本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体涉及一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。
背景技术：
狭旋毛壳属于子囊菌门毛壳属真菌，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够应用于植物病害的防治。可皆霉素(Cochliodinol，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0)仅在毛壳属（Chaetomium globosum,C. cochliodes）中分离得到，其结构式为：
。
Brewerr的科研团队发现，在1-10μg/ml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌Botrytis allii 和 Fusarirm moniliforme孢子的萌发，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长；同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长，而镰刀菌可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的病害之一。由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。另外，Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53 μM、2.20μM。
综上所述，可皆霉素具有多种生物活性，但由于合成成本高，得率低，无法获得大量纯品，难以进行更深入研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种生产成本低、产量高的利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；
（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70 g大米，100 ml水；培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121℃下高压灭菌40分钟；
（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；
（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。
步骤（1）所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳(Chaetomium angustispirale) CLC001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2016年4 月28 日，保藏号为CCTCC NO：M 2016231。该菌在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素。该菌的18S rDNA如序列表所示，即
CGTGGGTCTTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAACCCGCAGCACGCCCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGTGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTTTCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTAACAAGAGTTTGGTGACCTCCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCAACGGTTTAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCTACGGAAG。
所述步骤（4）中上柱分离的具体步骤如下：用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:（2～4）的流份，30～40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇体积比为1：1混合溶剂溶解，经Sephadex LH-20层析，流动相二氯甲烷－甲醇体积比为1：1，得可皆霉素。
所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1。
所述步骤（3）中将发酵物用乙酸乙酯浸取时的工艺条件如下：加入乙酸乙酯，20～25℃下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并提取液。
所述步骤（4）中将乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。
本发明产生的有益效果是：本发明中提供的狭旋毛壳(Chaetomium angustispirale) CLC001可在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素；本发明的提取方法简单易行，相对于其它培养基，该方法成本更低，并具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种（保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCC NO：M 2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心）接种到90 mm平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；
（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种用手术刀片将其分为12份，取一份接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：60 g大米，100 ml水；培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121℃下高压灭菌40分钟；
（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取（加入乙酸乙酯300 ml，20～25℃下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并三次的提取液），得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；通过HPLC检测，可皆霉素在乙酸乙酯提取物中的含量为68.90%；
（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱（乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2），固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱(二氯甲烷－甲醇体积比为100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，硅胶薄层层析，紫外254 nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:2和100:4的流份，40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇体积比为1：1的混合溶剂溶解，经Sephadex LH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析，流动相二氯甲烷－甲醇体积比为1：1，得纯品可皆霉素400mg（纯度为98.3%）。
本实施例制备得到的可皆霉素的结构鉴定如下：
【性状】紫色粉末
【鉴定】分子式：C32H30N2O4, 分子量：506.2206
仪器设备：Agilent 1100液相色谱仪, 1H, 13C NMR 图谱由 Bruker am-400 MHz 核磁共振仪测定(TMS为内标),质谱由Agilent 6490 型质谱仪测定。
利用ESI-MS，1H NMR和13C NMR试验，标准数据如下：ESI-MS m/z: 505.2124 [M-H]+; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.41 (1H, s, 2,5-OH), 8.13 (1H, s, 1-NH), 7.60 (1H, s, H-2), 7.44 (1H, s, H-4), 7.34 (1H, d, J = 8.4, H-7),7.08 (1H, d, J = 8.4, H-6), 5.40 (1H, m, H-11), 3.46 (1H, m, H-10), 1.75 (3H, s, 13-CH3), 1.74 (1H, s, 14-CH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ:134.4 (C-8), 133.9 (C-5), 131.7 (C-12), 127.2 (C-2), 126.3 (C-9), 124.5 (C-11), 123.6 (C-6), 120.9 (C-4), 111.1 (C-7), 110.8 (C-3, C-6), 104.4 (C-3), 34.7 (C-10), 25.8 (C-14), 17.9 (C-13).
利用TLC，在UV 254nm呈强荧光；以硫酸显色剂，110℃下15秒钟，呈现棕色。
【含量测定】利用HPLC，色谱条件：Sepax GP-C18 5μm（250mm×4.6mm）色谱柱。流动相：乙腈︰水︰甲酸为10︰90︰0.1；流速：1.25 mL/min，检测波长254nm，保留时间值9.45 min。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 黄河科技学院
<120> 一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> Chaetomium angustispirale
<400> 1
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cactgctttt cagggcctgc ggcagccgca ggtccccaac acaagcccgg gggcttgatg 180
gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc 240
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cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgacttat tcagtacaga 360
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tacggaag 548