本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用藤仓赤霉菌渣生产赤霉素GA3的方法。
背景技术：
赤霉素(Gibberellins，简称GAs)，又称九二零，是一种天然的植物生长调节剂。赤霉素属于生物体内的一类四环二萜类化合物，至今已发现100多种。常见具有生物活性的主要有赤霉素GA1、GA3、GA4、GA7等，赤霉素与生长素(auxin)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)以及油菜素甾醇(BR)并列为植物六大激素。赤霉素主要对植物生长具有多种生理功能，可以调节植物生根、发芽、生长以及开花结果等过程，因此赤霉素在农业生产和酿造业中有着广泛的应用。其中赤霉素GA3是应用最为广泛的赤霉素之一。
目前赤霉素GA3的工业化生产主要通过藤仓赤霉液体发酵。由于赤霉素GA3是胞外产物，赤霉素GA3提纯过程产生大量藤仓赤霉菌渣。该菌渣主要以固体废弃物的形式丢弃，造成了资源浪费与环境污染。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用藤仓赤霉菌渣生产赤霉素GA3的方法，解决废弃藤仓赤霉菌渣难以处理、赤霉素GA3生产成本较高的问题。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种利用藤仓赤霉菌渣生产赤霉素GA3的方法，包括采用藤仓赤霉菌渣酶解物作为藤仓赤霉发酵培养中氮源的步骤，所述藤仓赤霉菌渣酶解物是将藤仓赤霉菌渣干燥、粉碎、酶解后得到的。
在本发明中，发酵培养中的培养基包括如下成分：葡萄糖75～85g/L，脱脂豆粕2.0～6.0g/L，藤仓赤霉菌渣酶解物4.0～8.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g/L，KH2PO4 1.0～2.0g/L，NaMoO4·2H2O 0.03～0.06g/L，微量元素溶液1～2ml，pH为5.5～6.5；微量元素溶液是含有下述成分的水溶液：H3BO3 290～310mg/L，MnCl2·4H2O 90～110mg/L，ZnSO4·7H2O 90～110mg/L，FeCl3·6H2O 190～210mg/L，CuCl2·2H2O 480～520mg/L；所述培养基中藤仓赤霉菌渣酶解物4.0～8.0g/L是指藤仓赤霉菌渣酶解物中干物质浓度为4.0～8.0g/L。
在本发明中，藤仓赤霉菌渣干燥、粉碎后，采用30～100目标准筛筛分，取筛下物进行酶解。
在本发明中，所述酶解步骤中采用的酶为溶菌酶、纤维素酶和碱性蛋白酶。
在本发明中，酶解步骤具体如下：在藤仓赤霉菌渣中加入其质量4～6倍的水，调节pH至4.0～5.0，加入菌渣质量1％～10％的纤维素酶和1％～10％的溶菌酶，在50～60℃条件下酶解3～5h；调节溶液的pH为9.0～10.0，加入菌渣质量1％～10％的碱性蛋白酶，在50～60℃酶解1～3h，得到藤仓赤霉菌渣酶解物。
在本发明中，所述干燥过程中的温度为60～70℃，干燥后菌渣的含水量为5％～10％。
在本发明中，所述发酵培养过程中的温度为24～30℃，发酵培养时间为7～10天。
赤霉素GA3分析方法：仪器：Dionex U3000型高效液相色谱仪，采用Venusil MPC18柱(Ageia Technologies，填料粒径5μm)。流动相：甲醇、水和磷酸的混合物(体积比为68：32：0.05；此处磷酸为浓磷酸，质量百分浓度为85％)，流速：1.0ml/min，检测波长：210nm，进样量：10μL。样品溶液的配置：发酵液用NaOH溶液调节pH值在7.0-7.2之间，30min不变；过滤，准确吸取滤液4.0ml于25ml容量瓶中以流动相稀释至刻度，然后离心取上清，用0.45μm滤膜过滤，以备进样检测。
本发明所用培养基的溶剂未明确标示时均为水。发酵液pH调节方式：用1mol/L的盐酸或3mol/L的氢氧化钠调节pH。
通过研究发现，藤仓赤霉菌渣中含有丰富的营养物质，如氮源、碳源、无机盐等，可以作为发酵培养基成份代替部分原发酵培养基中成份。在此基础上，将废弃藤仓赤霉菌渣处理后，代替原培养基成份中的氮源，采用发酵方法生产赤霉素GA3，不仅提高了目标产物的产量，而且解决了菌渣丢弃造成的资源浪费、环境污染问题，减少了原料成本，提高生产效益，具有很好地应用前景，对我国赤霉素GA3工业化生产具有一定的积极作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1藤仓赤霉菌渣酶解物制备过程
(1)采用藤仓赤霉菌978液体发酵生产赤霉素GA3
采用藤仓赤霉菌978液体发酵生产赤霉素GA3的具体方法如下：将藤仓赤霉978接种到试管斜面PDA培养基中，在28℃条件下静置培养3～4天。用20mL无菌水洗下孢子，将孢子悬浮液按照接种量为5％转接至种子培养基，在28℃、摇床转速180rpm条件下培养36h，获得种子液。按照接种量为5％将种子液转接至发酵培养基，在28℃、摇床转速180rpm条件下培养7天。发酵结束后，检测发现发酵液中菌体干重17g/L，GA3含量2080mg/L。
PDA培养基含有马铃薯块200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。
种子培养基含有葡萄糖30g/L，酵母膏5.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，微量元素溶液1ml，pH为6.0。
发酵培养基含有葡萄糖80g/L，脱脂豆粕(招远市温记食品有限公司)10g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，微量元素溶液1ml，pH为6.0。
微量元素溶液是含有下述成分的水溶液(mg/L)：H3BO3 300，MnCl2·4H2O 100，ZnSO4·7H2O 100，FeCl3·6H2O 200，CuCl2·2H2O 500。微量元素溶液配制方法如下：称取各成分，加入少量水，然后滴加盐酸直至溶液澄清，定容至需要的体积。
(2)制备藤仓赤霉菌渣酶解物
将藤仓赤霉978液体发酵结束后的发酵液，经过板框过虑后得到藤仓赤霉菌渣。将藤仓赤霉菌渣置65℃条件下干燥至含水量为8％，利用粉碎机粉碎，然后分别过60、70、80、90、100目不同孔径的标准筛，取筛下部分，分别得到不同粒径的菌渣。采用如下方法对不同粒径菌渣进行酶解：在菌渣中加入其质量5倍的水，调节pH至4.5，加入菌渣质量3％的纤维素酶(国药集团、产品编号64001132)和3％的溶菌酶(国药集团、产品编号64006060)，在55℃、摇床转速170r/min条件下酶解4h；调节溶液的pH为9.5，加入菌渣质量3％的碱性蛋白酶(国药集团、产品编号64019960)，在55℃、摇床转速170r/min下酶解2h，得到藤仓赤霉菌渣酶解物(缩写为藤仓赤霉酶解物)。由60、70、80、90、100目标准筛筛下物制成的酶解物依次命名为藤仓赤霉酶解物A、B、C、D、E。将各藤仓赤霉酶解物在50℃条件下烘干，计算其干物质含量。
实施例2藤仓赤霉酶解物对发酵生产赤霉素GA3的影响
将藤仓赤霉978接种到试管斜面PDA培养基(同实施例1)中，在28℃条件下静置培养3～4天。用20mL无菌水洗下孢子，将孢子悬浮液按照接种量为5％转接至种子培养基(同实施例1)，在28℃、摇床转速180rpm条件下培养36h，获得种子液。按照接种量为5％将种子液转接至发酵培养基，在28℃、摇床转速180rpm条件下培养7天。发酵培养基的配方同实施例1，不同之处在于将脱脂豆粕的40％替换为藤仓赤霉酶解物。将脱脂豆粕的40％替换为藤仓赤霉酶解物的意思是，新培养基中藤仓赤霉酶解物干物质终浓度为原培养基中脱脂豆粕浓度的40％，脱脂豆粕浓度为原培养基中的60％。分别以藤仓赤霉酶解物A、B、C、D、E替换实施例1中脱脂豆粕的40％，以考察不同酶解物对发酵生产赤霉素GA3的影响。此处原培养基是指实施例1中发酵培养基。
发酵结束后，检测不同培养条件下获得的发酵液中菌体干重和赤霉素GA3的含量。结果如表1，可知藤仓赤霉酶解物D替代40％脱脂豆粕进行发酵，得到的GA3产量最高，可达2100mg/L。
表1不同藤仓赤霉酶解物发酵产赤霉素GA3的产量
实施例3藤仓赤霉酶解物不同替换比例对发酵的影响
将藤仓赤霉978接种到试管斜面PDA培养基(同实施例1)中，28℃培养3～4天。用20mL无菌水洗下孢子，将孢子悬浮液按照接种量为5％转接至种子培养基(同实施例1)，在28℃、摇床转速为180rpm条件下培养36h，获得种子液。按照接种量为5％将种子液转接至发酵培养基，在28℃、摇床转速为180rpm条件下培养时间7天，考察藤仓赤霉酶解物D(实施例1制备)替换实施例1发酵培养基中脱脂豆粕的不同比例对发酵结果的影响，发酵培养基中其他成分及含量同实施例1。替换比例X分别设为0％、20％、40％、60％、80％、100％，即新培养基中脱脂豆粕浓度＝原培养基中脱脂豆粕浓度*(100％-X)，藤仓赤霉酶解物的干物质终浓度＝原培养基中脱脂豆粕浓度*X。此处原培养基是指实施例1中发酵培养基。
发酵结束后，利用HPLC检测不同培养条件下获得的发酵液中菌体干重和赤霉素GA3的含量。结果如表2，可知在替换比例为80％时，GA3产量最高，可达2200mg/L，与对照(替换比例为0)相比有小幅的提升，同时根据菌体生物量分析，藤仓赤霉酶解物D替换后几乎不影响菌体生长。
表2藤仓赤霉菌酶解物D不同替换比例下GA3的产量
实施例4发酵罐放大验证
将藤仓赤霉978接种到试管斜面PDA培养基(同实施例1)中，28℃培养3～4天。用20mL无菌水洗下孢子，将孢子悬浮液按照接种量为5％转接至种子培养基(同实施例1)，在28℃、180rpm条件下培养36h，获得种子液。发酵罐内培养基是将实施例1中发酵培养基中脱脂豆粕的90％替换为藤仓赤霉酶解物D后获得的，其他成分及含量同实施例1中发酵培养基。按照接种量为5％将种子液转接至7.5L发酵罐，在28℃、搅拌转速180rpm、通气量为1VVM条件下培养7天。
发酵结束后，利用HPLC检测发酵液中细胞干重和赤霉素GA3的含量。发酵结果：细胞干重(DCW)21g/L，GA3含量2250mg/L。本实施例说明本发明工艺稳定有效，具有良好的工业应用前景。