本发明属于生物能源利用领域，特别涉及一种混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法。
背景技术：
纤维素酶在纺织业、饲料业、酿造、食品加工及开发新能源等方面有着良好的应用前景。近年来，随着能源问题的日益严峻，利用纤维素酶降解秸秆原料生产纤维燃料乙醇等新型能源的命题更是提到了日程上来，但价格偏高却阻碍了其广泛应用。因此生产高效低价的纤维素酶对于最终解决人类所面临的能源紧缺问题具有划时代的意义。
纤维素酶来源非常广泛，细菌、放线菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的降解能力也大不相同。放线菌的纤维素酶产量极低，研究极少。细菌的产量也不高，且主要是内切葡聚糖酶，另外，所产生的酶是胞内酶或吸附于细胞壁上，增加提纯难度，很少在工业上用。而丝状真菌具有产酶的诸多优点：产生的纤维素酶为胞外酶，便于提取；产酶效率高，酶系较合理等。目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种大多都是丝状真菌，比较典型的有木霉属(trichodema)、曲霉属(aspergillus)和青霉属(penicillium)，其中里氏木霉因其产酶活力高、酶系完全、生长环境粗放、酶易提取且菌株安全无毒等特点成为最具有工业应用价值的纤维素酶生产菌。
纤维素酶是一种多组分的复合酶，通常包括内切型-β-葡聚糖酶(cx酶)、外切型-β-葡聚糖酶(c1酶)和β-葡萄糖苷酶(cb酶)。在将天然纤维素水解成葡萄糖时,必须依靠上述3种组分的协同作用才能完成：外切酶(纤维二糖水解酶)可以水解纤维素结晶区，(cbhi)从纤维素链的还原端或(cbhii)非还原端开始持续水解，释放纤维二糖；内切酶主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链中的糖苷键，把纤维素长链切断，转化成为大量不同聚合度的纤维素短链，使得纤维素分子的聚合度降低，可供外切酶作用的纤维素链末端数增加；β-葡萄糖苷酶则主要水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖，最终将纤维素转化为可利用的葡萄糖。
单一菌株发酵存在酶活低、酶系组分不完全的缺点，这些都会严重影响到酶解效率，提高纤维素酶活力以及改善酶系组成的研究现在非常活跃，提出的方法很多：通过基因工程构建多基因菌株同时表达多种酶组分，但成本高、耗时长；比较而言，混菌发酵则不失为一种最简单有效的方法。混菌发酵过程中混菌间互利共栖，使酶系比例协调，避免发酵过程中某一中间产物大量积累产生反馈抑制，使得混菌发酵产酶能力大大高于单一菌株，提高了产率。cn101100660a提出了一种利用康宁木霉与米根霉混合发酵产纤维素酶的方法，但两株菌生长条件不尽相同，且米根霉比康宁木霉生长速度快，很容易导致混合培养过程中米根霉优势生长，这种情况反而使滤纸酶活力下降，因此需要严格控制培养方式与条件，两株菌需要分阶段接种，操作较复杂，且在发酵后期两株菌同时存在时也避免不了营养竞争等问题；cn102154243a利用绿色木霉和黑曲霉混合发酵虽然可提高β-葡萄糖苷酶活力，但同样存在相同的问题；高星星等利用里氏木霉与黑曲霉混合发酵，除了由于生长条件不尽相同而存在一定的拮抗作用外，黑曲霉的添加改变了发酵体系的ph值，不利于里氏木霉产纤维素酶，导致混合发酵的滤纸酶活比单一里氏木霉还低(食品科学,2012,33(19):193-198)。针对以上不足，本发明提供了一种新的混合发酵方法，采用两株里氏木霉混合发酵进行产酶，两株菌生长条件相同，操作简便。
在糠醛生产过程中，伴有大量糠醛废渣产生，每吨糠醛产品排出10吨以上残渣，我国每年排放糠醛废渣约几千万吨，给环境和企业带来很大压力。糠醛渣中含有大量高附加值的纤维素，如对其进行酶解糖化处理使其糖化可以变废为宝，产生重大的经济效益。糠醛的生产大多采用弱酸水解法，在分离了大部分半纤维素的同时，原料原有的纤维素与半纤维素、木素之间的复杂网状结构遭到一定程度的破坏，可省去复杂的植物纤维原料预处理过程，为利用糠醛渣纤维素生物转化提供了有利条件。本发明选用资源丰富、结构特殊的糠醛渣作为纤维素原料发酵产纤维素酶，具有经济和环保的双重效益。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法。
本发明所述生产菌种为里氏木霉(trichodermareesei)cicc13052和cicc40360，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection，cicc)。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的：
一种利用混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法，该方法是将里氏木霉(trichodermareesei)cicc13052和cicc40360在以糠醛渣为诱导碳源的产酶培养基中混合发酵生产纤维素酶。
本发明的利用混菌发酵糠醛渣生产纤维素酶的方法，优选的技术方案包括如下步骤：
(1)将购买的里氏木霉(trichodermareesei)cicc13052和cicc40360冻干菌粉用斜面活化培养基进行活化：将涂布有上述菌株的斜面试管于28℃下静置培养5-7天，直至长出孢子，之后用同样方法进行传代培养活化(由于菌种经过冻干保藏后处于休眠状态，一代菌种需适当延长培养时间，转接至2-3代方可恢复活力)。
(2)将活化的里氏木霉(trichodermareesei)cicc13052和cicc40360斜面分别加入适量无菌生理盐水，混匀2min，制备成浓度为1×106-7个/ml的孢子悬液。将孢子悬液以5％的接种量接种于新鲜的种子培养基中，在28℃、180rpm下摇床培养24～48h，分别得所述两种菌的种子培养液；
(3)将两种菌的混合种子培养液按1～10％的体积比接种至产酶培养基中，在28℃、180rpm的条件下进行发酵产酶。
其中所述混合种子培养液中cicc40360和cicc13052的接种比例为1～10:10～1。
进一步地，优选比例为1:3。
进一步地，混合发酵的糠醛渣起始浓度为20～200g/l，优选为100g/l。
上述利用混菌发酵糠醛渣生产纤维素酶的方法中所采用的培养基如下：
活化培养基：马铃薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，ph自然。
种子培养基：微晶纤维素10g，葡萄糖10g，尿素0.3g，kh2po42.0g，(nh4)2so41.4g，mgso4-7h2o0.3g，蛋白胨0.75g，酵母粉0.25g，cacl2-2h2o0.4g，水1l，微量元素:cocl20.002g，znso4-7h2o0.0014g，mns04-7h2o0.0016g，fes04-7h2o0.005g。
产酶培养基：玉米秸秆糠醛渣20-200g，尿素0.3g，kh2po42.0g，(nh4)2so41.4g，mgso4-7h2o0.3g，蛋白胨0.75g，酵母粉0.25g，cacl2-2h2o0.4g，水1l，微量元素:cocl20.002g，znso4-7h2o0.0014g，mns04-7h2o0.0016g，fes04-7h2o0.005g。
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)工业糠醛废渣资源量大、价格低廉，含有丰富的纤维素，其纤维素聚合度较低且结构松散，是制备纤维素生物转化的优选原料。本发明以玉米秸秆糠醛渣为原料，既节约了成本，也解决了环境问题，在开发利用秸秆等天然纤维素资源的同时，无环境污染，是促进秸秆乙醇产业化的有效手段。
(2)混菌发酵具有比单一菌种发酵更高的纤维素利用率和产酶效率。
(3)混菌发酵耐受底物浓度高，可耐受200g/l玉米秸秆糠醛渣。
(4)本发明中混菌所包含的单菌均为好氧真菌-里氏木霉，其生长条件相同，便于共培养。
本发明方法解决了糠醛渣利用的难题，提高了纤维素酶生产效率，成本低，工艺简单，环境友好，适宜工业化应用，具有良好的经济和社会效益，是一种具有工业应用前景的生产纤维素酶的方法。
附图说明
图1混菌利用糠醛渣发酵产酶情况；
图2里氏木霉cicc40360利用糠醛渣发酵产酶情况；
图3里氏木霉cicc13052利用糠醛渣发酵产酶情况；
图4底物浓度对混菌发酵产酶的影响；
图5不同初始ph对混菌发酵产酶的影响；
图6不同接种量对混菌发酵产酶的影响；
图7不同接种比例对混菌发酵产酶的影响；
图8不同辅助诱导物对混菌发酵产酶的影响。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
1.微生物培养和发酵：
菌种活化：将购买的菌株用斜面活化培养基进行活化，将涂布有菌液的斜面试管于28℃下静置培养5-7天，直至长出孢子，之后用同样方法进行传代培养2-3代获得活化菌株。
种子培养：将装有20ml种子培养基的100ml三角瓶用棉塞和瓶口膜封口，于115℃下灭菌20分钟，冷却后接入所述斜面微生物的孢子悬液，于28℃、180rpm摇床中培养24-48h，获得种子培养液。
发酵产酶：将培养的种子培养液以1～10％的接种量转入含有20ml产酶培养基的100ml揺瓶中，28℃、180rpm摇床中培养3-11d，定时取样测定酶活。
2.分析方法：采用国际理论与应用化学联合会(iupac)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活。
实施例1
混菌发酵产纤维素酶
分别活化斜面保藏的里氏木霉cicc13052和cicc40360，以5％接种量分别从孢子悬液转接至种子培养液于28℃、180rpm的摇床上震荡培养24-48h。再以接种比例1:1、总接种量为5％转接到含有50g/l糠醛渣的产酶培养基中，定时取样测定酶活。结果如图1所示，混菌在以50g/l玉米秸秆糠醛渣为诱导碳源时，其纤维素酶酶活可达0.82fpu/ml。
对比例1
单菌cicc40360发酵产纤维素酶
活化斜面保藏的里氏木霉cicc40360，以5％接种量从孢子悬液转接至种子培养液中于28℃、180rpm的摇床上震荡培养24-48h。再以5％的接种量转接到含有50g/l糠醛渣的产酶培养基中，定时取样测定酶活，结果如图2所示，里氏木霉cicc40360在以50g/l玉米秸秆糠醛渣为诱导碳源时，其纤维素酶酶活仅为0.47fpu/ml，比混菌发酵低42.68％。
对比例2
单菌cicc13052发酵产纤维素酶
按照对比例1所述的方法，将里氏木霉cicc13052接到含有50g/l糠醛渣的产酶培养基中进行发酵，定时取样测定酶活。结果如图3所示，从图中可以看出，cicc13052在以50g/l玉米秸秆糠醛渣为诱导碳源时，其纤维素酶活可达0.67fpu/ml，高于cicc40360，比混菌发酵低18.29％。
实施例2
不同底物浓度对混菌发酵产酶的影响
按照实施例1所述方法，将混菌以接种比例1:1、总接种量为5％转接到不同糠醛渣浓度的产酶培养基中，定时取样测定酶活，探索其最优碳源含量及产酶情况。结果如图4所示，由图可知，混菌具有较好的底物耐受力，即使在200g/l糠醛渣浓度下亦可以发酵产酶，在以100g/l糠醛渣为诱导碳源时，其纤维素酶活最大可达0.87fpu/ml，因此后续试验底物浓度优选100g/l。
实施例3
不同初始ph对混菌发酵产酶的影响
培养基的ph与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切，在发酵过程中，随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的ph往往会发生变化，因此本实验仅控制了初始ph。
按照实施例2所述方法，将混菌以接种比例1:1、总接种量为5％转接到初始ph为2.80、4.32、4.80、6.00、7.00、8.00的含有100g/l糠醛渣的产酶培养基中进行发酵，定时取样测定酶活，观察初始ph对混菌发酵产酶的影响，探索其最优初始ph及产酶情况。结果如图5所示，里氏木霉混菌在不同初始ph条件下发酵产纤维素酶情况差别较大，纤维素酶形成于偏酸环境下，但是ph过低(ph＝2.8)不利于纤维素酶的形成，而在中性偏碱条件(ph＝7、8)下纤维素酶的形成也处于劣势，可见ph过低或过高纤维素酶的产生均会受影响。由实验数据可知，纤维素酶形成的初始ph优选ph4.8，比优化前缩短了产酶时间，产酶高峰在7d可达0.91fpu/ml，比cicc13052单菌发酵提前3天，比cicc40360单菌发酵提前2天，且酶活提高。
实施例4
不同接种量对混菌发酵产酶的影响
按照实施例3所述方法，以接种比例为1:1、总接种量为1％、2.5％、5％、8％、10％，分别从种子液中转接至初始ph为4.8的产酶培养基中进行发酵产酶，定时取样测定酶活，探索其最优接种量。
不同接种量对混菌发酵产酶的影响如图6所示，混菌在不同接种量条件下发酵产纤维素酶的情况差别较大。接种量过小，菌体浓度不足，纤维素酶的产生受阻碍；接种量过大，菌体浓度过高，溶氧不充分，且底物营养缺乏，纤维素酶的形成也受到抑制，由实验数据可知，优选5％的接种量。
实施例5
不同接种比例对混菌发酵产酶的影响
接种比例在混菌发酵中是一个很重要的参数。按照实施例4所述方法，以总接种量为5％、接种比例分别为cicc40360：cicc13052＝1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、1:4、4:1、1:5、5:1的方法从种子液接种至初始ph为4.8的产酶培养基中进行发酵，定时取样测定酶活，探索其最优接种比例。不同接种比例对混菌发酵产酶的影响如图7所示，随着cicc40360所占比例增加，混菌产生的酶活性较低，随着cicc13052所占比例增加，酶活性有所增加。其中，cicc40360:cicc13052＝1:3产酶较高(0.98fpu/ml)、较快且酶活性较稳定，有利于工业生产。因此优选接种比例为cicc40360:cicc13052＝1:3。
实施例6
不同辅助诱导物对混菌发酵产纤维素酶的影响
纤维素酶是复合诱导酶，因此设计了在以糠醛渣为诱导碳源的基础上添加不同辅助诱导物的实验。
按照实施例5所述方法，将培养的cicc40360、cicc13052种子液按照接种比例为cicc40360:cicc13052＝1:3、接种量为5％，分别接种至含有不同诱导物的初始ph为4.8的产酶培养基中进行发酵产酶培养，每隔一定时间进行取样检测滤纸酶活，观察不同诱导物对菌株发酵产酶的影响。
其中，ck组为不添加辅助诱导物的碳源为100g/l糠醛渣的对照，试验组为在ck组的基础上分别添加0.5％的葡萄糖、乳糖、木糖、纤维二糖、微晶纤维素(mcc)、羧甲基纤维素钠(cmc)。
试验结果如图8所示，与ck相比，各辅助诱导物并没有起到正诱导作用，说明玉米秸秆糠醛渣可独自诱导混菌产纤维素酶，无需添加其他辅助诱导物，进而节省了产酶成本，利于工业生产。