本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种控制水稻耐冷性的基因oscpk24及其应用。
背景技术：
水稻(oryzasativa)是世界第二大粮食作物，产量约占世界粮食总产的1/3。水稻起源于热带或亚热带地区，属于喜温作物，对低温很敏感。低温冷害是影响水稻稳定生产的主要逆境之一。全球每年约有1500万hm2水稻受到寒冷胁迫(louetal.,2007.euphytica158:87-89)，在南亚和东南亚约有700万hm2面积因低温影响不能种植现代水稻品种(sthapitetal.,1998.cropsci38:660-666)，而我国每年因冷害损失稻谷约50亿kg(潘英华等，2010，中国农学通报，2010，26(17)：54-59)。水稻芽期和苗期冷害多发生在我国长江流域早稻区和云、贵、川等高纬度及高海波一季中稻区，这些稻区在水稻生长前期常遇寒潮侵袭，非耐冷品种幼芽和幼苗停止生长，易导致烂秧、死苗或弱苗、抽穗分散，成熟期不一致等现象，严重影响水稻产量(andayaetal.,2003.jexpbot54:2579-2585；fujinoetal.,2004.theorapplgenet108:794-799；kosekietal.,2010.molgenetgenom284:45-54)。不仅如此，水稻的耐冷性还直接关系到水稻栽培区域及复种面积的扩大。因此，挖掘水稻内源抗冷基因，研究其抗冷分子机理，对于培育耐冷水稻品种，提高水稻产量具有重要指导意义(zhouetal.,2012.breedingsci62:196-201)。
ca2+作为一种重要的第二信使，可引起细胞内多种特异性的反应应答。在植物中，钙离子浓度的变化调控着下游的效应分子，影响着植物生长发育、抵御非生物逆境和生物逆境等多个重要过程(harperetal.,2004.annurevplantbiol55:263-288)。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinases,cdpksorcpks)就是接受并传递这种ca2+信号的效应分子之一。cpks是一类大的蛋白激酶家族，属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，活性直接受ca2+的调控而不依赖钙调素(cam)和磷脂(harperetal.,2004.annurevplantbiol55:263-288)。这类蛋白激酶首先在大豆中发现，后来被证实广泛存在于各种植物、绿藻和原生动物中，但在酵母、线虫、果蝇以及哺乳动物的细胞中没有发现它们的存在。典型的cpk分子是由4个结构域组成的单条多肽链，包括n末端的可变结构域、激酶活性结构域、自抑制结构域和c末端钙调结构域(hrabaketal.,2003.plantphysiol132:666-680.苏氨酸激酶结构域；自抑制结构域又称连接结构域，序列具有高度的保守性；c末端钙调结构域由2–4个可以结合ca2+的ef手相结构域组成。
研究证明，cpks在植物非生物逆境应答中扮演重要角色。最早发现cpks参与响应非生物胁迫过程的是urao等，他们在脱水处理1h的拟南芥中分离到了atcpk10(atcdpk1)和atcpk11(atcdpk2)两个基因，通过northernblot分析证明atcpk10和atcpk11基因的表达受干旱和高盐诱导，而不受低温和高温诱导(uraoetal.,1994.molgengenet244:331-340.)。zou等研究表明，过表达atcpk10的转基因植株耐旱性增强，相反atcpk10突变体对干旱胁迫的敏感性增加。进一步研究发现，atcpk10与热激蛋白hsp1互作，可能通过aba和ca2+介导的气孔关闭过程参与耐旱性调节(zouetal.,2010.plantj24:445-458)。核和膜定位的atcpk3正向参与盐胁迫信号转导途径，在盐胁迫下，atcpk3激酶活性增强与mapk途径突变体相比cpk3突变体表现出更明显的盐敏感性(mehlmeretal.,2010.plantj63:484-498)。与此功能相同的还有膜定位的atcpk27，其表达受盐胁迫诱导上调，在种子萌发和萌发后幼苗生长过程中cpk27突变体对盐胁迫更敏感(zhaoetal.,2015.gene563:203-214)，以及与atcpk3一起调节气孔关闭的atcpk6，其表达受盐和渗透胁迫诱导，虽然其突变体没有明显的表型，但其过表达植物耐旱性和耐盐性增强(xuetal.,2010.planta231:1251-1260.)。
作为基因组学研究的模式作物之一，水稻基因组中包含31个oscpks，除少数几个基因功能被报道之外，大部分基因功能还处于未知状态。基于cpks在植物抗非生物逆境中的重要地位，本发明利用基因工程手段，结合遗传学和分子生物学等方法，对oscpk24基因功能进行了研究，揭示了oscpk24在水稻抗冷过程中具有重要作用，为培育水稻耐冷品种提供了新的基因资源。
技术实现要素：
本发明的目在于提供一种调控植物特别是水稻耐冷性的基因oscpk24，该基因从水稻品种日本晴中鉴定并分离克隆得到，该基因具有seqidno:1所示的cds序列，其编码的蛋白质序列如seqidno:2所示。
本发明的另一个目的是提供oscpk24基因在调控水稻耐冷性中的应用，通过camv35s启动子驱动oscpk24基因在水稻植株中超量表达可达到冷胁迫下提高植株存活率的效果，从而提高水稻品种的耐逆性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
(1)发明人通过反向遗传学方法，从逆境芯片表达谱中挑选受冷诱导上调表达的基因oscpk24，利用qrt-pcr验证了oscpk24受冷诱导。
(2)申请人通过基因克隆方法得到一种调控水稻耐冷性基因oscpk24：pcr反应扩增，反应体系的总体积为20μl，模板为日本晴cdna1μl(约10ng)、10×extaq酶反应缓冲液2μl、5mmdntp2μl、5μm正向引物0.2μl、5μm反向引物0.2μl、0.2μlextaq酶，加ddh2o(无菌去离子水)至20μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃40s、60℃40s、72℃1min32循环，72℃延伸10min。
正向引物:ggatcccaaggcaagaagttgggtg；
反向引物:ctgcagagcacaattcactctcttcggc；
最终获得如seqidno:1所示的基因oscpk24(1-1542bp)，该基因编码的蛋白质序列如seqidno:2所示。
(3)oscpk24基因在调控水稻耐冷性中的应用，包括将oscpk24全长cds克隆到超表达载体pcambia1300s上(pcambia1300s载体改造自pcambia1300(http://www.cnki.net/，叶水烽，水稻cdpks基因的表达谱分析和黑藻hvppc2转基因水稻的培育和功能分析。[博士学位论文]。武汉：华中农业大学图书馆，2009))，该载体的构建图如图2所示。将oscpk24(1238-1376bp)核苷酸序列(如seqidno:3所示，138bp)，克隆到rnai抑制表达载体pds1301上，将上述所得的两个表达载体分别转入水稻品种“日本晴”中，生物功能验证表明，超表达转基因水稻株系均表现为冷胁迫下植株存活率比野生型植株要高，而抑制表达转基因水稻株系均表现为冷胁迫下植株存活率比野生型植株低，因此可通过本发明来改变水稻品种的耐冷性。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)目前水稻的耐冷分子机制并不清楚，受冷胁迫诱导的oscpk24基因为水稻耐冷分子机制研究提供了技术基础。
(2)本发明通过上调oscpk24基因表达增强了水稻耐冷性，表明oscpk24基因表达量与水稻耐冷性相关，这为鉴定耐冷性强的水稻品种提供了新的筛选基因。
(3)本发明通过超表达oscpk24基因可获得水稻耐冷性增强的植株，这为培育强耐冷性的水稻品种提供了一种新的遗传种质。
附图说明
序列表seqidno:1是本发明克隆的oscpk24基因的核苷酸序列，序列长度为1542bp。
序列表seqidno:2是oscpk24基因编码的蛋白质序列，编码513个氨基酸残基。
序列表seqidno:3是本发明构建的的双链抑制rnai载体pds1301-oscpk24的核苷酸序列，序列长度为138bp。
图1：qrt-pcr验证oscpk24受冷胁迫诱导结果。
图2：原始载体p1300s的图谱。
图3：本发明改造后的p1300s-oscpk24超表达载体结构示意图。
图4：原始双链抑制载体pds1301载体图谱。
图5：本发明构建pds1301-oscpk24抑制载体的图谱。
图6：超表达和抑制表达转基因水稻中oscpk24的相对表达量。附图标记说明，oe3、oe7和oe9为转pcambia1300s-oscpk24超表达转基因系；r7、r13和r14为转pds1301-oscpk24抑制表达转基因系。图7：多个独立的超表达和抑制表达转基因系的冷胁迫前后的表型。附图标记说明，图7中的a图为冷胁迫前超表达转基因系的表型，图7中的b图为冷胁迫前抑制表达转基因系的表型，图7中的c图为冷胁迫后超表达转基因系的表型，图7中的d图为冷胁迫后抑制表达转基因系的表型。
图8：冷胁迫后超表达和抑制表达转基因系的相对存活率。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂和生物材料，如未特别说明，均已公开。
实施例1：一种调控水稻耐冷性基因oscpk24的获得
(1)调控水稻耐冷性基因oscpk24核苷酸序列的克隆：
通过pcr反应获得，反应体系的总体积为20μl，模板为“日本晴”cdna1μl(约10ng)、10×extaq酶反应缓冲液2μl、5mmdntp2μl、5μm正向引物0.2μl、5μm反向引物0.2μl、0.2μlextaq酶，加ddh2o(即无菌去离子水)至20μl。
反应程序：94℃变性5min，94℃40s、60℃40s、72℃1min32cycles，72℃延伸10min。
正向引物：ggatcccaaggcaagaagttgggtg；
反向引物：ctgcagagcacaattcactctcttcggc；
最终获得包含seqidno:1所述核苷酸的基因序列的基因，该基因编码蛋白质如seqidno:2所示。
(2)qrt-pcr验证oscpk24受冷胁迫诱导：
将生长2周的水稻“日本晴”苗，在4℃处理0h、12h、24h、36h、48h和72h时分别取rna样品，利用invitrogen公司的trizol抽提试剂盒抽提rna(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，然后利用takaraprimescriptfirst-strandcdnasysthesiskit(宝生物工程大连有限公司)合成第一链cdna，然后利用实时定量pcr检测不同胁迫时间下植株中oscpk24的相对表达量。实时定量pcr引物如下：
正向引物：tcgacaaagatggaagtggtttc；
反向引物：ggtgaagatcatcaaggccaaa；
结果表明本发明克隆的基因oscpk24是受冷胁迫诱导。
实施例2：oscpk24基因在调控水稻抗冷性中的应用
具体步骤如下：
(1)构建植物表达载体p1300s-oscpk24
根据ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的oscpk24基因全长cdna序列，设计引物pcr扩增基因片段。获得的oscpk24基因片段如seqidno:1所示。
pcr扩增反应体系的总体积为20μl，模板为日本晴cdna1μl(约10ng)、10×extaq酶反应缓冲液2μl、5mmdntp2μl、5μm正向引物0.2μl、5μm反向引物0.2μl、0.2μlextaq酶，加ddh2o(无菌去离子水)至20μl。
反应程序：94℃变性5min，94℃40s、60℃40s、72℃1min32个循环，72℃延伸10min。
正向引物：ggtacccaaggcaagaagttgggtg；
反向引物：ctgcagagcacaattcactctcttcggc。
扩增得到如seqidno:1所示的片段，利用kpni/psti酶切位点将获得片段克隆到pcambia1300s上，得到植物表达载体p1300s-oscpk24(如图3所示)，将该表达载体转入水稻品种“日本晴”中。
(2)构建植物表达载体pds1301-oscpk24
通过pcr扩增获的如seqidno:3所示序列的dna片段。
pcr扩增反应体系的总体积为20μl，模板为本实施例中步骤(1)中pcr扩增获得的片段1μl(约10ng)、10×extaq酶反应缓冲液2μl、5mmdntp2μl、5μm正向引物0.2μl、5μm反向引物0.2μl、0.2μlextaq酶，加ddh2o(无菌去离子水)至20μl。
反应程序：94℃变性5min，94℃30s、60℃30s、72℃30s32cycles，72℃延伸10min。
正向引物：ggtaccactagtctctccacatgaataagc；
反向引物：ggatccgagctcgtgaagatcatcaaggccaaa。
扩增获得如seqidno:3所示序列的dna片段，利用kpni/bamhi和saci/spei酶切位点克隆到rnai载体pds1301(如图4所示)上，得到植物表达载体pds1301-oscpk24(见图5)，转入水稻品种“日本晴”中。
(3)水稻的遗传转化
上述步骤(1)和(2)中的水稻转化均采用农杆菌eha105介导的遗传转化法，农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”报道的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28：294-300)。具体步骤如下：
①愈伤组织诱导。将成熟的“日本晴”水稻种子(中国农业科学院作物科学研究所)去壳，然后依次用70％浓度的的乙醇溶液处理1min，0.15％氯化汞(hgcl2)溶液处理15min，灭菌水清洗4-5次后将种子转移到愈伤组织诱导培养基上。将接种后的培养基于暗培养4周，培养温度26℃左右。
②愈伤组织继代。挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于愈伤组织继代培养基上暗培养2周，培养温度26℃左右。
③预培养。挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上暗培养2周，培养温度26℃左右。
④农杆菌培养。首先在带有对应抗性选择的la培养基(la培养基的配制参照j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌eha105(该菌株来自cambia公司公开使用的农杆菌菌株)2d，培养温度28℃；随后，将农杆菌转移至悬浮培养基中，28℃摇床上培养2-3h。
⑤农杆菌侵染。首先调节农杆菌悬浮液至od600值为0.8-1.0，随后将预培养的愈伤转移至农杆菌悬浮液中浸泡30min，将愈伤转移至灭菌好的滤纸上吸干，然后放置在共培养基上培养3d，培养温度19-20℃。
⑥愈伤组织洗涤和选择培养。灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400mg/lcn的灭菌水中30min；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤组织至含有400mg/l羧苄青霉素(cn)和50mg/l潮霉素(hn)的选择培养基上进行第一次选择培养，培养时间为2周；随后挑出没有被农杆菌污染的愈伤组织转至含有250mg/l羧苄青霉素(cn)和50mg/l潮霉素(hn)的选择培养基上进行第二次选择培养，同样培养2周；再次挑取没有被农杆菌污染的愈伤组织转至只含有50mg/l潮霉素(hn)的选择培养基上进行第三次选择培养，直至长出嫩黄抗性愈伤组织为止。
⑦愈伤组织的分化。将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7d；再转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，在光照(1500-2000lx)培养30-40d，培养温度为26℃。
⑧生根。剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中在光照(1500-2000lx)培养2-3周，培养温度为26℃。
遗传转化中所用到的培养基配方如下：
①愈伤组织诱导培养基
加蒸馏水至900ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.9；煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
②愈伤组织继代培养基
加蒸馏水至900ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
③预培养基
加蒸馏水至250ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
④共培养基
加蒸馏水至250ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
⑤悬浮培养基
加蒸馏水至100ml，用1n氢氧化钾调培养基的ph值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100μlas贮存液。
⑥选择培养基
加蒸馏水至250ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μlhn(50mg/ml)和400μlcn(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次选择培养基中羧苄青霉素浓度为400mg/l，第二次及以后选择培养基中羧苄青霉素浓度为250mg/l)。
⑦分化培养基
加蒸馏水至900ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至6.0。煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
⑧生根培养基
加蒸馏水至900ml，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.8。煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管左右)，封口，按上述方法灭菌。
主要溶液配方：
①n6max母液(按照10×浓缩液配制)：
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。
②n6min母液(按照100×浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
③铁盐(fe2+edta)贮存液(按照100×(倍)浓缩液配制)
将3.73g乙二铵四乙酸二钠(na2edta·2h2o)和2.78gfeso4·7h2o分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2h，4℃保存备用。
④维生素贮存液(按照100×浓缩液配制)
加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。
⑤msmax母液(按照10×浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。
⑥msmin母液(按照100×浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。
⑦2,4-d贮存液(1mg/ml)的配制：
称取2,4-d100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。
⑧6-ba贮存液(1mg/ml)的配制：
称取6-ba100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
⑨萘乙酸(naa)贮存液(1mg/ml)的配制：
称取naa100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
⑩吲哚乙酸(iaa)贮存液(1mg/ml)的配制：
称取iaa100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
称取as0.392g，加入dmso10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
试剂和溶液缩写：
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；cn(carbenicillin，羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量元素成分溶液)；n6mix(n6微量元素成分溶液)；msmax(ms大量元素成分溶液)；msmix(ms微量元素成分溶液)。
(4)移栽、表达量鉴定和表型分析
将生根的转基因植株每个遗传系构建50个家系，然后将其移栽至温室中培养，从转基因家系植株上取叶片做realtime-pcr表达量鉴定。各选取3个超表达和抑制表达遗传系进行冷胁迫分析，选取遗传家系中oscpk24的相对表达量结果如图6所示。
冷胁迫条件为10℃处理5d后，再4℃处理12d。结果表明：图7中的a图为冷胁迫前超表达转基因系的表型，图7中的b图为冷胁迫前抑制表达转基因系的表型；图7中的c图为冷胁迫后超表达转基因系的表型，图7中的d图为冷胁迫后抑制表达转基因系的表型。
胁迫后植株存活率的统计结果如图8所示。
(5)本发明的有益效果
1)本发明将oscpk24全长cds克隆到pcambia1300s上，转入“日本晴”中，所获得的转基因株系均表现为冷胁迫下存活率比野生型高(图8)。表明oscpk24基因具有调控水稻耐冷性的功能。
2)本发明将oscpk24(1238-1376bp)序列克隆到rnai载体pds1301上，在水稻“日本晴”中做rnai(rnainterference)实验，结果成功被rnai的转基因水稻在冷胁迫下存活率低于野生型(图8)。
3)本发明通过获得的多个独立p1300s-oscpk24和pds1301-oscpk24转基因株系的表型和表达量分析，表明oscpk24基因的表达量与水稻的耐冷性强弱相关。
sequencelisting
<110>华中农业大学
<120>一种控制水稻耐冷性的基因及其应用
<130>
<141>2017-01-04
<160>3
<170>patentinversion3.1
<210>1
<211>1542
<212>dna
<213>水稻（oryzasativa）
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1542)
<223>
<220>
<221>cds
<222>(1)..(1542)
<223>
<400>1
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lysalalysleualaproproprovalthralaalaglyglyargpro
202530
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