本发明涉及化合物提取分离领域，特别涉及吴茱萸中新喹诺酮类生物碱及其制备方法、应用和药物组合物。
背景技术：
吴茱萸（Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.），别名吴萸、茶辣、漆辣子、臭辣子树、左力纯幽子、米辣子等。通常分大花吴茱萸、中花吴茱萸和小花吴茱萸等几个品种。小乔木或灌木，高3-5米，嫩枝暗紫红色，与嫩芽同被灰黄或红锈色绒毛，或疏短毛。生于平地至海拔1500米山地疏林或灌木丛中，多见于向阳坡地。各地有小或大量栽种。嫩果经泡制凉干后即是传统中药吴茱萸，简称吴萸，是苦味健胃剂和镇痛剂，又作驱蛔虫药。其性热味苦辛，有散寒止痛、降逆止呕之功，用于治疗肝胃虚寒、阴浊上逆所致的头痛或胃脘疼痛等症。
随着我国老龄化社会进程的加快，老年人口数量不断增加。据统计，截止至2020年，我国老龄化水平将达到17.17％，各种老年病患者人数也呈上升趋势。在发达国家，老年痴呆症作为最常见的神经退行性疾病，分别成为了仅次于心血管病、癌症的第三、四大死亡杀手。而我国神经退行性疾病患者的人数，已位居世界各国之首。目前尚未有防治神经退行性疾病的特效药物可供选择，因此开发出具有靶向性，副作用小，能有效控制并逆转病情的药物势在必行。我国中药资源丰富，毒副作用小，从中药中寻找新型神经退行性疾病治疗药物是新药开发研究的重要途径之一。但是中药成分复杂，有效成分不明确，疗效不稳定，作用机理不清楚，严重影响了临床上的使用以及中药进入国际主流市场，因此从传统药物的天然资源中寻找构型、机制明确的特效神经退行性疾病治疗药物是医药科研工作者今后相当长时间内的迫切任务。
技术实现要素：
吴茱萸95 % 乙醇提取物具治疗神经退行性疾病的作用，从有效部位中分离得到1个新喹诺酮类生物碱，药效学评价显示其具有很好的神经保护的作用。
本发明的目的之一在于提供一种吴茱萸中新喹诺酮类生物碱。
本发明的目的之二在于提供了一种吴茱萸中新喹诺酮类生物碱的制备方法。
本发明的目的之三在于提供了一种吴茱萸中新喹诺酮类生物碱在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种药物组合物，含有吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物1。
本发明是通过以下技术方案实现的：吴茱萸中新喹诺酮类生物碱，具有化合物1所示结构
1。
吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 的制备方法，每制备化合物1,10mg，包括如下步骤：
a. 吴茱萸药材10 kg，用 90% 乙醇回流提取 3 次，每次 2h，合并提取液减压浓缩得浸膏 (800g)；
b. 将该浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、正丁醇多次萃取，分别减压回收溶剂。依次得到各萃取物 32、200、320 g；
c. 三氯甲烷萃取物200g经过硅胶 (200-300目，3 kg) 柱色谱粗分，CHCl3/CH3COCH3(100:1→1:100) 梯度洗脱, 每个流份 2000 ml, 共收集 167个流分，之后将167个流份通过TLC薄层检识合并得到 5个流Fr (1-5)；
d. Fr.3 (30 g) 经开放ODS柱色谱 (MeOH:H2O, 40:20-90:10) 洗脱, 检识合并后得到Fr.A及Fr.B两部分。Fr.B在经硅胶柱色谱 (乙酸乙酯:甲醇，20:1-1:1) 洗脱得到Fr.B1-B7；
e. Fr.B7经硅胶柱色谱(C:M, 20:1-1:1) 洗脱所得Fr.7a3部分经过反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20纯化后再经pHPLC (60% MeOH:H2O) 得新喹诺酮类生物碱类化合物1（10mg）。
吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。所述神经退行性疾病为脑卒中、痴呆、神经炎症、重金属中毒、神经毒剂中毒。所述痴呆为早老性痴呆或血管性痴呆。
一种药物组合物，其中，含有吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1以及药效学上可接受的载体。
根据本发明的思路，对吴茱萸中新喹诺酮类生物碱类化合物进行了神经保护相关的药理实验。氧化应激是导致神经元凋亡丢失的重要原因，是神经退行性疾病的共性特征。引起氧化应激的原因有很多种，如脑缺血，神经炎症，兴奋性递质释放重摄取机制障碍，重金属暴露，神经毒性剂暴露等，表现为细胞内自由基增加，引起脂质过氧化，线粒体功能障碍继而激活凋亡通路等。谷氨酸，硝普钠虽然引发神经元凋亡丢失的机制不一，但都是近年来许多国内外学者倡导的神经元损伤模型的诱发剂。研究认为，脑内兴奋性递质谷氨酸过量通常引起神经元膜上NMDA 受体过度激活，从而导致神经元发生氧化应激并丢失，而硝普钠是一种NO 的供体，NO 可传递氧自由基透过线粒体膜，使线粒体功能失调继而发生凋亡，其发生机制，病理生理改变与临床老年痴呆患者脑内表现具有相似性。应用谷氨酸，硝普钠制作神经元损伤模型条件要求低，技术易于掌握，可靠性强，重复性好，因此在本研究中，采用谷氨酸过载，硝普钠 (SNP) 暴露制作神经元损伤模型。
本发明提供的一个吴茱萸新喹诺酮类生物碱在体外谷氨酸，硝普钠诱发的大鼠大脑皮层神经元死亡的试验中均显示出优良的神经保护作用。
阳性对照药物为依达拉奉 (edaravone)，依达拉奉是以自由基清除为主要作用机制的新型抗老年痴呆药物，能有效抑制因脑缺血导致的脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化应激损伤。
对硝普钠诱发大鼠大脑皮层神经元凋亡的保护作用体外研究中，将本发明化合物与硝普钠(350 μM) 用神经元培养基稀释，和大鼠大脑皮层神经元温孵24 小时后，MTT 法测定细胞存活率，同时进行正常对照组和阳性对照组试验。实验结果表明，正常对照组加入硝普钠后570 nm 处吸光度值(OD570) 明显降低，阳性对照组和本发明化合物OD570 明显回升，与依达拉奉(edaravone) 的细胞存活率相当，部分新化合物的细胞存活率比依达拉奉高。
因此本发明有益效果：吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1可用于制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物。优选的神经退行性疾病选自脑卒中、痴呆、神经炎症、重金属中毒、神经毒剂中毒。优选的痴呆选自早老性痴呆、血管性痴呆。
附图说明
图1 吴茱萸的提取分离流程图。
具体实施方式
下面的实施例及药理活性实验进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1：吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1的制备方法，包括如下步骤：
吴茱萸药材10 kg，用 90% 乙醇回流提取 3 次，每次 2h，合并提取液减压浓缩得浸膏 (800g)。将该浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、正丁醇多次萃取，分别减压回收溶剂。依次得到各萃取物 32、200、320 g。三氯甲烷萃取物200g经过硅胶 (200-300目，3 kg) 柱色谱粗分，CHCl3/CH3COCH3 (100:1→1:100) 梯度洗脱, 每个流份 2000 ml, 共收集 167个流分，之后将167个流份通过TLC薄层检识合并得到 5个流Fr (1-5)；Fr.3 (30 g) 经开放ODS柱色谱 (MeOH:H2O, 40:20-90:10) 洗脱, 检识合并后得到Fr.A及Fr.B两部分。Fr.B在经硅胶柱色谱 (乙酸乙酯:甲醇，20:1-1:1) 洗脱得到Fr.B1-B7。Fr.B7经硅胶柱色谱(C:M, 20:1-1:1) 洗脱所得Fr.7a3部分经过反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20纯化后再经pHPLC (60% MeOH:H2O) 得新喹诺酮类化合物1（10mg）。
实施例2：吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。所述神经退行性疾病为脑卒中、痴呆、神经炎症、重金属中毒、神经毒剂中毒。所述痴呆为早老性痴呆或血管性痴呆。
吴茱萸新喹诺酮类生物碱类化合物的理化、波谱数据如下:
黄色油状，ESI-MS m/z 256 [M + H]+。1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 和13C-NMR(CDCl3，125 MHz）数据见下表
表1 化合物1 的1H 和13C-NMR 数据(CDCl3，J in Hz)
a The signals were overlapped.
药理实验
试验材料1、受试药：本发明单体化合物。2、阳性对照药：依达拉奉，由中国食品药品检定研究院提供。HPLC 检测纯度 ＞ 98 ％。3、细胞：出生当天大鼠大脑皮层神经元。4、培养基：DMEM，FBS，美国 Gibco 公司生产；ES，美国 Hyclone 公司生产。5、硝普钠由中国食品药品检定研究院提供，谷氨酸由北京化工厂提供。
实验例1：本发明化合物对大鼠大脑皮层神经元存活状态的影响以及在硝普钠诱发的神经元凋亡模型中的保护作用
化合物对神经元存活状态的影响研究中，将原代培养大鼠皮层神经元(DIV-9) 分为对照组和给药组(10 μM)，n = 6 ；在化合物对硝普钠诱发神经元凋亡模型的保护作用研究中，将原代培养大鼠皮层神经元(DIV-7) 分为对照组，硝普钠(350 μM) 造模组，硝普钠 (350 μM) + 依达拉奉(100 μM) 给药组，硝普钠(350 μM) + 化合物(10 μM) 给药组，n = 6。给药后，细胞置于细胞孵箱中继续培养24 小时，MTT 法(570 nm) 测定细胞存活率。以对照组吸光度为标准，计算各组吸光度与对照组的比值。
表2化合物对大鼠皮层神经元存活状态的影响
表3化合物对硝普钠和谷氨酸诱发大鼠皮层神经元凋亡的作用效果
注：* p<0.05 vs mod，** p<0.01 vs mod，*** p<0.001vs mod，## P ＜ 0.01vs control.
实验结果表明：对已经鉴定的本发明化合物进了初步的细胞模型筛选，本发明化合物体现了神经保护活性，即在硝普钠损伤原代神经元模型和谷氨酸诱导原代神经元毒性模型中均具有良好的神经保护活性。其对硝普钠诱发大鼠皮层神经元凋亡的保护作用效果活性优于依达拉奉。
实施例3：一种药物组合物，含有吴茱萸中新喹诺酮类生物碱化合物 1以及药效学上可接受的载体。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95 重量％。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂( 包括o/w 型、w/o 型和复乳)、混悬剂、注射剂( 包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂( 包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂( 包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气( 粉) 雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH 调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β- 环糊精等；pH 调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg 体重，优选为0.1-100mg/Kg 体重，更优选为1-60mg/Kg 体重，最优选为2-30mg/Kg 体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。