氨基酸被k、r或h取代(根据kabat编号)，和-ch1结构域中位置147或213的氨基酸被e或d取代(根据kabateu索引编号)；-在允许合成所述多特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞；和-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。75.根据实施方案73或74所述的方法，其中在多特异性抗体的包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)。76.根据实施方案73或74所述的方法，其中在多特异性抗体的包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中ch1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被e或d取代(根据kabateu索引编号)；cl结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被k、r或h取代(根据kabat编号)，并且其中在不包含ii)中的氨基酸取代的fab片段中，cl结构域中位置124的氨基酸被e或d取代(根据kabat编号)。氨基酸序列描述实施例提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应该理解，可以在不背离本发明精神的情况下对所述程序进行修改。材料和一般方法关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下文献中给出：kabat,e.a.等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)。根据如上定义的kabat(kabat,e.a.等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))的编号系统对抗体链的氨基酸进行编号和参考。重组dna技术使用标准方法操作dna，如sambrook,j.等人molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989所述。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。基因合成通过化学合成从寡核苷酸制备所需的基因区段。通过退火和连接寡核苷酸组装侧翼为单个限制性内切核酸酶切割位点的600-1800bp长的基因区段，包括pcr扩增和随后通过所示的限制性位点例如kpni/saci或asci/paci克隆到基于ppcrscript(stratagene)的pga4克隆载体中。通过dna测序确认亚克隆的基因片段的dna序列。根据给定的规格在geneart(regensburg,germany)定制基因合成片段。dna序列测定通过在medigenomixgmbh(martinsried,germany)或sequiservegmbh(vaterstetten,germany)进行的双链测序确定dna序列。dna和蛋白质序列分析和序列数据管理使用gcg's(geneticscomputergroup,madison,wisconsin)软件包版本10.2和infomax'svectornt1advance套件版本8.0用于序列创建、绘图、分析、注释和说明。表达载体为了表达所述抗体，基于具有或不具有cmv-内含子a启动子的cdna组构或具有cmv启动子的基因组组构，应用用于瞬时表达(例如在hek293ebna或hek293-f)细胞的表达质粒的变体。除抗体表达盒外，载体还含有：-允许该质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。抗体基因的转录单元由以下元件组成：-5'端独特的限制性位点-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，-在cdna组构的情况下随后是内含子a序列，-人抗体基因的5'非翻译区，-免疫球蛋白重链信号序列，-人抗体链(野生型或具有结构域交换)作为cdna或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构，-具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，和-3'端的独特的限制性位点。通过pcr和/或基因合成产生包含如下所述的抗体链的融合基因，并通过已知的重组方法和技术通过连接相应的核酸区段(例如在相应的载体中使用独特的限制性位点)组装。通过dna测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物(nucleobondax，macherey-nagel)制备更大量的质粒。细胞培养技术如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.andyamada,k.m.(编辑),johnwiley&sons,inc.所述使用标准细胞培养技术。如下所述，通过在附着生长的hek293-ebna中或在悬浮生长的hek29-f细胞中瞬时共转染相应的表达质粒来表达多特异性抗体。在hek293-ebna系统中的瞬时转染通过在补充有10％超低iggfcs(胎牛血清,)、2mml-谷氨酰胺和250μg/ml遗传霉素的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium,)中培养的附着生长的hek293-ebna细胞(表达eb病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293；美国典型培养物收集中心(americantypeculturecollection)保藏号atcc#crl-10852,lot.959218)中瞬时共转染相应的表达质粒(例如编码重链和修饰的重链以及相应的轻链和修饰的轻链)表达多特异性抗体。为了转染，以4:1(范围从3:1至6:1)的fugenetm试剂(μl)与dna(μg)的比率使用fugenetm6转染试剂(rochemolecularbiochemicals)。使用范围从1:2至2:1的1:1(等摩尔)的(修饰的和野生型)轻链和重链编码质粒的摩尔比率分别从相应质粒表达蛋白质。细胞在第3天用l-谷氨酰胺加入4mm、葡萄糖[sigma]和naa饲育。转染后从第5天至第11天通过离心收获含有多特异性抗体的细胞培养物上清液，并储存于-20℃。关于在例如hek293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在以下文献中给出：meissner,p.等人biotechnol.bioeng.75(2001)197-2033。hek293-f系统中的瞬时转染根据制造商的说明书，使用hek293-f系统(invitrogen)通过用相应质粒(例如，编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)的瞬时转染产生多特异性抗体。简言之，用四种表达质粒和293fectintm或fectin(invitrogen)的混合物转染在摇瓶或在搅拌发酵罐中在无血清freestyletm293表达培养基(invitrogen)中悬浮生长的hek293-f细胞(invitrogen)。对于2l摇瓶(corning)，将hek293-f细胞以1.0e*6个细胞/ml的密度接种在600ml中并在120rpm，8％co2下孵育。第二天以细胞密度约1.5e*6个细胞/ml用约42ml的以下混合物转染细胞：a)20mlopti-mem(invitrogen)和600μg总质粒dna(1μg/ml)(等摩尔比率分别编码重链或修饰的重链，以及相应的轻链)，和b)20mlopti-mem+1.2ml293fectin或fectin(2μl/ml)。根据在发酵过程中的葡萄糖消耗加入葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并从上清液中直接纯化抗体或冷冻保存上清液。蛋白质测定根据pace等人proteinscience,1995,4,2411-1423，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm的光密度(od)来测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。上清液中抗体浓度的测定用蛋白a琼脂糖珠(roche)通过免疫沉淀估计细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。将60μl蛋白a琼脂糖珠在tbs-np40(50mmtris，ph7.5、150mmnacl、1％nonidet-p40)中洗涤三次。随后，将1-15ml细胞培养物上清液施加到tbs-np40中预平衡的蛋白a琼脂糖珠。在室温孵育1小时后，将珠用0.5mltbs-np40在ultrafree-mc-过滤柱(amicon)上洗涤一次，用0.5ml2x磷酸盐缓冲盐水(2xpbs，roche)洗涤两次，并用0.5ml100mm柠檬酸钠ph5.0简短地洗涤四次。通过加入35μllds样品缓冲液(invitrogen)洗脱结合的抗体。分别将样品的一半与样品还原剂组合或保持非还原，然后在70℃加热10分钟。从而，将5-30μl施加到4-12％bis-trissds-page(invitrogen)(具有用于非还原sds-page的mops缓冲液和具有用于还原sds-page的抗氧化剂运行缓冲液添加剂(invitrogen)的mes缓冲液)并用考马斯蓝染色。通过亲和hplc色谱法定量测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，将含有结合蛋白a的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到在agilenthplc1100系统上200mmkh2po4、100mm柠檬酸钠，ph7.4中的appliedbiosystemsporosa/20柱，并用200mmnacl、100mm柠檬酸酸，ph2.5从基质洗脱。通过uv吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的蛋白质。纯化的标准igg1抗体用作标准。或者，通过夹心-igg-elisa测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，用100μl/孔生物素化的抗人igg捕获分子f(ab')2<h-fcγ>bi(dianova)以0.1μg/ml在室温下包被streptawellhighbindstrepatavidina-96孔微量滴定板(roche)1小时或在4℃下过夜，随后用200μl/孔pbs，0.05％tween(pbst，sigma)洗涤三次。将含各抗体的细胞培养物上清液在pbs(sigma)中的系列稀释液100μl/孔加入孔中，并在微量滴定板摇床上在室温下孵育1-2小时。用200μl/孔pbst洗涤孔三次，并用0.1μg/ml的100μlf(ab')2<hfcγ>pod(dianova)作为检测抗体在室温下在微量滴定板摇床上检测结合的抗体1-2小时。用200μl/孔pbst三次洗掉未结合的检测抗体，通过加入100μlabts/孔检测结合的检测抗体。在tecanfluor光谱仪上测定405nm的测量波长(参考波长492nm)下吸光度。蛋白质纯化参考标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加到蛋白a琼脂糖柱(gehealthcare)并用pbs洗涤。在ph2.8达到抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(superdex200，gehealthcare)在pbs中或在20mm组氨酸、150mmnaclph6.0中将聚集的蛋白质从单体抗体分离。合并单体抗体级分，使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩器浓缩(如果需要)、冷冻并储存在-20℃或-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和分析表征，例如通过sds-page、尺寸排阻色谱法(sec)或质谱法。sds-page根据制造商的说明书使用pre-cast凝胶系统(invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％bis-trispre-cast凝胶(ph6.4)和mes(还原的凝胶，具有抗氧化剂运行缓冲添加剂)或mops(非还原的凝胶)运行缓冲液。分析尺寸排阻色谱法通过hplc色谱法进行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(sec)。简言之，将蛋白a纯化的抗体施加到agilenthplc1100系统上的300mmnacl、50mmkh2po4/k2hpo4，ph7.5中的tosohtskgelg3000sw柱，或者施加到dionexhplc系统上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)。通过uv吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的蛋白质。biorad凝胶过滤标准151-1901作为标准。质谱法本节描述了具有vh/vl交换(vh/vlcrossmab)的多特异性抗体的表征(和具有ch1/cl交换的一个对照(ch1/clcrossmab))，重点在于它们的正确组装。通过去糖基化的完整crossmab和去糖基化/纤溶酶消化的或者去糖基化/限制性lysc消化的crossmab的电喷雾电离质谱法(esi-ms)分析预期的一级结构。在蛋白质浓度为1mg/ml时，将vh/vlcrossmab(ch1/clcrossmab对照)用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f在37℃下去糖基化至多17小时。用100μg在tris缓冲液ph8中去糖基化的vh/vlcrossmab分别在室温下持续120小时和在37℃下持续40分钟进行纤溶酶或限制性lysc(roche)消化。在质谱法之前，样品通过hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。通过esi-ms在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上测定总质量。使用表面等离子体共振(spr)(biacore)测定多特异性抗体与相应抗原的结合和结合亲和力根据以下程序评估vegf结合：使用t200仪器(gehealthcare)通过表面等离子体共振研究所示抗体与人vegfa-121的结合。通过使用gehealthcare提供的胺偶联试剂盒将约10000(ru)抗his抗体(1μg/ml抗his抗体；订购代码：28995056；gehealthcarebio-sciencesab，sweden)偶联在系列scm5芯片(gehealthcarebr-1005-30)上，ph5.0。在固定程序期间使用hbs-n(10mmhepes、150mmnaclph7.4，gehealthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是ph7.4的pbs-t(10mm磷酸盐缓冲盐水，包含0.05％tween20)。流动池设置为25℃-样品块设置为12℃-并在动力学表征之前用运行缓冲液预处理两次。通过以5μl/分钟的流速注射0.5μg/ml溶液30秒来捕获vegf-a-121-his。通过注射溶液中不同浓度的所示抗体180秒测量结合，流速30μl/分钟，从1000nm开始以1:3系列稀释。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液转换到运行缓冲液触发。通过用甘氨酸ph1.5溶液以30μl/分钟的流速洗涤60秒再生表面。通过减去从抗his抗体表面获得的反应来校正本体折射率差异。也减去空白注射(＝双重参考)。为了计算kd和其他动力学参数，使用langmuir1：1模型。根据以下程序评估ang-2结合：使用t200仪器(gehealthcare)通过表面等离子体共振研究所示抗体与人ang-2-rbd-fc的结合。通过使用gehealthcare提供的胺偶联试剂盒将约8000(ru)山羊抗人f(ab’)2(10μg/ml抗人f(ab’)2；订购代码：28958325；gehealthcarebio-sciencesab，sweden)偶联在系列scm5芯片(gehealthcarebr-1005-30)上，ph5.0。在固定程序期间使用hbs-n(10mmhepes、150mmnaclph7.4，gehealthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是ph7.4的pbs-t(10mm磷酸盐缓冲盐水，包含0.05％tween20)。流动池设置为25℃-样品块设置为12℃-并在动力学表征之前用运行缓冲液预处理两次。通过以5μl/分钟的流速注射5nm溶液25秒来捕获双特异性抗体。通过注射溶液中不同浓度的人ang2-rbd-fc120秒测量结合，流速30μl/分钟，从100nm开始以1:3系列稀释。监测解离相长达180秒，并通过从样品溶液转换到运行缓冲液触发。通过用甘氨酸ph2.1溶液以30μl/分钟的流速洗涤60秒再生表面。通过减去从山羊抗人f(ab’)2表面获得的反应来校正本体折射率差异。也减去空白注射(＝双重参考)。为了计算表观kd，使用langmuir1：1模型。评估crossmab与dr5和fap的同时结合首先，通过使用由gehealthcare提供的胺偶联试剂盒，将约600个共振单位(ru)的dr5(20μg/ml)偶联在ph5.0的cm5芯片(gehealthcarebr-1005-30)上。样品和系统缓冲液是ph7.4的pbs-t(包含0.05％tween20的10mm磷酸盐缓冲盐水)。将流动池设置为25℃，将样品块设置为12℃并用运行缓冲液预处理两次。其次，以30μl/分钟的流量注射10μg/ml双特异性抗体溶液30秒。第三，以30μl/分钟的流速注射hfap(10μg/ml)30秒。hfap的结合反应取决于与hdr5结合的双特异性抗体的量并显示同时结合。通过用甘氨酸ph2溶液(gehealthcarebr-1003-55)以30μl/分钟的流速洗涤70秒来再生表面。通过hfap与先前dr5结合的crossmab的另外的特异性结合信号显示同时结合。crossmab与dr5和fap独立结合的评估通过使用由gehealthcare提供的胺偶联试剂盒将捕获系统(5μg/ml抗人igg(fc)；gehealthcare，br-1008-39)的约3000个共振单位(ru)偶联在cm5芯片(gehealthcarebr-1005-30)上，ph5.0。样品和系统缓冲液是ph7.4的pbs-t(10mm磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％tween20)。流动池的温度设置为25℃，样品块的温度设置为12℃。在捕获之前，流动池用运行缓冲液预处理两次。通过以5μl/分钟的流速注射5μg/ml溶液60秒来捕获双特异性抗体。通过测定对顺序或同时加入(10μl/分钟的流速)的每种配体的活性结合能力，分析每种配体与双特异性抗体的独立结合：1.以5μg/ml的浓度注射人dr5180秒(鉴定抗原的单一结合)。2.以5μg/ml的浓度注射人fap180秒(鉴定抗原的单一结合)。3.以5μg/ml的浓度注射人dr5和以5μg/ml的浓度注射人fap180秒(同时鉴定与dr5和fap的结合)。通过用3mmgcl2溶液以30μl/分钟的流速洗涤60秒来再生表面。通过减去从抗人igg表面获得的反应来校正本体折射率差异。如果方法3所得的最终信号等于方法1和方法2的单个最终信号的总和，则双特异性抗体能够相互独立地结合两种抗原。根据以下程序评估pd1结合：通过胺偶联将抗人fcigg固定到(biacore)cm5传感器芯片的表面。然后捕获样品并将hupd1-ecd与其结合。在每个分析周期后再生传感器芯片表面。通过将数据拟合至1：1langmuir相互作用模型，最终获得平衡常数和动力学速率常数。使用由gehealthcare提供的胺偶联试剂盒将约10,000个反应单位(ru)的20μg/ml抗人igg(gehealthcare#br-1008-39)偶联到biacoret200中cm5传感器芯片的所有流动池上。样品和运行缓冲液是hbs-ep+(0.01mhepes，0.15mnacl，3mmedta，0.05％v/v表面活性剂p20，ph7.4)。流动池温度设置为25℃，样品室温度设置为12℃。该系统用运行缓冲液预处理。将不同的样品以10nm的浓度注射15秒并连续结合流动池2、3和4。然后将完整的一组人pd1-ecd浓度(300nm、100nm、2×33.3nm、11.1nm、3.7nm、1.2nm和2x0nm)在每个样品上注射300s，随后是10/600s的解离时间和用3mmgcl2的两个30s的再生步骤，最后一个再生步骤包含使用运行缓冲液的“注射后额外的洗涤”。最后，使用biacoret200评估软件将双参考数据拟合至1：1langmuir相互作用模型。根据以下程序评估tim3结合：通过胺偶联将抗人fabigg固定到(biacore)cm5传感器芯片的表面。然后捕获样品并将hu3-ecd与其结合。在每个分析周期后再生传感器芯片表面。通过将数据拟合至1：1langmuir相互作用模型，最终获得平衡常数和动力学速率常数。使用由gehealthcare提供的胺偶联试剂盒将约10,000个反应单位(ru)的20μg/ml抗人fabigg(gehealthcare#28-9583-25)偶联到biacoret200中的cm5传感器芯片的所有流动池上。样品和运行缓冲液是hbs-ep+(0.01mhepes，0.15mnacl，3mmedta，0.05％v/v表面活性剂p20，ph7.4)。流动池温度设置为25℃，样品室温度设置为12℃。该系统用运行缓冲液预处理。将不同的样品以10nm的浓度注射30秒并连续结合至流动池2、3和4。然后将完整的一组人tim3-ecd浓度(600nm、200nm、2×66.7nm、22.2nm、7.4nm和2×0nm)在每个样品上注射200s，随后是10/600s的解离时间和两个用甘氨酸hclph2.1的30s再生步骤，最后一个再生步骤包含使用运行缓冲液的“注射后额外的洗涤”。最后，使用biacoret200评估软件将双参考数据拟合至1：1langmuir相互作用模型。实施例1提供在一个结合臂中具有vh/vl结构域交叉的二价多特异性抗体，其在ch1/cl界面中具有带电荷的氨基酸取代(概念验证)为了提供证明在多特异性抗体的ch1/cl界面内取代不同氨基酸的作用的概念验证，生成了在其两个结合臂之一中具有vh/vl结构域交叉的示例性二价抗体。生成在ch1/cl界面中不具有氨基酸取代的抗体(对照)，以及在ch1/cl界面中具有单个以及多个带电荷氨基酸取代的抗体。示例性地，产生具有非交叉结合臂的结合人血管生成素-2(ang2)和具有vh/vl交叉结合臂的结合人vegf的多特异性抗体。如通常的方法部分所述通过经典分子生物学技术和通过如上所述在hek293细胞中瞬时表达抗体进行抗体产生。表1中示出了各个抗体中的氨基酸取代。表1：用于概念验证的二价多特异性抗ang2-vegf抗体的氨基酸取代使用含有编码表2所示氨基酸序列的核酸的表达质粒表达多特异性抗体。表2：用于概念验证的二价多特异性抗ang2-vegf抗体的氨基酸序列抗体lcang-2hcang-2hcvegflcvegfang2vegf-0273seqidno:1seqidno:2seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0396seqidno:5seqidno:6seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0397seqidno:5seqidno:7seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0394seqidno:8seqidno:6seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0395seqidno:8seqidno:7seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0274seqidno:9seqidno:10seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0282seqidno:11seqidno:10seqidno:3seqidno:12ang2vegf-0283seqidno:13seqidno:10seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0284seqidno:11seqidno:14seqidno:3seqidno:4ang2vegf-0285seqidno:11seqidno:14seqidno:3seqidno:12ang2vegf-0286seqidno:9seqidno:10seqidno:3seqidno:12对于所有构建体，使用杵臼异二聚化技术，其中在第一ch3结构域中具有典型的杵(t366w)取代和在第二ch3结构域中具有相应的臼取代(t366s、l368a和y407v)(以及两个另外的引入的半胱氨酸残基s354c/y349c)(包含在上面描述的各相应的重链(hc)序列中)。通过蛋白a亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从细胞培养物上清液中纯化表达的多特异性抗体。所有多特异性抗体都可以以高产率生产并且稳定。表征所得产物通过质谱法的鉴定以及分析特性，如通过sds-page的纯度、单体含量和稳定性。质谱法通过去糖基化完整抗体和去糖基化/纤溶酶消化的或者可选地去糖基化/限制性lysc消化的抗体的电喷雾电离质谱(esi-ms)分析预期的一级结构。在蛋白质浓度为1mg/ml时，将vh/vlcrossmab用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f在37℃下去糖基化至多17小时。用100μg去糖基化的抗体在tris缓冲液ph8中分别在室温下持续120小时和在37℃下持续40分钟进行纤溶酶或限制性lysc(roche)消化。在质谱法之前，样品通过hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。通过esi-ms在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上测定总质量。具有vh/vl结构域交叉的二价多特异性抗体的主要副产物是基于bence–jones型相互作用(还参见schaefer,w.等人pnas,108(2011)11187-1191；在增补中的图s1i)。对二价多特异性抗体的分析揭示了通过在ch1/cl界面中引入带相反电荷的氨基酸可以极大地降低vh/vl结构域交叉的多特异性抗体的主要副产物。ms分析的结果显示在表3中。表3：当表达用于概念验证的二价多特异性抗ang2-vegf抗体时，如通过质谱法测定的形成的主要副产物(bence-jones型)的分数如ms结果所示，与缺乏这些取代的“野生型”vh/vl交换的二价对照抗体相比，在ch1/cl界面中引入带相反电荷的氨基酸强烈降低副产物形成。如所示的本发明的氨基酸取代，即cl结构域中位置124的氨基酸取代与相应的ch1(参见抗体ang2vegf-0396和ang2vegf-0397)结构域位置147或213的取代组合导致比仅在一个氨基酸残基上不同的抗体分子(即在cl结构域中氨基酸123而不是氨基酸124的交换；参见抗体ang2vegf-0394和ang2vegf-0395)更优异的副产物降低。包含具有cl结构域中位置124氨基酸取代的多个氨基酸取代的抗体显示不存在或不可检测的bence-jones型副产物，表明主要副产物的形成可被完全抑制。所有抗体均可以良好产率产生。在蛋白a纯化后评估所示多特异性抗体的示例性产生的产率。结果显示在表4中。表4：所示抗体的生产产率[mg/l上清液]抗体产率[mg/l]ang2vegf-027365ang2vegf-039680.8ang2vegf-039768.4ang2vegf-039479.2ang2vegf-039593.6如通用方法部分中所述评估抗原结合。结果显示在表5中。表5：所示抗体对ang2和vegf的亲和力所有测试的抗体特异性结合两个靶标ang2和vegf，并且在纳摩尔范围内表现出抗原亲和力。带电荷氨基酸残基的引入不损害抗原结合。为了评估抗体构建体的稳定性，根据以下程序评估热稳定性以及聚集起始温度。在20mm组氨酸/组氨酸氯化物、140mmnacl，ph6.0中制备1mg/ml浓度的所示抗体的样品，将其转移到10μl微量杯阵列中，用optim1000仪器(avactainc.)记录静态光散射数据以及用266nm激光激发的荧光数据，而样品以0.1℃/分钟的速率从25℃加热到90℃。聚集起始温度(tagg)被定义为散射光强度开始增加时的温度。熔融温度(tm)被定义为荧光强度对波长图中的拐点。结果显示在表6中。表6：所示抗体的聚集起始温度(tagg)和熔融温度(tm)样品氨基酸取代tagg(℃)tm(℃)ang2vegf-0273无(野生型,对照)56,061,3ang2vegf-0396ch1/cl界面中的单个取代56,962,0ang2vegf-0397ch1/cl界面中的单个取代56,061,7ang2vegf-0394ch1/cl界面中的单个取代56,962,2ang2vegf-0395ch1/cl界面中的单个取代56,862,1ang2vegf-0274ch1/cl界面中的多个取代53,558,9ang2vegf-0282ch1/cl界面中的多个取代56,961,4ang2vegf-0283ch1/cl界面中的多个取代56,361,0ang2vegf-0284ch1/cl界面中的多个取代56,361,1ang2vegf-0285ch1/cl界面中的多个取代56,361,1ang2vegf-0286ch1/cl界面中的多个取代56,361,6来自概念验证实验的结果证明ch1/cl界面中的单个氨基酸取代有效地强烈降低具有vh/vl结构域交叉的多特异性抗体的副产物形成。多个氨基酸取代的引入有效地完全抑制具有vh/vl结构域交叉的多特异性抗体的主要bence-jones型副产物的形成。然而，包括氨基酸取代的所有抗体构建体可以以良好的产率稳定地产生，并且以纳摩尔范围与其各自的抗原结合。实施例2：提供在一个结合臂中具有vh/vl结构域交叉的本发明的四价多特异性抗体，其ch1/cl界面中具有带电荷的氨基酸取代如针对实施例1的抗体所述产生、表达和纯化特异性结合dr5和fap的四价双特异性抗体。该实施例的四价抗体包含特异性结合dr5的单特异性核心抗体。如图1a和1b所示，将特异性结合fap的两个fab片段融合至核心抗体重链的c-末端。生成在ch1/cl界面中没有氨基酸取代的抗体(对照)，以及在ch1/cl界面中具有多个带电荷氨基酸取代的抗体。表7中示出了抗体的结构域排列以及ch1/cl界面中的氨基酸取代。表7：四价多特异性抗dr5-fap抗体的ch1/cl界面中的氨基酸取代使用含有编码表8所示氨基酸序列的核酸的表达质粒表达四价多特异性抗体。表8：四价多特异性抗dr5-fap抗体的氨基酸序列表达的多特异性抗体通过蛋白a亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从细胞培养物上清液纯化。蛋白a亲和色谱法后评估聚集体含量和生产产率。表9：所示的四价多特异性抗dr5-fap抗体的蛋白a纯化后的聚集体含量和生产产率[mg/l上清液；计算]。lmw含量是100与单体和聚集体含量总和之差。当与其各自的野生型vh/vl结构域交叉对照抗体相比时，本发明的抗体中聚集体形成减少。在另外的纯化步骤中，进一步通过制备型sec加工样品。表10总结了该步骤的结果。表10：制备型sec纯化的总结。描述了产率以及通过ce-sds的纯度和通过分析型sec的单体含量。表11：所示抗体的聚集起始温度(tagg)所有表达的dr5fapcrossmab都是稳定的并具有相似的聚集起始温度(除dr5taa-0081外)。如实施例1所述，通过ms分析抗体的预期一级结构。当产生相应的野生型vh/vl结构域交叉四价抗dr5-fap抗体时可检测的主要副产物是包含三条fap轻链和仅一条dr5轻链的半功能性抗体。为了说明的目的，野生型抗体dr5taa-0077和dr5taa-0081的所需分子和相应的主要副产物示于图3a和b(分别为左图和中图)。对本发明的四价抗体的ms分析显示，通过在vh/vl结构域交叉的四价抗dr5-fap抗体的ch1/cl界面中引入带电荷的氨基酸残基，可以大大降低主要副产物的级分。表12：通过质谱测定表达四价多特异性抗dr5-fap抗体时形成的主要副产物(具有三条fap轻链和一条dr5轻链的抗体)和副产物的级分**请注意：定量意味着定量估算，因为不同分子的电离效率可能因特定的非确定因素而不同。由于dr5fap的分子大小及其定量的副产物在文中是相似的，因此定量可用于比较不同dr5fap分子的完整性。上表表明，与没有带电荷的残基的变体相比，引入的电荷降低了轻链的错配。根据选择的带电荷残基，可以将轻链错配降低到检测极限。该表清楚地表明，在fap恒定轻链中使用的带电荷残基q124e、在dr5恒定轻链(cl)中的e123r/q124k、在dr5的ch1中的k147e；k213e可以避免任何副产物的形成。将两个电荷交换放置在非交叉结构域中并将单个另外的电荷放置在交叉域中是有益的。实施例3：评估dr5和fap独立地与crossmab结合显示了dr5和fap与具有不同结构域交叉以及具有不同的另外引入带电荷残基的dr5taacrossmab的独立结合。因此，<fc>捕获igg被固定在芯片表面上并捕获不同的dr5taacrossmab。在实验中，将靶标dr5和fap单独地或同时添加到捕获的crossmab中。表13：fap和dr5与不同四价dr5fapcrossmab的单独和同时结合的总结。该表表明针对每个结合事件和组合结合事件的ru，以及测量的信号强度和预期信号强度之间的比率。这个实验的结果(表显示dr5和fap混合物的实验测量信号强度之间的比率与理论预期的最大靶标占有非常相似(都高于90％)。这表明具有不同结构域交换和带电荷残基的dr5taacrossmab能够同时结合，而与所应用的分子设计无关。实施例4：评估dr5和fap同时与crossmab结合将dr5固定在芯片表面上，并在第一结合步骤中加入dr5taacrossmab。在第二步骤中加入配体fap。dr5taa样品的spr分析显示不依赖于结构域交叉的位置并且不依赖于引入的带电荷氨基酸，dr5taacrossmab的所有变体能够同时结合两个靶标。该实验的结果(spr传感图)在图5a、b和c中描述，并且清楚地显示所有crossmab同时结合dr5和fap。实施例5：产生和表达结合pd1和tim3的多特异性抗体，其在两个结合臂中具有vh/vl结构域交换/置换(2+2crossmabvh-vl)并且在ch1/cl界面中具有单个带电荷的氨基酸取代在一个实施例中，通过经典分子生物学技术如常规方法部分所述产生与人pd1和人tim3结合的多特异性抗体，并如上所述在expi293f细胞的293f中瞬时表达。wo2010/145792中也描述了没有电荷的多特异性2+2crossmabvh-vl抗体。使用含有编码表14所示氨基酸序列的核酸的表达质粒表达多特异性抗体。表14：具有vh/vl结构域交换/置换(2+2crossmabvh-vl)的轻链(lc)和重链(hc)的氨基酸序列2+2抗体hclc1lc2pd1tim3_0358seqidno:37seqidno:38seqidno:39pd1tim3_0359seqidno:40seqidno:41seqidno:42pd1tim3_0321seqidno:43seqidno:44seqidno:45作为进一步的实施例，使用与表14中相同的构建体/igg骨架表达四价双特异性pd1tim3抗体，但其具有i)对于pd1结合臂的seqidno：46(vh抗-pd1)和seqidno：47(vl抗pd1)的人源化可变结构域，和对于tim3结合臂的seqidno：48(vh抗tim3)和seqidno：49(vl抗tim3)的人源化可变结构域；以及具有ii)对于pd1结合臂的seqidno:46(vh抗pd1)和seqidno:47(vl抗pd1)的人源化可变结构域，和对于tim3结合臂的seqidno:50(vh抗tim3)和seqidno:51(vl抗tim3)的人源化可变结构域。实施例6：纯化和表征与pd1和tim3结合的多特异性抗体通过蛋白a亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上述表达的多特异性抗体。所有多特异性抗体都以良好的产率产生并且稳定。表征所得产物通过质谱法的鉴定以及分析特性，如通过sds-page的纯度、单体含量和稳定性。质谱通过去糖基化的完整crossmab和去糖基化/纤溶酶消化的或者可选地去糖基化/限制性lysc消化的crossmab的电喷雾电离质谱(esi-ms)分析预期的一级结构。在蛋白质浓度为1mg/ml时，将vh/vlcrossmab用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f在37℃下去糖基化至多17小时。用100μg去糖基化的vh/vlcrossmab在tris缓冲液ph8中分别在室温下持续120小时和在37℃下持续40分钟进行纤溶酶或限制性lysc(roche)消化。在质谱法之前，样品通过hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。通过esi-ms在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上测定总质量。多特异性抗体的稳定性为了评估抗体构建体的稳定性，根据以下程序评估热稳定性以及聚集起始温度。在20mm组氨酸/组氨酸氯化物、140mmnacl，ph6.0中制备1mg/ml浓度的所示抗体的样品，将其转移到10μl微量杯阵列中，用optim1000仪器(avactainc.)记录静态光散射数据以及用266nm激光激发的荧光数据，而样品以0.1℃/分钟的速率从25℃加热到90℃。聚集起始温度(tagg)被定义为散射光强度开始增加时的温度。熔融温度(tm)被定义为荧光强度对波长图中的拐点。实施例7：2+2抗pd1-tim3多特异性抗体的表征结合elisahupd1的elisa用浓度为500ng/ml的25μl/孔生物素化的pd1-ecd-avihis包被nuncmaxisorp链霉亲和素包被板(microcoat#11974998001)，并在4℃过夜孵育。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)以递增浓度加入25μl抗pd1抗体样品，并在室温孵育1小时。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)以1:5000稀释度加入25μl/孔山羊抗人h+l-pod(jir，jir109-036-098)，并在室温在振荡器上孵育1小时。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)加入25μl/孔tmb底物(roche，11835033001)并孵育直至od2-3。在370/492nm进行测量。hutim3的elisa用浓度为60ng/ml的25μl/孔生物素化的tim3-ecd-avihis包被nuncmaxisorp链霉亲和素包被板(microcoat#11974998001)，并在4℃过夜孵育。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)以递增浓度加入25μl抗pd1抗体样品，并在室温孵育1小时。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)以1:5000稀释度加入25μl/孔山羊抗人h+l-pod(jir，jir109-036-098)，并在室温在振荡器上孵育1小时。洗涤后(3×90μl/孔，用pbst缓冲液)加入25μl/孔tmb底物(roche，11835033001)并孵育直至od2-3。在370/492nm进行测量。elisa结果在表15中以ec50值[nm]列出。表15：抗pd1-tim3双特异性抗体的生物化学和细胞结合(elisa)对于tim3的二价抗体(嵌合的tim3-0018、2+2pd1tim3-0359、嵌合的tim3-0028、2+2pd1tim3-0358)可以检测到双价(avid)结合(即与两臂的结合)。对于pd1结合没有检测到亲合力作用。二价和四价形式的ec50值相当。结合biacore与pd1和tim3结合的多特异性抗体的抗原结合特性通过评估多特异性抗体与其各自的靶抗原即pd1和tim3的结合。结果显示在表16中。表16：双特异性抗体对pd1/tim3的亲和力样品pd1-臂kd[nm]tim3-臂kd[nm]pd1tim3-0358(2+2)n.d.2.2pd1tim3-0359(2+2)1.90.3所有测试的抗体特异性结合两个靶标pd1和tim3。当前第1页12