本发明属于水生生物检测技术领域，尤其涉及一种珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法。
背景技术：
水生生物是全球生物多样性的重要组成部分，是近年来生物多样性保护的重点内容。相对于陆生动物，水生生物特殊的生存环境、生活习性及相对滞后的资源调查方法，使得众多水生物种缺少基础的生物学资料，如种群分布区、种群大小和种群动态等，这些信息的缺乏阻碍了水生生物保护生物学研究的开展，亟需一种新的资源监测方法以改变这一现状。随着分子生物学的发展，尤其是DNA分类技术的问世，一种新的水生生物监测方法-环境DNA(environmental DNA，eDNA)分析技术随之产生(Willerslev et al，2003)。从2003年初次应用以来，eDNA分析技术历经近十年的发展，已日臻成熟，成为水生生物资源调查研究的重要手段。
在已有的报道中，多数环境DNA研究以检测物种分布状况、密度等为目的(Taberlet et al，2012)，采取的试验方案多由个人的偏好、实验成本等因素决定，导致实验结果的不确定性增加，不同来源数据间的可比性较差(Wang et al，2013)。
近年来，通过比较不同的采样方法和DNA提取方法、不同的DNA提取与PCR扩增方法组合，不同的DNA提取与测序方法组合，分析不同操作方案是否显著影响检测结果的研究正在增加(Renshaw et al，2015；Turner et al，2014；Deiner et al，2015；Eichmiller et al，2016)，结果表明对于不同的物种和分析目的，采用不同的方法组合能够直接影响到物种的检出率或种群多样性的丰富度。
在进行濒临灭绝，种群数量稀少，分布密度极低的物种的资源调查过程中，试验方案的选择对于检测结果的影响的尤为显著：不完善的实验方案会增加检测结果的不确定性，一旦出现假阳性或假阴性的结果，都会将物种保护和管理措施的制定导向错误的方向，降低物种保护工作的效率和时效性。因此，制定高效、标准的环境DNA分析试验方案，产生可靠性高，可重复性好的检测结果，对于掌握濒危物种种群分布的准确数据，制定合理的物种保护策略具有重要的科学意义。
综上所述，现有技术的问题是：(1)在调查相同的目标物种时，不同的实验室采用差异化的水样eDNA分析流程(包括水样采集方法，采集量，水样eDNA提取方法及eDNA分析方法)，使得不同来源的检测结果难以进行数据比对和共享；(2)在进行濒临灭绝，种群数量稀少，分布密度极低的物种的资源调查过程中，现有水样环境DNA分析过程缺少对试验流程进行优化这一过程，而随意的实验方案，必然会造成的检测结果的不确定性和实验结果重复性差等问题，与物种保护的理念背道而驰。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法。
本发明是这样实现的，一种珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法，在进行水生物种野外分布流域水样分析前，首先进行养殖水样预检测；通过使用养殖水样，对eDNA分析流程进行优化和标准化；进一步通过对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选和优化，实现目标物种水样eDNA的流程标准化；为水生物种分布调查提供水样eDNA分析方法。
进一步，所述进一步通过对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选和优化中，对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选包括水样采集方法的筛选、水样采集量的比对、水样eDNA提取方法的比较和筛选；
对目标物种的水样eDNA分析流程的优化包括：水样eDNA分析的PCR反应体系和水样eDNA分析的PCR反应流程的反复优化。
进一步，一种珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法，具体包括以下步骤：
在栖息地周边建设物种养殖池塘；
养殖水样采集：利用无菌水样过滤装置，使用0.45μm孔径WCN硝酸纤维膜滤膜过滤养殖池水样，将滤膜取出，储存于95％的无水乙醇中，带回实验室，-20℃保存备用；
水样采集量：设计梯度水样采集量；
水样eDNA提取：将滤膜等分为两份，分别使用两种试剂盒提取水样eDNA；
物种特异性PCR引物设计及筛选：使用Primer premier 5.0软件设计引物；以物种组织样DNA为模板，筛选引物及选择退火温度48℃～60℃；
PCR反应体系和反应程序优化：eDNA的PCR反应体系为10μL～40μL，每个样品重复扩增3次～10次；筛选和优化适宜的反应体系和反应程序；
确定水样eDNA分析流程。
进一步，在栖息地周边建设的物种养殖池塘包括：
养殖用水使用井水或无目标物种分布的水流；
养殖密度与物种种群分布密度相当；
进水口流速与出水口流速与物种分布流域的水流速度相当。
进一步，所述设计梯度水样采集量中，水样采集量范围为1L～2L。
进一步，PCR反应体系和反应程序优化中，水样eDNA模板使用量为1μL-10μL，PCR反应程序参照各Taq酶的使用说明进行。
确定水样eDNA分析流程具体包括：
采集与目标物种分布流域理化性质相似的水样；
进行适宜的水样采集方法；
确定最佳的水样采集量；
建立适宜的水样eDNA提取方法；
选择物种特异性的PCR引物和最佳的引物退火温度；
确定高效的PCR反应体系和反应程序。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法的水样预检测系统。
对比现有水样eDNA分析技术，本发明在进行水生(半水生)物种野外分布流域水样分析前，增加了养殖水样预检测这一方案。通过创新性的提出使用养殖水样，使得eDNA分析流程的优化和标准化成为可能；进一步通过对目标物种的水样eDNA分析流程的各个技术环节的逐一筛选和优化，包括水样采集方法的筛选，水样采集量的比对，水样eDNA提取方法的比较和筛选，水样eDNA分析的PCR反应体系和反应流程的反复优化，实现了目标物种水样eDNA的流程优化和标准化。通过对现有技术的改良和优化，为水生(本水生)物种分布调查提供了物种覆盖范围广泛、重复性好、切实可行的水样eDNA分析新思路和方法。
本发明与现有技术相比较，该发明具有以下几个方面的优势和效果：与实验室、水族缸的水样相比较，本技术使用栖息地周边建设的养殖池的水样，这些水样在理化性质方面与物种栖息地水流的相似性更高，因此以利用养殖池水样模拟栖息地水样，进行目标物种的eDNA分析流程优化，确立的操作流程的可靠性和实用性更强。
本发明通过对水样采集方法、水样采集量，水样eDNA提取方法、PCR扩增体系和扩增流程等成套技术流程的依次优化和标准化，构建一套完整、高效、操作性强的针对目标物种的水样eDNA分析流程，能够有效的提高水生(半水生)物种种群分布调查的工作效率，降低工作消耗，同时保证了调查结果的可靠性和可重复性，实现不同来源数据的共享和兼容。
附图说明
图1是本发明实施例提供的珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法，在进行水生物种野外分布流域水样分析前，首先进行养殖水样预检测；通过使用养殖水样，对eDNA分析流程进行优化和标准化；进一步通过对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选和优化，实现目标物种水样eDNA的流程标准化；为水生物种分布调查提供水样eDNA分析方法。
所述进一步通过对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选和优化中，对目标物种的水样eDNA分析流程的各个环节的逐一筛选包括水样采集方法的筛选、水样采集量的比对、水样eDNA提取方法的比较和筛选；
对目标物种的水样eDNA分析流程的优化包括：水样eDNA分析的PCR反应体系和水样eDNA分析的PCR反应流程的反复优化。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的珍稀水生生物水样环境DNA优化-养殖水样预检测方法，具体包括以下步骤：
S101：在栖息地周边建设的物种养殖池塘：①养殖用水使用井水或无目标物种分布的水流；②养殖密度与物种种群分布密度相当；③进水口流速与出水口流速与物种分布流域的水流速度相当。
S102：养殖水样采集：利用无菌水样过滤装置，使用0.45μm孔径WCN硝酸纤维膜滤膜过滤养殖池水样，将滤膜取出，储存于95％的无水乙醇中，带回实验室，-20℃保存备用。
S103：水样采集量：设计梯度水样采集量，范围一般在1～2L。
S104：水样eDNA提取：将滤膜等分为两份，分别使用两种试剂盒提取水样eDNA。按照试剂盒说明书进行操作。
S105：物种特异性PCR引物设计及筛选：使用Primer premier 5.0软件设计引物。以物种组织样DNA为模板，筛选引物及选择退火温度48℃～60℃。
S106：PCR反应体系和反应程序优化，一般eDNA的PCR反应体系为10-40μL，其中水样eDNA模板使用量在1-10μL之间，PCR反应程序参照各Taq酶的产品使用说明，每个样品重复扩增3-10次。通过反复试验，筛选和优化适宜的反应体系和反应程序。
S107：确定一套完整、高效及标准化的水样eDNA分析流程。
本发明通过对水样采集方法、水样采集量，水样eDNA提取方法、PCR扩增体系和扩增流程等成套技术流程的依次优化和标准化，构建一套完整、高效、操作性强的针对目标物种的水样eDNA分析流程，能够有效的提高水生(半水生)物种种群分布调查的工作效率，降低工作消耗，同时保证了调查结果的可靠性和可重复性，实现不同来源数据的共享和兼容。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。