本发明属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术：
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2015年的766万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
面对这种局势，就需要进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
本发明的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由8对SSR标记组成。SSR标记是基于香菇全基因组测序后开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增引物，经过对不同香菇品种进行PCR扩增后获得的多态性标记。SSR标记具有扩增带型好，重复性高的特点。本发明对大量的SSR引物进行了筛选，获得了8对多态性高的引物，用这8对引物组合获得的图谱带型，检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。
表1SSR标记详细信息列表
本发明的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：
(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。
所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：
(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；
(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；
(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)缓冲液，使沉淀溶解；
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。
所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL；PCR扩增得到的产物点样量为3μL。
所述步骤(4)中的变性的具体工艺为：于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。
所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min。
所述步骤(4)中的银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化，在高通量试验中较为高效实用。
所述银染液的组成为1.5g AgNO3和1500ml H2O；显影液的组成为16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。
本发明的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的8对SSR引物，对扩增申香12号菌株的总DNA进行PCR扩增，申香12号菌种的扩增条带在收集的40份我国香菇主要栽培品种中具有专一性。表2为本发明使用的8对SSR引物在40份香菇品种中扩增出的所有等位片段的数量及编号(按照扩增片段从大到小编号，通过对照50bp ladder DNA marker确定各SSR引物扩增的各等位片段的相对分子量)。菌种申香12号使用这8对SSR引物的扩增片段在总等位片段中的编号组合为：(1+2)(2+4+5)(3)(1)(2+3)(1+4)(1+4)(1+2+3+4)，表3为菌种申香12号扩增片段组合的位置与大小。符合上述等位片段组合的菌种，即是香菇申香12号菌种。
表2SSR引物扩增的所有等位片段信息汇总表
表3菌种申香12号扩增的等位片段编号表
有益效果
本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4d，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国40个香菇主栽菌种中具有申香12号菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱，其中M是50bp DNA ladder，数字代表的是所用的8对SSR引物，箭头所指的是香菇申香12号菌种的稳定且特异的SSR等位片段组合。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到装有100ml马铃薯葡萄糖培养基PDB的三角瓶中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-5d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
a将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，间或轻摇混匀；
b12000rpm、4℃离心20min，取上清液；
c在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；
d在上述离心管中加入体积比为2∶1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
e在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；
f将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；
g加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
h加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
j将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果。
银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液(1.5g AgNO3和1500ml H2O)中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液(16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛)中，至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化，在高通量试验中较为高效实用。
采用8对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp ladder DNA marker可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到带型符合编号组合为：(1+2)(2+4+5)(3)(1)(2+3)(1+4)(1+4)(1+2+3+4)的菌种，即可确定该菌种为香菇申香12号菌种，如图1中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，需进行三次重复实验。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
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<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
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